Name: Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a cuantificar el daño en el ADN de neuronas del hipocampo mediante el ensayo cometa. Este método sensible utiliza electroforesis y microscopía de fluorescencia para evaluar la integridad del ADN neuronal.

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Este trabajo fue apoyado por el Impact Award del Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fundación de Niños con Cáncer de lucha, y el Ángel de Gabrielle Foundation (para ESY.).

1. Cultivo celular <ol><li> Cultura células neuronales y tratarlos según sea necesario. </li><li> Células cosecha en tubos de 15 ml: medios de aspirado, enjuague con tampón fosfato salino (PBS, calcio y magnesio libre), añadir tripsina, recoger en tubos de 15 ml y neutralizar la tripsina con apropiados medios que contienen suero. </li><li> Girar a 1.000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar medios de comunicación. </li><li> Resuspender las células en PBS. </li><li> Girar a 1.000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar medio y las células se resuspenden en PBS fresco. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro o su contador celular preferido. </li><li> Las muestras de células debe prepararse inmediatamente antes de iniciar el ensayo. </li><li> Todas las muestras deben ser manejados en la oscuridad o bajo luz amarilla para evitar daños en el ADN de la luz ultravioleta. </li></ol> 2. Comet Assay 1. Preparación del portaobjetos <ol><li> Derretir 1% de agarosa (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA, TBE) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer. </li><li> Dip diapositivas en la agarosa fundida y limpie un lado limpiar con un Kimwipe. Permitir que la agarosa se seca al aire a una película transparente. Esto se puede hacer por anticipado y diapositivas se pueden almacenar. </li></ol> 2. Ensayo Cometa Neutral <ol><li> Enfriar la solución de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris base, 1% de sodio lauril sarcosinato, y 1% de Triton X-100, pH 10) a 4 ° C durante al menos 1 h antes de su uso. </li><li> 2.2.2. Derretir 1% de agarosa de bajo punto de fusión (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer. La agarosa necesita ser enfriado a 37 ° C en un baño de agua para evitar la inducción artificial de cola del cometa. Idealmente, la agarosa necesita ser enfriado durante media hora antes de su uso. </li><li> 2.2.3. Diluir la suspensión de células de modo que hay 100.000 células por ml. Combinar la suspensión celular con el bajo punto de fusión de agarosa (a 37 ° C) enuna proporción de 1:10 (v / v), agitar brevemente, e inmediatamente pipetear 50 l sobre el portaobjetos Comet. Use el lado de la punta de la pipeta para difundir la suspensión de células uniformemente sobre el área de la muestra. Cada grupo de tratamiento debería ser al menos por triplicado. </li><li> Place desliza plana en el refrigerador durante 30 min hasta que aparece un círculo en la periferia de la corredera. </li><li> Prechill la solución de lisis y los portaobjetos en esta solución durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C (o en un refrigerador). </li><li> Vierta o aspirar la solución de lisis y añadir tampón de electroforesis 1X neutro (Tris base, ácido bórico, EDTA, 1X TBE). Agregar diapositivas en este tampón durante media hora en el refrigerador. </li><li> Añadir preenfriada buffer 1X Electroforesis Neutral (TBE) en la cámara de electroforesis, coloque los portaobjetos en la bandeja de electroforesis de diapositivas. Alinear las diapositivas de manera que sean equidistantes de electrodos. </li><li> Vierta electroforesis 1X neutral almacenar hasta 0,2 pulgadas por encima de las diapositivas. El exceso de buffer de entreinterferir con la electroforesis. </li><li> Ajuste el voltaje de suministro de energía a 1 V por cm (medido electrodo a electrodo) y una duración de 30 min a 4 ° C (o el cuarto frío) en la oscuridad. </li></ol> 3. Ensayo Cometa Alcalino <ol><li> Enfriar la solución de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris base, 1% de sodio lauril sarcosinato, y 1% de Triton X-100, pH 10) a 4 ° C durante al menos 1 h antes de su uso. </li><li> Derretir 1% de agarosa de bajo punto de fusión (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer. Luego enfriar en un baño de agua a 37 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Combinar las células a 1 x 105 / ml con fundido bajo punto de fusión de agarosa (a 37 ° C) en una proporción de 1:10 (v / v), agitar brevemente, e inmediatamente pipetear 50 l sobre el portaobjetos Comet. Use el lado de la punta de la pipeta para difundir la suspensión de células uniformemente sobre el área de la muestra. Cada grupo de tratamiento debería ser al menos por triplicado. </li><li> Lugar deslizóes plana en el refrigerador durante 30 min hasta que aparece un círculo en la periferia de la corredera. </li><li> Sumergir los portaobjetos en solución de lisis previamente enfriado y salen a 4 ° C durante 1 hora hasta toda la noche en la oscuridad. </li><li> Retirar los portaobjetos de la solución de lisis, drenar los portaobjetos y se lava una vez con tampón de neutralización en frío durante 5 min para eliminar el detergente residual y las sales antes de la etapa de desenrollado alcalino-. </li><li> Colocar los portaobjetos en una cámara de electroforesis en gel de llenado con tampón de electroforesis preenfriada recién hecho (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,&gt; 13 pH) que no exceda de 0,5 cm por encima de diapositivas. Alinear las diapositivas de manera que sean equidistantes de electrodos. </li><li> Vamos diapositivas sentarse en el tampón alcalino durante 30 min en la oscuridad para permitir el desenrollado del ADN y la expresión de álcali responsable daño. </li><li> Ajuste el voltaje de suministro de energía a 1 V por cm (medido electrodo a electrodo) y una duración de 30 min a 4 ° C (o el cuarto frío). </li></ol> 4. Fijación y StaLas células nando <ol><li> Escurrir el exceso de tampón de electroforesis </li><li> Sumergir desliza en pre-refrigerada agua destilada durante 5 min a TA. </li><li> Sumergir los portaobjetos en pre-enfriada de etanol al 70% durante 5 min a RT. </li><li> Las muestras secas durante la noche. No exponga las transparencias a la luz brillante. Las muestras pueden almacenarse durante meses a temperatura ambiente antes de la puntuación en esta etapa. </li><li> Mancha de diapositivas por inmersión en SYBR Green (1X diluido en PBS) durante 20 minutos en el refrigerador. </li><li> Retirar los portaobjetos y dejar que se sequen completamente en la oscuridad. La agarosa se convertirá en transparente cuando está completamente seco. </li></ol> 4. Adquisición de imágenes y análisis <ol><li> Adquirir imágenes con microscopio de fluorescencia establece en el filtro verde (Zeiss AxioVision) y analizar el uso de software Comet Assay (instrumentos perceptivos). </li><li> Haga clic en la &quot;cabeza cometa&quot; (el núcleo) y el software calcula los parámetros que incluye el momento de la cola media y la cantidad de ADN en lanúcleo. </li><li> Analizar al menos 200 células por tratamiento. </li><li> Exportar datos a Microsoft Excel. </li><li> Calcular significa momento de la cola para cada grupo de tratamiento y los datos de trama según proceda. </li></ol> 5. Los resultados representativos Un ejemplo de análisis de cometa ensayo sobre las células neuronales se muestra en la Figura 2 y la Figura 3. En este caso, la irradiación de las células neuronales induce daño en el ADN. Como las células son sometidas a un campo eléctrico, el ADN migra a velocidades diferentes debido a diferencias en el tamaño que posteriormente se analizaron mediante el programa ensayo cometa. Cuanto más el daño en el ADN, más lejos el ADN migra fuera del núcleo. Esto disminuye la intensidad de fluorescencia en el núcleo, el cual es posteriormente recogido por el software y los resultados en momento de la cola superior. Tabla 1 representa una tabla representativa de análisis ensayo cometa y la Figura 4 muestra una representacióntativo gráfico comparando el daño del ADN en las células neuronales después de la radiación, medido por el ensayo de cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo cometa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Imágenes representativas de células neuronales (A) sin y (B) con cola de cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Comet análisis ensayo utilizando software Comet Assay. (A) disparos representativos de pantalla de imagen adquirida con Carl Zeiss microscopio fluorescente y se analizaron usando CometEnsayo de software. (B) Al hacer clic en el núcleo o la &quot;cabeza del cometa&quot; (con un círculo verde) genera un mapa fluorescente y gráfica (marcada en amarillo) y un cuadro (C) datos (círculo rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Gráfico representativo obtenido por el trazado de la momento de la cola media obtenida mediante el análisis de daño del ADN en las células neuronales irradiados y no irradiados mediante ensayo cometa neutral. Como era de esperar, la radiación 3GY (rayos X) induce daño en el ADN como se ha representado por el momento media cola mayor en las células neuronales irradiados. Se muestra el momento de la cola media (+ / - error estándar), ** P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabla 1"/> Tabla 1. </strong&gt; cuadro representativo obtenido por el análisis de prueba del cometa en células neuronales irradiados y no irradiados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
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<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El ensayo de cometa tiene la capacidad única de análisis de células individuales. Esto es ventajoso en la identificación de las subpoblaciones de células que muestran una respuesta diferencial a los agentes citotóxicos. A pocas limitaciones prácticas tienen que ser tomadas en cuenta. El número de células que pueden ser evaluados individualmente puede variar dependiendo de la persona. El tamaño de la muestra debe ser mayor si existe una variación en el daño del ADN dentro de una población. Viable sola célula de suspensió...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, ácido bórico, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Lámina de aluminio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Vaso </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Ensayo Cometa software </td><td> Comet Assay IV Image Analysis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilindro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Electroforesis cámara </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Cualquier microscopio de fluorescencia con filtro verde será suficiente </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Bajo punto de fusión de agarosa </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino, calcio magnesio libre, libre </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Fuente de alimentación </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigerador </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Regla </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deslizar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> De cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio lauril sarcosinato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Bandeja </td><td> Fisla Ciencia </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Baño de agua </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de daño del adn en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Un número de medicamentos se dirigen las rutas de reparación de ADN e inducir la muerte celular mediante la creación de daños en el ADN. Así, los procesos para medir directamente el daño del ADN han sido ampliamente evaluados. Los métodos tradicionales requieren mucho tiempo, los recursos costosos, y requieren células en replicación. En contraste, el ensayo de cometa, un gel de una sola célula del ensayo de electroforesis, es más rápido, no invasivo, de bajo costo medida, directa y sensible de daño y reparación del ADN. Todas las formas de daño en el ADN, así como la reparación del ADN puede ser visualizado en el nivel de células individuales utilizando esta técnica de gran alcance. El principio que subyace a la prueba del cometa es que el ADN intacto es muy ordenado, mientras que el daño del ADN altera esta organización. Las filtraciones de ADN dañado en la matriz de agarosa y cuando se somete a un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo, que está cargado positivamente. Las hebras grandes no dañadas de ADN no son capaces de migrar lejos del núcleo. Daño en el DNAcrea pequeños fragmentos de ADN, que pueden desplazarse más lejos que el ADN intacto. Comet Assay, un software de análisis de imagen, y compara las medidas de la intensidad global fluorescente del ADN en el núcleo con ADN que ha migrado fuera del núcleo. Señal fluorescente del ADN migrado es proporcional al daño del ADN. Brillante cola más larga de ADN significa un mayor daño del ADN. Algunos de los parámetros que se miden son momento de la cola, que es una medida tanto de la cantidad de ADN y la distribución de ADN en la longitud de la cola de la cola, y el porcentaje de ADN en la cola. Este ensayo permite medir la reparación del ADN, así ya que la resolución de daños en el ADN significa reparación ha tenido lugar. El límite de sensibilidad es de aproximadamente 50 roturas de cadena por célula diploide 1,2 mamíferos. Las células tratadas con agentes que dañan el ADN, tales como etopósido, se puede utilizar como un control positivo. Así, el ensayo cometa es un procedimiento rápido y eficaz para medir el daño del ADN.

El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

El objetivo general de este procedimiento es medir y cuantificar la cantidad de daño en el ADN de las neuronas mediante el ensayo COMET. Esto se logra exponiendo primero las neuronas a diversas condiciones que dañan el ADN, recolectando las neuronas y mezclándolas con aros de bajo punto de fusión. El segundo paso es inmovilizar las neuronas en portaobjetos.A continuación, las neuronas se lisan y luego se someten a electroforesis en el paso final. El ADN está teñido de verde cibernético. En última instancia, la microscopía de fluorescencia y el software de ensayo COMET se utilizan para visualizar y cuantificar los niveles de daño en el ADN en neuronas individuales.Hola, mi nombre es Eddie Yang y soy profesor asistente en el Departamento de Oncología Radioterápica de la Universidad de Alabama en Birmingham. Hoy vamos a demostrar el ensayo COMET, que es un método sencillo para detectar daños en el ADN de las células. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes como la tinción con focos Gamma H dos A X, así como la electroforesis en gel de campo de pulsos, es que esta técnica es un método directo y sensible para medir el daño en el ADN.Además, con pequeñas modificaciones de esta técnica, se puede determinar el tipo de daño en el ADN porque muchas terapias contra el cáncer actúan induciendo daño en el ADN de los tumores y, a menudo, actúan alterando la capacidad de reparación del ADN. Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la eficacia de la terapia contra el cáncer. Samara Noshin, asistente de investigación de mi laboratorio, demostrará el procedimiento hoy recolectando células neuronales tratadas bajo las circunstancias experimentales deseadas en tubos de 15 mililitros.Girar los tubos durante cinco minutos a 1000 veces G y cuatro grados centígrados después de aspirar el sobrenadante resus. Suspenda el pellet en PBS y luego gire las celdas nuevamente después del segundo lavado. Resus suspende las células en más PBS, las cuenta y las mantiene en la oscuridad hasta que se utilizan en el ensayo del cometa.Para evitar daños en el ADN, antes de comenzar el ensayo, derrita 1%aros en un microondas durante tres minutos hasta que todos los gránulos desaparezcan. A continuación, sumerja los portaobjetos en los agros fundidos y limpie un lado con una toallita Kim. Deje que los agros se sequen al aire hasta obtener una película transparente mientras se secan, enfríe la solución de lisis a cuatro grados centígrados durante al menos una hora y derrita más.1%Agros de bajo punto de fusión. Fresco. Este lote de agros a 37 grados centígrados en un baño maría durante media hora. Para evitar la inducción artificial de la cola de un cometa, ahora diluya la suspensión de células neuronales recolectadas para que haya 100.000 células por mililitro.Combine brevemente la suspensión celular con los agros de bajo punto de fusión de 37 grados Celsius en un vórtice de proporción de uno a 10 e inmediatamente use el lado de la punta de una pipeta para distribuir 50 microlitros de la suspensión celular de manera uniforme sobre el área de muestra del cometa Slide secado al aire. Coloque los portaobjetos tratados en el refrigerador durante 30 minutos hasta que aparezca un círculo en la periferia del portaobjetos. A continuación, sumerja los portaobjetos en la solución de lisis preenfriada en la oscuridad a cuatro grados centígrados.Después de 30 minutos, aspire la solución de lisis. A continuación, incubar los portaobjetos en un tampón de electroforesis neutro durante media hora en el frigorífico. A continuación, agregue un tampón de electroforesis neutro preenfriado a una cámara de electroforesis y, a continuación, coloque los portaobjetos en la bandeja de portaobjetos de electroforesis, alineando los portaobjetos para que estén a la misma distancia de los electrodos.Después de llenar la cámara lo suficiente como para cubrir los portaobjetos con 0,2 pulgadas de un tampón de electroforesis neutro, ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a un voltio por centímetro y ejecute el ensayo en la oscuridad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Comience sumergiendo los nuevos agros y portaobjetos tratados con células neuronales en una solución de lisis fresca preenfriada, y luego incubelos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante una hora o toda la noche. A continuación, retire los portaobjetos de la solución de lisis, escúrralos y luego enjuáguelos una vez con tampón de neutralización fría durante cinco minutos para eliminar cualquier residuo antes del paso de bobinado alcalino.A continuación, coloque los portaobjetos en una cámara de electroforesis en gel llena de tampón de electroforesis preenfriado y recién hecho que no supere los 0,5 centímetros por encima de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos en el tampón alcalino durante 30 minutos en la oscuridad para permitir el desenrollado del ADN y la expresión del daño alcalino responsable. A continuación, realice el ensayo a un voltio por centímetro durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Después de ejecutar el ensayo del cometa, drene el exceso de tampón de electroforesis y luego sumerja los portaobjetos en agua destilada previamente enfriada a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, sumerja los portaobjetos en etanol preenfriado al 70% también a temperatura ambiente. Después de cinco minutos más, configure las muestras para que se sequen durante la noche, manteniéndolas alejadas de la luz brillante.A continuación, tiñe las diapositivas de verde cibernético en el frigorífico durante 30 minutos. Ahora retira los portaobjetos y deja que se sequen completamente en la oscuridad. Los aros se volverán transparentes cuando estén completamente secos.Para obtener imágenes del ensayo, utilice un microscopio fluorescente ajustado al filtro verde. A continuación, abra el programa de ensayo COMET para analizar las imágenes adquiridas. Al hacer clic en el botón de la cabeza del cometa, el software calculará los parámetros, incluido el momento medio de la cola y la cantidad de ADN en el núcleo.Después de analizar al menos 200 celdas por tratamiento, exporte los datos a Microsoft Excel para el cálculo del momento medio de cola y el trazado de datos. Esta primera figura muestra un ejemplo de un análisis de ensayo COMET de células neuronales con y sin cola de cometa. En este segundo ensayo cometa analizado con el software de ensayo COMET, se determinó que la irradiación de las células neuronales inducía daño en el ADN a medida que las células se sometían al campo eléctrico.El ADN migró a diferentes velocidades debido a las diferencias de tamaño, según se analizó posteriormente con el software de ensayo común. Esta primera captura de pantalla muestra imágenes representativas adquiridas con el microscopio fluorescente utilizando el programa de ensayo COMET. Al hacer clic en el núcleo o en la cabeza del cometa de una imagen, se genera un mapa fluorescente, un gráfico y una tabla de datos.Cuanto mayor es el daño al ADN, más lejos migra el ADN fuera del núcleo. Esto resultó en una disminución en la intensidad de fluorescencia en el núcleo, como lo indica el color verde, y posteriormente es detectado por el software produciendo un momento de cola más alto. En esta figura final, se muestra un gráfico representativo del momento medio de la cola obtenido mediante el análisis del daño en el ADN en células neuronales irradiadas y no irradiadas utilizando un ensayo COMET neutro, como se esperaba, tres daños en el ADN inducidos por radiación gris, según lo indicado por el momento medio de cola más alto en las células neuronales irradiadas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las células con cuidado, evitar la exposición a la luz directa y controlar la temperatura en pH. Esto es para que las células no estén sometidas a un estrés adicional, lo que podría alterar sus resultados después de este procedimiento. Otros métodos, como el análisis del ADN, los focos de reparación a través de la tinción de inmunofluorescencia se pueden realizar para responder preguntas adicionales sobre qué vías de reparación del ADN están alteradas.Por ejemplo, la tinción inmunofluorescente para focos RAD 51 o fosfos, focos PK de ADN se puede realizar para medir la reparación de recombinación homóloga o no homóloga y la reparación de unión, respectivamente.

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El video muestra el ensayo del cometa para detectar daños en el ADN después de la exposición a agentes nocivos. En condiciones alcalinas, el ADN se desenrolla y se desnaturaliza, y tras la electroforesis, el ADN dañado y no dañado migra de manera diferente en el gel de agarosa, formando una estructura en forma de cometa. El ADN no dañado que migra lentamente forma la cabeza circular del cometa, mientras que los fragmentos de ADN dañados que migran rápidamente forman la cola alargada del cometa.

Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

Ensayo cometa mide roturas en el ADN, inducidas por diferentes factores. Si se mantienen constantes todos los factores (excepto el estrés oxidativo) que causan daño en el ADN, la cantidad de daño en el ADN es un buen parámetro indirecto de estrés oxidativo. El objetivo de este protocolo es usar ensayo cometa para la medición indirecta de estrés oxidativo.

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

El ensayo del cometa alcalino mide las roturas de la cadena de ADN en las células eucariotas. Al agregar un paso de digestión de endonucleasa III o 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilasa humana, el ensayo puede detectar de manera eficiente el daño oxidativo del ADN. Describimos los métodos para usar estos ensayos para detectar daños en el ADN en el hígado de rata.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.

Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular

Este protocolo describe un método eficaz para cuantificar la diferencia en el daño del ADN inducido por los inhibidores de tipo I y tipo II en células mutantes FLT3 mediante la aplicación del ensayo cometa.

Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Se describe un protocolo que permite imágenes de las mitocondrias en la vida neuronas a través de microscopía de fluorescencia durante largos períodos de tiempo. Imágenes durante períodos prolongados se lleva a cabo a través de lentivirus mediada por la expresión de una proteína mitocondrial, dirigida fluorescentes y el uso de una etapa de bajo costo-top incubadora que fue diseñado y construido en nuestro laboratorio.

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

Aprende a cuantificar el daño en el ADN de neuronas del hipocampo mediante el ensayo cometa. Este método sensible utiliza electroforesis y microscopía de fluorescencia para evaluar la integridad del ADN neuronal.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

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