Name: Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a utilizar microscopía PALM para visualizar el anillo FtsZ de E. coli con precisión nanométrica. Este método computacional permite estudiar la división celular bacteriana en células vivas mediante análisis de posiciones moleculares.

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Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Inocular medio LB con una sola colonia de la cepa JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crecer durante la noche en un agitador a 37 ° C. </li><li> Se diluye la cultura 1:1,000 a M9 + mínimos medios de comunicación [sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos y vitaminas MEM] y crecer hasta la fase logarítmica media (OD 600 = 0,2 a 0,3) en presencia de cloranfenicol (150 ug / ml) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Inducir el cultivo con 20 mM IPTG durante 2 horas (véase Nota # 1). </li><li> Pellet cultura en microcentrífuga (8.000 rpm, 1 min) y se resuspenden en un volumen igual de M9 +; repetición. Después de la resuspensión segundo, continuar el crecimiento a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Fijar cultivo inducido con 4% de paraformaldehído en PBS (pH = 7,4) a TA durante 40 min. Pellet cultura y se resuspende en un volumen igual de PBS; repetición. Si las células de imágenes en vivo, vaya fijación, la cultura pellet y resuspender con un volumen igualde M9 - [Las sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos MEM]; repetición. </li><li> Diluir 1:10 cuentas de oro con la cultura resuspendido. Aplique la muestra en la cámara de imagen preparada (ver paso 2.4). </li></ol> [1] Nota: El protocolo de inducción anterior (pasos 1.1-1.3) se ha optimizado para el sistema de expresión de la cepa JB281. Las condiciones detalladas de inducción puede variar para otros sistemas de expresión o proteínas de interés. 2. Asamblea de la Cámara de imágenes <ol><li> Hacer un 3% (w / v) de solución de agarosa en M9 -. Derretir de agarosa a 70 ° C en un bloque de calor de sobremesa durante 40 min. Tienda de agarosa fundida a 50 º C durante un máximo de 5 horas. </li><li> Colocar un portaobjetos limpio microaqueduct en la mitad superior de la cámara de formación de imágenes con los electrodos orientados hacia abajo. Alinee la junta inferior de la diapositiva microaqueduct el fin de cubrir los canales de perfusión. </li><li> Aplicar ~ 50 l de la agarosa fundida al centro del cristaldiapositiva. Inmediatamente encima de la gota de agarosa gel con un cubreobjetos limpio y seco. Permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 30 min. <ol><li> Para limpiar cubreobjetos: organizar cubreobjetos en un soporte de cerámica y sonicar durante 20 min en la rotación de baños de acetona, etanol y KOH 1 M en frascos de vidrio. Repetir el ciclo tres veces, para un total de 9 sonicaciones, seguido de una sonicación sola en dH 2 O. Guarde los cubreobjetos limpios en dH 2 O. fresco Antes de su uso, soplar cubreobjetos secos con aire filtrado. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos, dejando almohadilla de gel en la diapositiva microaqueduct. Añadir inmediatamente 1 l de muestra de cultivo celular (ver paso 1,6) a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min, permitiendo que la solución sea absorbida por la almohadilla de gel. Top almohadilla de gel con un nuevo cubreobjetos limpio y seco. Montar la cámara de formación de imágenes todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Encender el microscopio, cámara y láseres. Abra MetaMorph suaveWare (Molecular Devices). </li><li> Lugar apropiado de excitación / emisión de los filtros en la ruta de formación de imágenes (Figura 1). </li><li> Establecer potencias de láser y la configuración de adquisición en consecuencia. <ol><li> 488-nm láser = 15 mW (ver nota # 2) </li><li> 561-nm láser = 75 mW </li><li> 405-nm láser = 2 mW ± filtro de densidad neutral (Véase la nota n º 3) </li></ol></li><li> Bloqueo de cámara de formación de imágenes en la etapa a través del adaptador etapa complementaria. </li><li> Designar una región de una imagen apropiada (100x100 píxeles) que está homogéneamente iluminado por los tres láseres. </li><li> Identificar un área de la muestra que contiene tanto células como marcadores de referencia (cuentas de oro) en estrecha proximidad, pero no se solapan. </li><li> Centrarse en la superficie de las células más cercanas a la cubreobjetos. Adquirir una imagen de campo claro con 50 ms de tiempo de integración y mover el foco del 0,5 micras en la muestra (Figura 3AI). </li><li> Adquirir conjunto verde imagen de fluorescencia con una excitación de la 488-n<html> m láser utilizando un tiempo de integración 50 ms (Figura 3Aii). </li><li> Adquirir el streaming de vídeo en el canal rojo con iluminación continua de 405-nm y láser 561-nm. Para las células fijas, una tasa de 50 ms trama se utiliza para un total de 20.000 marcos (~ 17 min totales) con la potencia del láser 405-nm en rampa por ~ 10% cada 1.000 marcos (véase la Nota 4). Para las células vivas, una tasa de 10 ms trama se utiliza para un total de 3.000 tramas (~ 30 s en total) a una potencia de láser constante 405-nm. </li><li> Mover el foco de nuevo a la superficie inferior de las células y adquirir otra imagen campo claro como en el paso 3.7. </li></ol> [2] Nota: La intensidad integrada de la fluorescencia verde de una célula es directamente proporcional al número total de FtsZ-mEos2 moléculas expresadas en la célula. La potencia de excitación de 488-nm y la configuración del conjunto de adquisición de fluorescencia se debe mantener constante para todas las células de modo que la relación FtsZ-mEos2 niveles de expresión en células diferentes se pueden comparar. ONTENIDO &quot;&gt; [3] Nota:. Las células fijadas se crean imágenes con la densidad neutra (ND) del filtro (Figura 1, los componentes ópticos # 5) en su lugar a fin de lograr una tasa de activación lenta de modo que cada molécula individual puede ser identificado con precisión los ND filtro es retirado cuando la imagen en vivo células para aumentar la tasa de activación, mientras que el mantenimiento de una baja probabilidad de dos moléculas que se activan simultáneamente en una zona de difracción limitada. El ritmo más rápido aplicado a imagen de células vivas se necesita para disminuir el tiempo total de adquisición, así &quot;congelar&quot; el anillo Z en el tiempo y limitar el efecto de fotodaño a la célula. [4] Nota: Los números de tramas adquiridas fueron optimizados para nuestro sistema y dependen de la estructura celular particular, etiquetado densidad, velocidad de activación y si agotar toda la piscina de fluoróforos es importante para el análisis. En las células vivas, es importante para obtener un número suficiente de localizaciones en un período tan corto de time como sea posible para evitar la borrosidad de la imagen provocada por el movimiento de la estructura celular. 4. PALM construcción de la imagen <ol><li> Determinar la posición del centroide de cada punto detectado. <ol><li> Cargue la pila de imágenes en Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Recortar la pila en la imagen para una región alrededor de una célula que excluye todas las cuentas fiduciarias. </li><li> Seleccione un umbral de intensidad para la detección de punto que está por encima del nivel de fondo, pero por debajo del punto medio de la intensidad. Nos cuenta de la variación en el nivel de fondo a lo largo de un experimento mediante el cálculo de la media móvil de la intensidad máxima utilizando una ventana de marco 150. El umbral de intensidad para cada trama se interpola a partir de los valores medios de funcionamiento. </li><li> Restar el valor umbral respectivo de cada trama. Puntos potenciales se identifican como tres píxeles adyacentes con intensidades por encima del umbral. </li><li> Ajustar la intensidad de la fluorescencia de cada mancha prospectivo a un Gaussia de dos dimensionesfunción de n [Ecuación # 1] usando un algoritmo de mínimos cuadrados no lineal (Figura 2). La precisión de la localización de cada punto se calcula usando el número total de fotones detectados [Ecuación # 2]. Cualquier mancha mal ajuste con una precisión de localización superior a 20 nm (células fijas) o 45 nm (células vivas) se descarta (véase la Nota 5). Cualquier punto con una intensidad mayor que dos veces de la media de intensidad, posiblemente debido a la superposición de emisores, también se descarta. </li><li> Para las células fijas, eliminar observaciones repetidas de la misma molécula haciendo caso omiso de cualquier lugar cuyo centro de gravedad es la posición dentro de los 45 nm de cualquier otro lugar que lo precedió por 6 cuadros o menos. Para las células vivas, todas las manchas se conservan. </li></ol></li><li> Calibrar la deriva de la muestra utilizando el movimiento marcador de referencia. <ol><li> Cultivos a cabo una región de 10x10 píxeles alrededor de un marcador de referencia. </li><li> Restar el valor umbral respectivo determinado en 4.1.3 a partir de cada trama. </li><li> Montar el perfil de intensidad en cadabastidor a través de los mínimos cuadrados algoritmo de ajuste asumiendo una forma gaussiana bidimensional. </li><li> Calcular el desplazamiento entre las posiciones del centroide con respecto al bastidor 1. </li></ol></li><li> Corregir la posición del centroide de cada molécula único identificado en 4.1, con la deriva de la muestra, calculada en 4,2. Compare las imágenes de campo claro adquiridos en 3,7 y 3,10. Si se observan células para moverse con relación a los marcadores de referencia, los datos se lanza hacia fuera. </li><li> Superponer todas las posiciones corregidas centroide sobre una única imagen compuesta de píxeles 15x15 nm. Trace cada molécula única como una unidad de área, de dos dimensiones perfil gausiano centrado en la posición centroide con una desviación estándar igual a la precisión de localización [Ecuación # 2]. Esto da lugar a un mapa de densidad de probabilidad, en donde la intensidad de un píxel es proporcional a la probabilidad de encontrar una molécula de dicho píxel (Figura 3Aiv). </li><li> Comparación de imágenes PALM las imágenes del conjunto. <ol><li> REPLOT el centroposiciones de ID como en 4.4, pero en un plano con 150x150 píxeles nm y una desviación estándar igual a 250 nm. Esto genera una imagen de la palma que imita una imagen de difracción limitada, que puede ser usado para comparar con la imagen de conjunto de difracción limitada, adquirido en 3,8 (Figura 3Aiii). </li><li> Para confirmar que las moléculas detectadas son representativos de toda la población, comparar la imagen reconstruida conjunto (Figura 3Aiii, paso 4.5.1) con la imagen de fluorescencia conjunto experimental (Figura 3Aii, paso 3,8) para confirmar que ambas imágenes muestran estructuras de forma similar , la orientación y la intensidad relativa. </li></ol></li></ol> [5] Nota: La precisión de localización mínimo requerido se determina empíricamente para cada método de formación de imágenes mediante el trazado de las precisiones de todas las moléculas de una muestra dada y la selección de un punto de corte apropiado. 5. PALM Análisis de Imágenes <ol><li> Medición Z-Ring width y diámetro. <ol><li> Girar la imagen de la palma a fin de orientar verticalmente el eje longitudinal de la célula (Figura 4A). </li><li> Crop fuera de la región celular que contiene el anillo Z. </li><li> Calcular la intensidad acumulativa mediante la proyección de un perfil de intensidad a lo largo del eje largo de la célula. </li><li> Montar el perfil de intensidad a una distribución gaussiana. La anchura del anillo se define como la anchura máxima de medio completo (FWHM) de la distribución gaussiana de módulos (Figura 4B). </li><li> Proyectar el perfil de intensidad acumulativa de 5.1.2 a lo largo del eje corto de la célula. El diámetro del anillo se define como la longitud total del perfil de intensidad (Figura 4C). </li></ol></li><li> Trazado Densidad FtsZ (ver Nota 6). <ol><li> REPLOT las posiciones del centroide como en (4,4), pero sin el perfil gaussiano de tal manera que cada molécula única se le da un valor de 1 y se asigna a un único píxel correspondiente a su posición centroide. De esta manera, la intensidad de cada unopíxel representa el número total de moléculas detectadas en ese píxel. La imagen de la palma de densidad también se puede visualizar como un gráfico de contorno (Figura 5E). </li></ol></li><li> Determinación de la resolución espacial. <ol><li> Teóricamente-alcanzable resolución espacial: crear un PSF representante para toda la muestra utilizando el promedio precisión determinada la localización de todas las moléculas detectadas y calcular la FWHM (Ecuación 3). </li><li> Resolución espacial logrado experimentalmente: calcular el desplazamiento medio entre observaciones repetidas de la misma molécula. </li></ol></li></ol> [6] Nota: Se utilizó PALM de reflexión interna total (TIR-PALM, Figura 1 y 5) para restringir la activación y la excitación de una capa delgada (~ 200 nm) por encima de la interfaz célula / vidrio. de modo que sólo las moléculas de FtsZ asociados con la membrana más cercana a la cubreobjetos será detectado.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
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<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

PALM imágenes contienen información acerca de los recuentos y las posiciones de moléculas dentro de una célula, permitiendo un análisis detallado de la distribución y la disposición de las moléculas de proteína diana que es difícil de lograr por otros medios. A continuación detallamos las precauciones que se deben tomar para extraer información cuantitativa precisa, manteniendo la relevancia biológica de las imágenes de palma. También explorar la información que puede obtenerse mejor utilizando células vivas vs fijo. Po...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 50 x MEM aminoácidos </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x vitaminas MEM </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46 a 102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> Electrónica Ciencias Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarosa </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 Cuentas Gold nm </td><td> Microesferas-Nanoesferas </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 imagen Cámara </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etapa Adaptador </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Objetivo </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Cámara </td><td> Andor Tecnología </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm láser de zafiro </td><td> Coherente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm láser de Zafiro </td><td> Coherente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm láser CUBE </td><td> Coherente </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

La división celular bacteriana requiere el montaje coordinada de más de diez proteínas esenciales en midcell 1,2. Fundamental en este proceso es la formación de una supraestructura de tipo anillo (anillo Z) por la proteína FtsZ en el plan de división de 3,4. El anillo Z se compone de varios monocatenarios protofilamentos FtsZ, y la comprensión de la disposición de los protofilamentos dentro del anillo Z proporcionará información sobre el mecanismo de anillo Z ensamblaje y su función como un generador de fuerza 5,6. Esta información ha permanecido esquiva debido a las limitaciones actuales en la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía electrónica. Microscopía de fluorescencia convencional es incapaz de proporcionar una imagen de alta resolución de la Z-ring debido al límite de difracción de la luz (~ 200 nm). Electrónica cryotomographic imágenes ha detectado disperso en pequeñas protofilamentos FtsZ C. células crescentus 7, pero es difícil de aplicar a células más grandes, tales comoE. coli o B. subtilis. Aquí se describe la aplicación de un método de microscopía de super-resolución de fluorescencia, microscopía de localización fotoactivado (palma), para caracterizar cuantitativamente la organización estructural de la E. coli Z-anillo 8. PALM imagen ofrece una alta resolución espacial (~ 35 nm) y el etiquetado específico para permitir la identificación inequívoca de proteínas diana. Hemos marcado FtsZ con la mEos2 proteína fluorescente fotoactivable, que cambia de verde de fluorescencia (excitación = 488 nm) al rojo de fluorescencia (excitación = 561 nm) tras la activación a 405 nm 9. Durante un experimento PALM, solo FtsZ-mEos2 moléculas se activan y estocásticamente las posiciones correspondientes centroides de las moléculas individuales se determinan con precisión &lt;20 nm. Una imagen de super-resolución de la Z-ring se reconstruye mediante la superposición de las posiciones del centroide de todos los detectados FtsZ-mEos2 moléculas. &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Usando este método, se encontró que el anillo Z tiene un ancho fijo de ~ 100 nm y se compone de un paquete suelto de protofilamentos FtsZ que se solapan entre sí en tres dimensiones. Estos datos proporcionan una plataforma para futuras investigaciones de los cambios del ciclo celular dependientes de la 10 Z-anillo y se puede aplicar a otras proteínas de interés.

Ilustrado en la Figura 3Aiv es una de dos dimensiones, super-resolución de procesamiento de la Z-ring generado a partir del método de obtención de imágenes PALM descrito anteriormente. A continuación, se resume la información cualitativa y cuantitativa que se puede obtener a partir de ellos. Cualitativamente, se observó que el anillo Z es una estructura irregular que adopta varias configuraciones (banda única o arco helicoidal) que no son distinguibles en las imágenes conven...

Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

El objetivo general del siguiente experimento es obtener información estructural cuantitativa sobre las proteínas de división celular de E. coli en su entorno nativo. Esto se logra mediante la expresión de una proteína de fusión fluorescente fotoactiva en células vivas e inmovilizando estas células en una almohadilla de gel acrobático. A continuación, se obtienen imágenes de las células a través de vídeo en streaming.Mientras que los láseres de excitación y activación se aplican para visualizar ubicaciones de moléculas individuales, las películas resultantes se analizan computacionalmente para extraer las posiciones de las moléculas con precisión nanométrica y superponerlas para generar una imagen de súper resolución. Esta imagen puede ser analizada por una variedad de mediciones cuantitativas que describen la estructura de interés, incluyendo sus dimensiones y densidad de moléculas. La localización fotoactivada, microscopía o palma de la mano es una técnica de microscopía de fluorescencia de súper resolución de fácil implementación.La instrumentación es sencilla, pero se requiere una optimización cuidadosa de la adquisición y el análisis de datos para generar resultados confiables. Otro paso crucial es el grado de caracterización de su proteína de fusión y el nivel de expresión para garantizar que sus resultados sean biológicamente relevantes. El siguiente protocolo fue optimizado para la proteína FTSZ fusionada con Muse dos y debe adaptarse a la proteína de su interés.Para empezar, inocule el medio LB con una sola colonia de la cepa de interés que contenga una proteína fluorescente preparada como se describe en el protocolo escrito. Acompañando este video, cultive durante la noche en una coctelera a 37 grados centígrados al día siguiente. Diluya el cultivo uno a 1000 en M nueve más medios mínimos.Crecer hasta la fase logarítmica media en presencia de un antibiótico adecuado a temperatura ambiente, y luego inducir el cultivo para producir proteína con IPTG de 20 micromolares durante dos horas. Mientras tanto, ensamble la cámara de imágenes haciendo una solución de agro al 3% en medios M nine minus. Derrita los agros a 70 grados centígrados en un bloque de calor de mesa durante 40 minutos.Guarde los agros derretidos a 50 grados centígrados durante un máximo de cinco horas. Coloque un portaobjetos de microacueducto limpio en la mitad superior de la cámara de imágenes con los electrodos hacia abajo. Alinee la junta inferior en el portaobjetos del microacueducto para cubrir los canales de perfusión.Aplica aproximadamente 50 microlitros de los aros derretidos en el centro del vaso. Deslice inmediatamente la parte superior de la gota de gel Agros con un cubreobjetos limpio y seco. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos después de la inducción de proteínas.Granular el cultivo en una micro centrífuga. Resus. Suspender el pellet en un volumen igual de M nueve más la centrifugación repetida y la suspensión de resus después de la segunda suspensión de resus. Continúe el crecimiento a temperatura ambiente durante dos horas.A continuación, fije el cultivo inducido añadiendo aldehído paraforme en PBS para lograr una concentración final del 4% de aldehído paraforme. Si toma imágenes de células vivas, consulte el protocolo escrito que acompaña a este video para conocer las variaciones en el procedimiento, deje que el cultivo se incube a temperatura ambiente durante 40 minutos. Granular el cultivo y volver a suspender en un volumen igual de PBS.A continuación, diluya cuentas de oro de 50 nanómetros, de una a 10 con cultivo resuspendido. Para aplicar la muestra a la cámara de imágenes preparada, retire con cuidado el cubreobjetos, dejando la almohadilla de gel en el portaobjetos del microacueducto. Agregue inmediatamente un microlitro de muestra de cultivo celular en la parte superior de la almohadilla de gel.Espere aproximadamente dos minutos para que la almohadilla de gel absorba la solución y cubra la almohadilla de gel con un nuevo cubreobjetos limpio y seco. Continúe ensamblando toda la cámara de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la adquisición de imágenes. Encienda la cámara del microscopio y los láseres.Software abierto de metamorfosis por dispositivos moleculares. Coloque los filtros de excitación y emisión apropiados en la ruta de la imagen como se muestra en este esquema del microscopio, que se puede encontrar en el procedimiento escrito que acompaña a este video. A continuación, establezca las potencias láser y los ajustes de adquisición.Fije adecuadamente la cámara de imagen en la platina a través del adaptador de platina complementario. Concéntrese en la superficie de las celdas más cercana al labio deslizante de la cubierta. Designe una región de imagen apropiada que sea iluminada homogéneamente por los tres láseres.Identifique un área de muestra que contenga celdas y marcadores de referencia, que son las cuentas de oro que se encuentran muy cerca pero no se superponen. Adquiera una imagen de campo claro con un tiempo de integración de 50 milisegundos y mueva el enfoque 0,5 micrómetros en la muestra. A continuación, adquiera una imagen de fluorescencia verde con excitación del láser de 488 nanómetros utilizando un tiempo de integración de 50 milisegundos.A continuación, adquiera la transmisión de vídeo con iluminación continua de láseres de 405 nanómetros y 561 nanómetros. En el caso de las células fijas, se utiliza una velocidad de fotogramas de 50 milisegundos para un total de 20.000 fotogramas. Con la potencia del láser de 405 nanómetros aumentada en aproximadamente un 10% cada 1000 fotogramas aquí, se muestran los primeros 500 fotogramas.Tenga en cuenta que el número de tramas adquiridas se optimizó para este sistema y depende de la estructura celular particular. El etiquetado, la densidad, la tasa de activación y si se agota o no todo el grupo de pisos es importante para el análisis para realizar la construcción de imágenes. En primer lugar, identifique los puntos prospectivos en el flujo de imágenes como tres píxeles adyacentes con intensidades por encima de un umbral determinado empíricamente que ajustan la intensidad de cada punto prospectivo a una función gaussiana bidimensional.Para identificar la posición de la molécula y el número total de fotones emitidos, calcule la posición de localización de cada punto utilizando el número total de fotones detectados. A continuación, descarte las manchas mal ajustadas aplicando un umbral de precisión de localización y elimine las observaciones repetidas de la misma molécula ignorando cualquier mancha que esté dentro de los 45 nanómetros y seis fotogramas de cualquier punto de procedimiento correcto para la deriva de la muestra. Al restar el desplazamiento dependiente del marco de las cuentas de oro de cada posición de la molécula, se superpusieron todas las posiciones de las moléculas corregidas en una sola imagen compuesta por píxeles de 15 por 15 nanómetros, trazando cada molécula única como un área unitaria, perfil gaussiano bidimensional con una desviación estándar igual a la precisión de la localización.La imagen resultante es un mapa de densidad de probabilidad donde la intensidad de un píxel es proporcional a la probabilidad de encontrar una molécula. En ese Pixel ilustrado. Aquí hay una representación bidimensional de súper resolución del ZR generada a partir del Método de Imágenes de la Palma.Cualitativamente, se observó que el anillo Z es una estructura irregular que adopta múltiples configuraciones, como bandas simples o arcos helicoidales que no se distinguen en las imágenes de fluorescencia convencionales. Observaciones como estas se pueden utilizar para determinar el porcentaje de la población de células que muestra una configuración estructural particular. Las dimensiones de la ZR también se pueden medir desde este gráfico.Se determinó que el ancho del anillo era de 113 nanómetros. Este valor es más ancho que el ancho esperado de un solo protofilamento FDSC, que es de cinco a 10 nanómetros según la microscopía electrónica in vitro. Aquí, el diámetro del anillo se mide como 1050 nanómetros.Este diámetro se puede utilizar para describir cuantitativamente el grado de constricción durante la división celular. Otro enfoque cuantitativo es calcular la densidad de moléculas contando el número de moléculas localizadas dentro de una región definida. Dado que las imágenes de la palma de la mano son proyecciones 2D de objetos 3D, se debe emplear la reflexión interna total o la palma TIR para restringir el plano de detección a un solo lado del anillo Z.Dado que las moléculas trazadas representan un subconjunto de la población total de FDSC, la densidad determinada es un límite inferior de la densidad real. La densidad máxima observada en las imágenes TIR del anillo Z sugiere que algunas secciones contienen protofilamentos superpuestos. Mientras asiste a este procedimiento, es importante monitorear la morfología celular y la tasa de crecimiento para asegurarse de que la expresión de su proteína de fusión no afecte la viabilidad celular.Una vez que se establece este procedimiento para la proteína de interés, se puede usar para probar los cambios estructurales asociados con la progresión del ciclo celular o ampliarse aún más a imágenes de dos colores para comparar las distribuciones faciales de múltiples proteínas.

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Investigación

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Biología

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