Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

El objetivo general de este procedimiento es medir y cuantificar la cantidad de daño en el ADN de las neuronas mediante el ensayo COMET. Esto se logra exponiendo primero las neuronas a diversas condiciones que dañan el ADN, recolectando las neuronas y mezclándolas con aros de bajo punto de fusión. El segundo paso es inmovilizar las neuronas en portaobjetos.

A continuación, las neuronas se lisan y luego se someten a electroforesis en el paso final. El ADN está teñido de verde cibernético. En última instancia, la microscopía de fluorescencia y el software de ensayo COMET se utilizan para visualizar y cuantificar los niveles de daño en el ADN en neuronas individuales.

Hola, mi nombre es Eddie Yang y soy profesor asistente en el Departamento de Oncología Radioterápica de la Universidad de Alabama en Birmingham. Hoy vamos a demostrar el ensayo COMET, que es un método sencillo para detectar daños en el ADN de las células. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes como la tinción con focos Gamma H dos A X, así como la electroforesis en gel de campo de pulsos, es que esta técnica es un método directo y sensible para medir el daño en el ADN.

Además, con pequeñas modificaciones de esta técnica, se puede determinar el tipo de daño en el ADN porque muchas terapias contra el cáncer actúan induciendo daño en el ADN de los tumores y, a menudo, actúan alterando la capacidad de reparación del ADN. Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la eficacia de la terapia contra el cáncer. Samara Noshin, asistente de investigación de mi laboratorio, demostrará el procedimiento hoy recolectando células neuronales tratadas bajo las circunstancias experimentales deseadas en tubos de 15 mililitros.

Girar los tubos durante cinco minutos a 1000 veces G y cuatro grados centígrados después de aspirar el sobrenadante resus. Suspenda el pellet en PBS y luego gire las celdas nuevamente después del segundo lavado. Resus suspende las células en más PBS, las cuenta y las mantiene en la oscuridad hasta que se utilizan en el ensayo del cometa.

Para evitar daños en el ADN, antes de comenzar el ensayo, derrita 1%aros en un microondas durante tres minutos hasta que todos los gránulos desaparezcan. A continuación, sumerja los portaobjetos en los agros fundidos y limpie un lado con una toallita Kim. Deje que los agros se sequen al aire hasta obtener una película transparente mientras se secan, enfríe la solución de lisis a cuatro grados centígrados durante al menos una hora y derrita más.

1%Agros de bajo punto de fusión. Fresco. Este lote de agros a 37 grados centígrados en un baño maría durante media hora. Para evitar la inducción artificial de la cola de un cometa, ahora diluya la suspensión de células neuronales recolectadas para que haya 100.000 células por mililitro.

Combine brevemente la suspensión celular con los agros de bajo punto de fusión de 37 grados Celsius en un vórtice de proporción de uno a 10 e inmediatamente use el lado de la punta de una pipeta para distribuir 50 microlitros de la suspensión celular de manera uniforme sobre el área de muestra del cometa Slide secado al aire. Coloque los portaobjetos tratados en el refrigerador durante 30 minutos hasta que aparezca un círculo en la periferia del portaobjetos. A continuación, sumerja los portaobjetos en la solución de lisis preenfriada en la oscuridad a cuatro grados centígrados.

Después de 30 minutos, aspire la solución de lisis. A continuación, incubar los portaobjetos en un tampón de electroforesis neutro durante media hora en el frigorífico. A continuación, agregue un tampón de electroforesis neutro preenfriado a una cámara de electroforesis y, a continuación, coloque los portaobjetos en la bandeja de portaobjetos de electroforesis, alineando los portaobjetos para que estén a la misma distancia de los electrodos.

Después de llenar la cámara lo suficiente como para cubrir los portaobjetos con 0,2 pulgadas de un tampón de electroforesis neutro, ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a un voltio por centímetro y ejecute el ensayo en la oscuridad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Comience sumergiendo los nuevos agros y portaobjetos tratados con células neuronales en una solución de lisis fresca preenfriada, y luego incubelos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante una hora o toda la noche. A continuación, retire los portaobjetos de la solución de lisis, escúrralos y luego enjuáguelos una vez con tampón de neutralización fría durante cinco minutos para eliminar cualquier residuo antes del paso de bobinado alcalino.

A continuación, coloque los portaobjetos en una cámara de electroforesis en gel llena de tampón de electroforesis preenfriado y recién hecho que no supere los 0,5 centímetros por encima de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos en el tampón alcalino durante 30 minutos en la oscuridad para permitir el desenrollado del ADN y la expresión del daño alcalino responsable. A continuación, realice el ensayo a un voltio por centímetro durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de ejecutar el ensayo del cometa, drene el exceso de tampón de electroforesis y luego sumerja los portaobjetos en agua destilada previamente enfriada a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, sumerja los portaobjetos en etanol preenfriado al 70% también a temperatura ambiente. Después de cinco minutos más, configure las muestras para que se sequen durante la noche, manteniéndolas alejadas de la luz brillante.

A continuación, tiñe las diapositivas de verde cibernético en el frigorífico durante 30 minutos. Ahora retira los portaobjetos y deja que se sequen completamente en la oscuridad. Los aros se volverán transparentes cuando estén completamente secos.

Para obtener imágenes del ensayo, utilice un microscopio fluorescente ajustado al filtro verde. A continuación, abra el programa de ensayo COMET para analizar las imágenes adquiridas. Al hacer clic en el botón de la cabeza del cometa, el software calculará los parámetros, incluido el momento medio de la cola y la cantidad de ADN en el núcleo.

Después de analizar al menos 200 celdas por tratamiento, exporte los datos a Microsoft Excel para el cálculo del momento medio de cola y el trazado de datos. Esta primera figura muestra un ejemplo de un análisis de ensayo COMET de células neuronales con y sin cola de cometa. En este segundo ensayo cometa analizado con el software de ensayo COMET, se determinó que la irradiación de las células neuronales inducía daño en el ADN a medida que las células se sometían al campo eléctrico.

El ADN migró a diferentes velocidades debido a las diferencias de tamaño, según se analizó posteriormente con el software de ensayo común. Esta primera captura de pantalla muestra imágenes representativas adquiridas con el microscopio fluorescente utilizando el programa de ensayo COMET. Al hacer clic en el núcleo o en la cabeza del cometa de una imagen, se genera un mapa fluorescente, un gráfico y una tabla de datos.

Cuanto mayor es el daño al ADN, más lejos migra el ADN fuera del núcleo. Esto resultó en una disminución en la intensidad de fluorescencia en el núcleo, como lo indica el color verde, y posteriormente es detectado por el software produciendo un momento de cola más alto. En esta figura final, se muestra un gráfico representativo del momento medio de la cola obtenido mediante el análisis del daño en el ADN en células neuronales irradiadas y no irradiadas utilizando un ensayo COMET neutro, como se esperaba, tres daños en el ADN inducidos por radiación gris, según lo indicado por el momento medio de cola más alto en las células neuronales irradiadas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las células con cuidado, evitar la exposición a la luz directa y controlar la temperatura en pH. Esto es para que las células no estén sometidas a un estrés adicional, lo que podría alterar sus resultados después de este procedimiento. Otros métodos, como el análisis del ADN, los focos de reparación a través de la tinción de inmunofluorescencia se pueden realizar para responder preguntas adicionales sobre qué vías de reparación del ADN están alteradas.

Por ejemplo, la tinción inmunofluorescente para focos RAD 51 o fosfos, focos PK de ADN se puede realizar para medir la reparación de recombinación homóloga o no homóloga y la reparación de unión, respectivamente.