Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene En vivo Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

El objetivo de este procedimiento es adquirir imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo de colonias de E. coli en crecimiento, expresando construcciones de copista para identificar el número de moléculas de proteína recién producidas. Esto se logra preparando primero una muestra de células, coex que expresa una proteína de interés fusionada con un reportero fluorescente de Cora, y una proteasa que se escinde específicamente entre el reportero de Cora y la proteína de interés. El segundo paso es preparar un gel de Aris a baja temperatura de fusión hecho con medios mínimos M nine.

A continuación, se prepara una almohadilla de gel AROS para su uso con una cámara de muestras con temperatura controlada. Las células de E. coli se colocan en el gel y se ensambla la cámara. El paso final es colocar la cámara en un microscopio de fluorescencia y obtener imágenes de varias colonias celulares en crecimiento a intervalos regulares durante varias generaciones.

El fotoblanqueo de moléculas de informe TRE recién producidas en cada intervalo de todos los re finalmente se utiliza para adquirir trazas de tiempo de la producción de proteínas en células vivas con resolución de una sola molécula y una sola célula. La ventaja de esta técnica sobre las mediciones de una sola célula mediante fusión de proteínas de fluorescencia es que la producción de cualquier cáncer de moléculas de proteínas se puede seguir con el procedimiento de una sola molécula y el resultado que afecta a las funciones de las moléculas. Diseñar las secuencias de inserción de cepa, codificando una secuencia de localización de membrana, una proteína fluorescente de maduración rápida y una secuencia de reconocimiento de proteasa y terminal hacia y en el marco con una proteína de interés en este caso específico, un factor de transcripción o tf.

En este procedimiento, se utilizó el reportero venoso TSR dirigido a la membrana. El reportero se fusionó con la secuencia de reconocimiento de proteasa ubiquitina para contar el número de bacterias expresadas en el fago Lambda Repressor, moléculas de proteína C one. Después de incorporar el constructo en el cromosoma e-coli, el plásmido que codifica la proteasa específica de la secuencia de reconocimiento se transforma en una cepa que expresa el reportero fluorescente y la proteína de interés en la fusión traduccional.

En este protocolo, se utilizó la proteasa ubiquitina carboxila Hydro one, que se escinde inmediatamente después del residuo de ubiquitina terminal C. Para comenzar este protocolo, elija una colonia de E. coli de una placa de agar recién rayada en un mililitro M nueve, medio mínimo suplementado con un x mínimo de aminoácidos esenciales y antibióticos apropiados. Incubar un agitador a la temperatura deseada el tiempo suficiente para alcanzar una densidad óptica de 600 nanómetros o un diámetro exterior de 600 superior a 1,0.

A continuación, diluir el cultivo en un mililitro de medio M nine fresco con antibióticos apropiados hasta una DO 600 de 0,02. Al incubar un agitador a la temperatura adecuada, la densidad celular inicial se puede aumentar si es necesario para el crecimiento a baja temperatura. Cuando el diámetro exterior de 600 sea igual a 0,2 a 0,3, comience a preparar la almohadilla de gel ARO pesando de 10 a 20 miligramos de aros a baja temperatura de fusión en un microtubo de 1,5 mililitros.

Añadir el volumen adecuado M nueve, medio mínimo sin antibióticos para hacer una solución de 3%surgido. Luego caliente la solución rosada durante 30 minutos a 70 grados centígrados para que se derrita. Invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté completamente derretida y sea homogénea.

Para el montaje de la almohadilla de gel, enjuague un cubreobjetos previamente limpiado y un portaobjetos de microacueducto con agua estéril. Seque el cubreobjetos y deslícelo soplando con aire comprimido. Coloque la junta de goma en la corredera del microacueducto de modo que cubra las entradas y salidas.

En el lado de vidrio del portaobjetos, aplique 50 microlitros de solución ARO en el centro del microacueducto. Deslice la parte superior de la solución ARO con la cubierta de vidrio seca limpia. Deje reposar la solución agrícola a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Cuando las células alcanzan un OD 600 de 0,3 a 0,4, están listas para la obtención de imágenes. Transfiera un mililitro de cultivo incubado a una centrífuga de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a 10.000 veces G durante un minuto en una microcentrífuga de sobremesa. Después de desechar el agente SUP, agregue un mililitro de M nine medium fresco y resus.

Suspenda el pellet y centrifugue suavemente la suspensión nuevamente a 10, 000 veces G durante un minuto. Luego repita el paso de centrifugación resus una vez más, vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de medio M nine. En este punto, las células se pueden usar para imágenes de microscopio o diluidas de 10 a 100 veces para garantizar densidades de celdas bajas para imágenes de lapso de tiempo.

Para preparar una muestra para la obtención de imágenes, retire con cuidado el cubreobjetos de la parte superior de la almohadilla de gel. Agregue un microlitro de cultivo celular lavado en la parte superior de la almohadilla de gel. Espere aproximadamente dos minutos para que la almohadilla de gel absorba el cultivo.

Es importante no esperar tanto tiempo para que la almohadilla de gel se seque demasiado. El tiempo ideal variará con la temperatura y la humedad mientras se espera que se seque. Otra cubierta de vidrio pre-limpiada.

Una vez que la muestra esté seca, cubra la muestra con el nuevo cubreobjetos asegurándose de que el cubreobjetos y el portaobjetos del microacueducto estén bien alineados. Ensamble la cámara de crecimiento con control de temperatura siguiendo las instrucciones del fabricante. Ahora se puede utilizar para obtener imágenes en el microscopio.

Para comenzar a tomar imágenes, encienda el láser y el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante. Bloquee la cámara ensamblada en el inserto de la platina en el microscopio. Ajuste la temperatura de la cámara de crecimiento y el calentador del objetivo a 37 grados Celsius u otra temperatura de crecimiento deseada.

Si se toman imágenes por encima de la temperatura ambiente, el enfoque o el relleno de gel generalmente se desviarán significativamente durante aproximadamente 15 minutos después del cambio de temperatura inicial. En la práctica. Utilice este tiempo para buscar regiones de interés y modificar los scripts de imágenes según sea necesario.

Para un experimento. Ajuste la intensidad de la excitación del láser para que casi todas las moléculas fluorescentes fotoblanqueen dentro de seis exposiciones. Encuentre células en el microscopio y céntrelas dentro de una región de imagen predefinida y alineada.

A continuación, almacene la posición de cada celda, se puede crear una imagen de más de una célula en cada imagen. La ventana de tiempo de adquisición para la obtención de imágenes de lapso de tiempo a lo largo de muchas generaciones garantiza que las células de la imagen se separen inicialmente de otras células, pero al menos unos pocos cientos de micras para que otras colonias no ingresen a la región de imágenes durante el crecimiento. Utilizando un script de imagen automatizado, adquiera datos de lapso de tiempo utilizando el algoritmo descrito en este flujo de trabajo experimental, que se puede encontrar en el protocolo de texto que acompaña a este video.

Estas imágenes muestran datos típicos de lapso de tiempo de un experimento de pista de código. Las imágenes de una sola colonia se muestran a intervalos de 25 minutos. En este experimento, se adquirieron datos cada cinco minutos de 12 colonias diferentes.

Estas imágenes representan imágenes de campo claro e imágenes de fluorescencia YFP de Venus con el fondo promedio restado para tener en cuenta el cambio en el fondo de todo el campo de imagen. Con el tiempo, cuando las imágenes se superponen, revelan la localización de los polos de las moléculas reporteras venosas TSR UB y la heterogeneidad en el número de moléculas producidas en ventanas de tiempo de cinco minutos en diferentes células. Aquí se muestran datos típicos de un solo punto de tiempo en un experimento de seguimiento de código: imágenes de fluorescencia venosa de seis exposiciones de 100 milisegundos que se adquirieron al comienzo de cada intervalo de tiempo de cinco minutos.

Cada una de las seis exposiciones se separó por 900 milisegundos para dar tiempo a que las moléculas venosas transitoriamente oscuras que habían parpadeado se volvieran fluorescentes para el análisis. La imagen seis se resta de la imagen uno para corregir las moléculas sin blanquear y la autofluorescencia. Las manchas de fondo en esta imagen se localizan en linajes celulares específicos y se cuantifican por su intensidad de fluorescencia integrada.

A continuación, se traza la fluorescencia integrada media de la colonia en seis imágenes, ajustando esta línea a un decaimiento exponencial. Además, un desplazamiento constante da un medio tiempo de decaimiento de aproximadamente un segundo. En este experimento, las moléculas venosas fotoblanquean mucho más rápido que la autofluorescencia celular.

Por lo tanto, aproximadamente la mitad del número total de moléculas venosas se fotoblanquean en cada fotograma. Para este procedimiento, el análisis de imágenes de conductividad se puede realizar en otros para crear trices del número de moléculas de proteína producidas en células individuales.