Name: Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene En vivo Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende el método CoTrAC para visualizar la producción de proteínas en células de E. coli vivas con precisión de molécula única mediante microscopía de fluorescencia. Esta técnica no invasiva permite estudiar la dinámica de factores de transcripción.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El plásmido que expresa pCG001 UBP1 fue proporcionado amablemente por Rohan Baker en la Escuela John Curtin de Investigación Médica. Este trabajo fue financiado por March of Dimes Beca de Investigación 1-el año fiscal 2011, March of Dimes Premio Basil O&#39;Connor Starter Académico de Investigación # 5-FY20 y adjudicación NSF CARRERA 0.746.796.

1. Strain Engineering Workflow <ol><li> Inserto que codifica secuencias de (a) una secuencia de localización de membrana, (b) una proteína fluorescente de maduración rápida y (c) una secuencia de reconocimiento de la proteasa N-terminal a y en marco con una proteína de interés (por ejemplo, un factor de transcripción). Se utilizó la membrana dirigida TSR-Venus reportero 2 y fusionado a la secuencia de reconocimiento de la proteasa ubiquitina (Ub) para contar el número de expresadas bacteriófago λ represor CI moléculas de proteína. Los detalles sobre cómo se construyó la proteína de fusión TSR-Venus-Ub-CI, en sustitución de la de tipo salvaje CI región de codificación y la incorporación del constructo en la E. coli cromosoma utilizando λ recombinación Red 3, se describen en detalle en la ref. 1. </li><li> Verifique que todas las modificaciones de la secuencia. </li><li> Transformar un plásmido que codifica una proteasa específica para la secuencia de reconocimiento utilizado anteriormente en una cepa que expresa el indicador fluorescente y proteína de interésen fusión traduccional. Se utilizó la proteasa UBP1, que escinde inmediatamente después de que el residuo C-terminal de ubiquitina 4. </li></ol> 2. Las células de cultivo y preparar la Muestra <ol><li> Elija una E. colonia coli de interés a partir de una placa de agar recién rayada en 1 ml mínimo M9 suplementado con 5 medios 1X MEM aminoácidos ácidos y los antibióticos apropiados. Incubar en un agitador a temperatura deseada lo suficientemente largo para llegar a OD 600&gt; 1,0 (densidad óptica a 600 nm). </li><li> Se diluye la cultura en 1 ml de medio fresco M9 con los antibióticos apropiados a OD 600 = 0,02. Incubar en un agitador a temperatura apropiada. Densidad celular inicial se puede aumentar si es necesario para el crecimiento a baja temperatura. </li><li> Cuando la DO 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C con un cultivo de células inicial a una DO 600 = 0,02, esto llevará hr 3-4), comenzar a preparar el gel de agarosa almohadilla (paso 3). </li><li> Las células están listas para la formación de imágenes cuando OD <sub&gt; 600 = 0.3-0.4. </li><li> Se transfiere 1 ml de cultivo se incubaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 10.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga de sobremesa. </li><li> Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio fresco M9 y resuspender el pellet suavemente. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Repita los pasos 1,6 y 1,7. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Suavemente resuspender en 1 ml de medio M9. Las células se pueden usar directamente para imágenes de microscopio o diluida 10 - a 100-veces para asegurar bajas densidades celulares para formación de imágenes timelapse. Tenga en cuenta que las bajas densidades celulares son importantes para la formación de imágenes timelapse extendida. La cámara de formación de imágenes (paso 4) se sella durante el experimento. Debido al crecimiento exponencial de las células, las altas concentraciones de células iniciales puede reducir significativamente el oxígeno dentro de la cámara después de un crecimiento prolongado en la almohadilla de gel, reduciendo la maduración de la proteína fluorescente y afectando el crecimiento celular. </li></ol> 3. Preparar la solución de agarosa <ol><li> Pesar 10-20 mgbaja temperatura de fusión de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir un volumen apropiado medio mínimo M9 sin antibióticos para hacer una solución al 3% de agarosa. </li><li> Se calienta la solución de agarosa durante 30 min a 70 º C para fundir, invirtiendo el tubo para asegurar que la solución está completamente fundida y homogénea. La almohadilla de gel se puede verter en este punto (paso 4) o la temperatura puede disminuirse a 50 ° C y se mantuvo durante varias horas para su uso posterior. </li></ol> 4. Preparar Pad Gel en la Cámara <ol><li> Cerca de 50 minutos antes de la proyección de imagen, una diapositiva Microaqueduct enjuague con agua. </li><li> Enjuagarse limpiar vidrio de cubierta (usando un método de limpieza rigurosas tal como el descrito en 6) y Microaqueduct portaobjetos con agua estéril y se seca por soplado con aire comprimido. </li><li> Coloque la junta de goma en la diapositiva Microaqueduct de modo que cubra las entradas y salidas en el lado del cristal de la corredera Microaqueduct (esto se puede modificar para aplicaciones enmedios de comunicación que se perfunde a través de la muestra). Aplicar 50 l solución de agarosa (paso 3) para el centro de la diapositiva Microaqueduct. </li><li> Arriba la solución de agarosa con el limpiado, vidrio de cubierta seca. </li><li> Dejar que la solución de agarosa en reposo a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Mientras tanto, preparar una muestra de células (paso 2). </li><li> Despegue cuidadosamente el vidrio de cubierta de la parte superior de la almohadilla de gel. Añadir 1,0 l cultivo de células lavadas a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min para el cultivo a ser absorbido por la almohadilla de gel. Es importante no esperar tanto tiempo que los overdries almohadilla de gel, pero lo suficientemente largo que las células están correctamente adherida a la almohadilla de gel. El tiempo de espera Ideal variará con la temperatura y la humedad. </li><li> Mientras espera, secar otra cubierta de vidrio lavadas. </li><li> Cubrir la muestra con la cubierta de vidrio nuevo asegurándose de que la cubierta de vidrio deslizante y Microaqueduct están bien alineados. </li><li> Montar la cámara de temperatura controlada crecimiento siguiendo las instrucciones del fabricante.Se puede utilizar ahora para formación de imágenes en microscopio (paso 5). </li></ol> 5. Imagen y Adquisición de Películas Timelapse <ol><li> Encender el láser y microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante (por ejemplo, el láser puede ser necesario calentar durante ~ 0,5 h antes del experimento). </li><li> Bloqueo de la cámara montada en el inserto de etapa en el microscopio. Establecer la temperatura de la cámara de crecimiento y el calentador objetivo a 37 º C o de otra temperatura deseada crecimiento. </li><li> Si obtención de imágenes por encima de la temperatura ambiente, el enfoque o la almohadilla de gel normalmente se reduciría significativamente durante ~ 15 min después del cambio de temperatura inicial. En la práctica, utilizar este tiempo para encontrar las regiones de interés y modificar los scripts de imagen según sea necesario para un experimento. </li><li> Encontrar las células en el microscopio y almacenar la posición de cada célula después de centrado dentro de una región de formación de imágenes predefinida y alineado. Más de una celda puede ser reflejada en cada ventana de tiempo de adquisición de imagen. Para timelapse imágenes sobre mlas generaciones, asegurar que las células con imagen son inicialmente separadas de otras células por lo menos unos pocos cientos de micras de modo que otras colonias no entrará en la región de formación de imágenes durante el crecimiento. </li><li> Ajuste de la intensidad del láser de excitación para que casi todas las moléculas fotoblanqueador fluorescente dentro de 6 exposiciones (Figura 5). </li><li> Utilización de un script automatizado de imágenes / revista, adquirir datos timelapse utilizando el algoritmo descrito en el flujo de trabajo experimental en la figura 3. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

No tenemos revelaciones.

El método COTRAC puede ser generalizado para medir la producción de otras proteínas en la que N-o C-terminales convencionales fusiones de proteínas fluorescentes pueden perturbar la actividad de proteína. La estrategia COTRAC tiene tres ventajas únicas sobre los métodos actuales. En primer lugar, co-traduccional de fusión asegura que una molécula del indicador fluorescente es producida por cada molécula de la proteína de interés, lo que permite un recuento preciso de la producción de proteínas en tiempo real. En segundo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Agarosa (baja temperatura de fusión) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sales M9 </td><td></td><td></td><td> Siguiente receta descrita en 9 </td></tr><tr><td> 20% de glucosa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × solución de aminoácidos MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura Controlada por el crecimientoCámara Etapa adaptador </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Calentador Objetivo </td><td> Bioptechs </td><td> Modelo depende objetivo de microscopio </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lentes Micro cubierta </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Puede ser difícil de fuente, también disponible a partir de Bioptechs </td></tr><tr><td> Tapa de cristal corredizo / junta </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de Fluorescencia </td><td> Vario </td><td> Ejemplo de configuración: Coherente Innova 308C-ion argón láser, Olympus IX-81 microscopio Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objetivo, Metamorph software </td><td> Debe tener una excitación láser, etapa automatizado xyz, software de automatización capaz de obtener imágenes con guión y autofocus, óptica capaces de resolvinag fluorescentes proteínas individuales </td></tr><tr><td> EM-CCD cámara </td><td> Vario </td><td> Ejemplo de configuración: Andor Ixon DU-898 </td><td> Debe tener ruido suficientemente bajo como para detectar las proteínas fluorescentes individuales por encima de fondo </td></tr></tbody></table>

una sola molécula de imágenes del reglamento gene<em&gt; en vivo</em&gt; utilización de la activación cotraduccional por escisión (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC) a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método hace posible contar el número de moléculas de proteína producida en una célula durante las ventanas secuenciales, el tiempo de cinco minutos. Se requiere un microscopio de fluorescencia con una densidad de potencia del láser de excitación de ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, que es suficientemente sensible para detectar moléculas individuales de proteínas fluorescentes en células vivas. El reportero fluorescente usada en este método se compone de tres partes: una secuencia de dirección de membrana, una maduración rápida, proteína fluorescente amarilla y una secuencia de reconocimiento de proteasa. El reportero está fusionado traduccionalmente al extremo N-terminal de una proteína de interés. Las células se cultivan en una platina de microscopio de temperatura controlada. Cada cinco minutos, moléculas fluorescentes dentro de las células se crean imágenes (y más tarde coUnted mediante el análisis de imágenes de fluorescencia) y posteriormente photobleached modo que las proteínas recién traducido sólo se cuentan en la siguiente medición. Imágenes de fluorescencia resultante de este método se puede analizar mediante la detección de manchas fluorescentes en cada imagen, asignándolos a las células individuales y luego asignar células a linajes celulares. El número de proteínas producidas dentro de una ventana de tiempo en una célula dada se calcula dividiendo la intensidad integrada de fluorescencia de las manchas por la intensidad media de las moléculas fluorescentes individuales. Se utilizó este método para medir los niveles de expresión en el intervalo de 0-45 moléculas individuales en 5 min ventanas de tiempo. Este método nos permitió medir el ruido en la expresión del represor CI λ, y tiene otras muchas aplicaciones potenciales en la biología de sistemas.

Los resultados típicos de un experimento de COTRAC seguimiento de la producción de la CI λ represor se muestran en las Figuras 4 y 5. En este experimento, 12 colonias fueron imágenes a intervalos de 5 min. En cada punto de tiempo, la colonia se autofocused primera y centralizada dentro de la región de formación de imágenes. A continuación, la posición centrada / focalizada y se almacenó una imagen de campo claro fue adquirida. La etapa se transloca luego por ~ 0,5 micras a lo largo del ...

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

El objetivo de este procedimiento es adquirir imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo de colonias de E. coli en crecimiento, expresando construcciones de copista para identificar el número de moléculas de proteína recién producidas. Esto se logra preparando primero una muestra de células, coex que expresa una proteína de interés fusionada con un reportero fluorescente de Cora, y una proteasa que se escinde específicamente entre el reportero de Cora y la proteína de interés. El segundo paso es preparar un gel de Aris a baja temperatura de fusión hecho con medios mínimos M nine.A continuación, se prepara una almohadilla de gel AROS para su uso con una cámara de muestras con temperatura controlada. Las células de E. coli se colocan en el gel y se ensambla la cámara. El paso final es colocar la cámara en un microscopio de fluorescencia y obtener imágenes de varias colonias celulares en crecimiento a intervalos regulares durante varias generaciones.El fotoblanqueo de moléculas de informe TRE recién producidas en cada intervalo de todos los re finalmente se utiliza para adquirir trazas de tiempo de la producción de proteínas en células vivas con resolución de una sola molécula y una sola célula. La ventaja de esta técnica sobre las mediciones de una sola célula mediante fusión de proteínas de fluorescencia es que la producción de cualquier cáncer de moléculas de proteínas se puede seguir con el procedimiento de una sola molécula y el resultado que afecta a las funciones de las moléculas. Diseñar las secuencias de inserción de cepa, codificando una secuencia de localización de membrana, una proteína fluorescente de maduración rápida y una secuencia de reconocimiento de proteasa y terminal hacia y en el marco con una proteína de interés en este caso específico, un factor de transcripción o tf.En este procedimiento, se utilizó el reportero venoso TSR dirigido a la membrana. El reportero se fusionó con la secuencia de reconocimiento de proteasa ubiquitina para contar el número de bacterias expresadas en el fago Lambda Repressor, moléculas de proteína C one. Después de incorporar el constructo en el cromosoma e-coli, el plásmido que codifica la proteasa específica de la secuencia de reconocimiento se transforma en una cepa que expresa el reportero fluorescente y la proteína de interés en la fusión traduccional.En este protocolo, se utilizó la proteasa ubiquitina carboxila Hydro one, que se escinde inmediatamente después del residuo de ubiquitina terminal C. Para comenzar este protocolo, elija una colonia de E. coli de una placa de agar recién rayada en un mililitro M nueve, medio mínimo suplementado con un x mínimo de aminoácidos esenciales y antibióticos apropiados. Incubar un agitador a la temperatura deseada el tiempo suficiente para alcanzar una densidad óptica de 600 nanómetros o un diámetro exterior de 600 superior a 1,0.A continuación, diluir el cultivo en un mililitro de medio M nine fresco con antibióticos apropiados hasta una DO 600 de 0,02. Al incubar un agitador a la temperatura adecuada, la densidad celular inicial se puede aumentar si es necesario para el crecimiento a baja temperatura. Cuando el diámetro exterior de 600 sea igual a 0,2 a 0,3, comience a preparar la almohadilla de gel ARO pesando de 10 a 20 miligramos de aros a baja temperatura de fusión en un microtubo de 1,5 mililitros.Añadir el volumen adecuado M nueve, medio mínimo sin antibióticos para hacer una solución de 3%surgido. Luego caliente la solución rosada durante 30 minutos a 70 grados centígrados para que se derrita. Invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté completamente derretida y sea homogénea.Para el montaje de la almohadilla de gel, enjuague un cubreobjetos previamente limpiado y un portaobjetos de microacueducto con agua estéril. Seque el cubreobjetos y deslícelo soplando con aire comprimido. Coloque la junta de goma en la corredera del microacueducto de modo que cubra las entradas y salidas.En el lado de vidrio del portaobjetos, aplique 50 microlitros de solución ARO en el centro del microacueducto. Deslice la parte superior de la solución ARO con la cubierta de vidrio seca limpia. Deje reposar la solución agrícola a temperatura ambiente durante 30 minutos.Cuando las células alcanzan un OD 600 de 0,3 a 0,4, están listas para la obtención de imágenes. Transfiera un mililitro de cultivo incubado a una centrífuga de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a 10.000 veces G durante un minuto en una microcentrífuga de sobremesa. Después de desechar el agente SUP, agregue un mililitro de M nine medium fresco y resus.Suspenda el pellet y centrifugue suavemente la suspensión nuevamente a 10, 000 veces G durante un minuto. Luego repita el paso de centrifugación resus una vez más, vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de medio M nine. En este punto, las células se pueden usar para imágenes de microscopio o diluidas de 10 a 100 veces para garantizar densidades de celdas bajas para imágenes de lapso de tiempo.Para preparar una muestra para la obtención de imágenes, retire con cuidado el cubreobjetos de la parte superior de la almohadilla de gel. Agregue un microlitro de cultivo celular lavado en la parte superior de la almohadilla de gel. Espere aproximadamente dos minutos para que la almohadilla de gel absorba el cultivo.Es importante no esperar tanto tiempo para que la almohadilla de gel se seque demasiado. El tiempo ideal variará con la temperatura y la humedad mientras se espera que se seque. Otra cubierta de vidrio pre-limpiada.Una vez que la muestra esté seca, cubra la muestra con el nuevo cubreobjetos asegurándose de que el cubreobjetos y el portaobjetos del microacueducto estén bien alineados. Ensamble la cámara de crecimiento con control de temperatura siguiendo las instrucciones del fabricante. Ahora se puede utilizar para obtener imágenes en el microscopio.Para comenzar a tomar imágenes, encienda el láser y el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante. Bloquee la cámara ensamblada en el inserto de la platina en el microscopio. Ajuste la temperatura de la cámara de crecimiento y el calentador del objetivo a 37 grados Celsius u otra temperatura de crecimiento deseada.Si se toman imágenes por encima de la temperatura ambiente, el enfoque o el relleno de gel generalmente se desviarán significativamente durante aproximadamente 15 minutos después del cambio de temperatura inicial. En la práctica. Utilice este tiempo para buscar regiones de interés y modificar los scripts de imágenes según sea necesario.Para un experimento. Ajuste la intensidad de la excitación del láser para que casi todas las moléculas fluorescentes fotoblanqueen dentro de seis exposiciones. Encuentre células en el microscopio y céntrelas dentro de una región de imagen predefinida y alineada.A continuación, almacene la posición de cada celda, se puede crear una imagen de más de una célula en cada imagen. La ventana de tiempo de adquisición para la obtención de imágenes de lapso de tiempo a lo largo de muchas generaciones garantiza que las células de la imagen se separen inicialmente de otras células, pero al menos unos pocos cientos de micras para que otras colonias no ingresen a la región de imágenes durante el crecimiento. Utilizando un script de imagen automatizado, adquiera datos de lapso de tiempo utilizando el algoritmo descrito en este flujo de trabajo experimental, que se puede encontrar en el protocolo de texto que acompaña a este video.Estas imágenes muestran datos típicos de lapso de tiempo de un experimento de pista de código. Las imágenes de una sola colonia se muestran a intervalos de 25 minutos. En este experimento, se adquirieron datos cada cinco minutos de 12 colonias diferentes.Estas imágenes representan imágenes de campo claro e imágenes de fluorescencia YFP de Venus con el fondo promedio restado para tener en cuenta el cambio en el fondo de todo el campo de imagen. Con el tiempo, cuando las imágenes se superponen, revelan la localización de los polos de las moléculas reporteras venosas TSR UB y la heterogeneidad en el número de moléculas producidas en ventanas de tiempo de cinco minutos en diferentes células. Aquí se muestran datos típicos de un solo punto de tiempo en un experimento de seguimiento de código: imágenes de fluorescencia venosa de seis exposiciones de 100 milisegundos que se adquirieron al comienzo de cada intervalo de tiempo de cinco minutos.Cada una de las seis exposiciones se separó por 900 milisegundos para dar tiempo a que las moléculas venosas transitoriamente oscuras que habían parpadeado se volvieran fluorescentes para el análisis. La imagen seis se resta de la imagen uno para corregir las moléculas sin blanquear y la autofluorescencia. Las manchas de fondo en esta imagen se localizan en linajes celulares específicos y se cuantifican por su intensidad de fluorescencia integrada.A continuación, se traza la fluorescencia integrada media de la colonia en seis imágenes, ajustando esta línea a un decaimiento exponencial. Además, un desplazamiento constante da un medio tiempo de decaimiento de aproximadamente un segundo. En este experimento, las moléculas venosas fotoblanquean mucho más rápido que la autofluorescencia celular.Por lo tanto, aproximadamente la mitad del número total de moléculas venosas se fotoblanquean en cada fotograma. Para este procedimiento, el análisis de imágenes de conductividad se puede realizar en otros para crear trices del número de moléculas de proteína producidas en células individuales.

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo principios y el método de parafina de seccionamiento y contratinción. Este es un procedimiento fácil y rápido para controlar la expresión génica durante el desarrollo que puede aplicarse también a las secciones de tejido, órganos o células cultivadas.

Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la...

Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende el método CoTrAC para visualizar la producción de proteínas en células de E. coli vivas con precisión de molécula única mediante microscopía de fluorescencia. Esta técnica no invasiva permite estudiar la dinámica de factores de transcripción.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene

Explorar más videos