Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Este sistema experimental ofrece una metodología de alto rendimiento para monitorear la citotoxicidad mediada por células T a nivel de una sola célula. Primero, etiquete las células T efectoras y las células diana del tumor con tintes fluorescentes y muera. Cargue ambos tipos de células en las matrices de nanopocillos y sumerja todo el chip en un medio que contenga verde cyt y nexina marcada con fluorescencia. Cinco.

Con el fin de identificar tanto las células necróticas como las apoptóticas, ahora registre una imagen previa inicial para determinar la ocupación del pozo y la viabilidad de la célula al comienzo del ensayo. Después de una incubación de seis horas, registre una segunda imagen. A continuación, utilice el análisis de imágenes automatizado para cuantificar la lisis específica del antígeno de EL cuatro CD 19 positivo por células T car positivas.

Los resultados obtenidos de este método de alto rendimiento pueden cribar la lisis específica del antígeno de las dianas por células efectoras basándose en la tinción positiva con citoxina. Cinco. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de liberación de cromo 51, es que se pueden lograr verdaderas interacciones objetivo efectivas uno a uno y se puede medir la frecuencia satelital. La implicación de esta técnica se extiende a lo que la terapia del cáncer, ya que permite estudiar los correlatos de eficacia en la terapia celular autóloga Para fabricar nano pocillos utilizando el maestro de silicio, primero mezcle bien la base del kit de elastómero Cigar 180 4 y el agente de curado a un Proporción de peso de 10 a uno en un vaso desechable con un cuchillo de plástico. Desgasificar la mezcla en una cámara de vacío durante una hora.

A continuación, vierte la mezcla sobre el maestro de silicona y déjalo reposar durante 30 minutos. Ahora, para curar el elastómero, caliente el conjunto en un horno a 80 grados centígrados durante dos horas después de enfriar a temperatura ambiente durante una hora. Retire con cuidado la matriz de nanopocillos PDMS del maestro de silicio.

Cúbralo con cinta adhesiva hasta que use un día antes del paso del experimento 5 millones de células objetivo en cinco mililitros. El día del experimento. Pellet 5 millones de células en un tubo cónico estéril de 15 mililitros por centrifugación a 340 Gs durante cinco minutos.

Aspire el exceso de medio dejando atrás aproximadamente 50 microlitros de medio para etiquetar las células. Añadir 150 microlitros de la solución de trabajo roja de rastreador de células frescas y mezclar bien con una pipeta P 200 incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Utilizando un hemocitómetro, enumere las células efectoras extraídas del cultivo.

A continuación, granule 5 millones de células en un tubo cónico estéril de 15 mililitros por centrifugación. Aspire el exceso de medios. A continuación, añada una solución de trabajo fresca de tinción violeta de ciclo D vibrante de cinco micromolares y resus suspenda con una pipeta P 200.

Incubar las células y morir durante 20 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono a 6,8 mililitros y 6,0 mililitros de R-P-M-I-P-L-G-H a las células diana y efectoras respectivamente y mezclar por pipeteo. A continuación, coloque lentamente 3,5 mililitros de fial pack plus en el fondo de cada tubo, centrifugar ambos tubos a 340 GS durante 30 minutos sin interrupción ni aceleración durante la centrifugación, prepare el conjunto de nanopocillos Primero transfiera siete mililitros de PBS de antes de la guerra a una placa de cuatro pocillos. Limpie la parte inferior del portaobjetos de vidrio con etanol utilizando un oxidante de plasma.

Trate el PDMS a una configuración de RF alta durante 30 a 45 segundos. A continuación, coloque la matriz en el PBS. Transfiera la placa a una cabina de bioseguridad y aspire el exceso de PBS, aplique agar noble tibio al 1% en los bordes superior e inferior del portaobjetos de vidrio para inmovilizar la matriz.

Asegúrese de no dejar que el PDMS se seque después de 10 minutos a tres mililitros de PBS y aspire el exceso de agar. A continuación, añada tres mililitros de R 10 en la parte superior de la matriz de nanopocillos y equilibre durante unos 10 minutos. Después de la centrifugación Fial, aspire cinco mililitros de medio de la capa superior de cada tubo.

Tenga cuidado de no aspirar la capa que contiene las células con una pipeta P 1000. Recoja la capa blanca de células entre el fial y el medio. Transfiera las células a nuevos tubos cónicos estériles.

Ahora lave el efector cosechado y las células objetivo dos veces con tres mililitros de R-P-M-I-P-L-G-H de antes de la guerra. Después de la centrifugación final, aspire el exceso de medio y vuelva a suspender el pellet de celda. En 500 microlitros de R 10, cuente las células viables utilizando el método de exclusión de azul de trian en un hemocímetro y aspire el exceso de medios de la matriz de nano voluntad.

A continuación, añade dos mililitros de aspirado R 10 fresco. Una vez más, asegúrese de que la parte superior de la matriz nano no esté ni demasiado húmeda ni demasiado seca, ya que afectará la distribución de las células. Ahora deposite una vez 10 a la quinta de las células del efecto en 200 microlitros de R 10 en la superficie de la matriz nano permitirá que las células se asienten durante cinco minutos.

Luego, usando un microscopio de cultivo de tejidos estándar, verifique la distribución deseada de las células. A continuación, deposite una vez 10 a la quinta celda objetivo en 200 microlitros de R 10 sobre la superficie de la matriz de nanopocillos que contiene las celdas efectoras. Después de cinco minutos, evalúe la distribución celular por microscopía.

A continuación, enjuague cuidadosamente el conjunto de nanopocillos con dos mililitros de R 10 y aspire el exceso de medio en un tubo cónico estéril de 15 mililitros por separado. Pipetear tres mililitros de R 10 precalentado a tres microlitros de 0,5 milimolar cyt, tinción de ácido nucleico verde y 60 microlitros de una X en cinco LOR 6 47 mezclados bien por pipeteo. Ahora pipetee suavemente la solución de tinción en la placa de cuatro pocillos, asegurándose de que las células no se desplacen de los pocillos incubar durante 15 minutos a 37 grados Celsius, dióxido de carbono al 5% adquiera imágenes de la matriz de nano pocillos utilizando un microscopio de fluorescencia como el microscopio zes observer Z one, equipado con una platina motorizada y Lambda DG cuatro.

Inicialice el software y el microscopio. Compruebe la intensidad de la señal en la luz transmitida y en los demás canales fluorescentes. Ajuste la configuración del microscopio para garantizar la máxima relación señal/ruido y evitar la saturación.

Ahora abra la lista de posiciones x e Y para la matriz nelle. Establezca la posición cero XY y ponga a cero el foco en el centro de un bloque de matriz nelle de siete por siete en la esquina superior izquierda del sello de matriz nelle. Establezca las posiciones XY para que coincidan con el centro de cada bloque y el valor Z para reflejar con precisión el enfoque en cada bloque.

Ahora configure la adquisición de imágenes en modo lineal y adquiera imágenes. Después de la primera serie de imágenes, devuelva las matrices de nanopocillos a la incubadora de cultivos celulares durante seis horas. Cuidar la agitación puede provocar el desplazamiento de las células.

A continuación, repita la adquisición de las imágenes en el segundo punto de tiempo. Este ensayo citolítico de alto rendimiento mide la frecuencia de la lisis específica del antígeno marcado: las células T positivas para CAR específicas de CD 19 se coincubaron con cuatro células diana EL de ratón marcadas en los pocillos individuales de una matriz nano L. Los gráficos de histograma de células diana representan pocillos que contienen una sola célula efectora y una sola célula diana.

Después de seis horas de coincubación, se utilizaron histogramas emparejados de células diana sin efectores como controles negativos para informar sobre la frecuencia de muerte celular de fondo. Es deseable lograr bajas frecuencias de lisis inespecífica en el rango de dos a 4%El conjunto de nanopocillos se puede adaptar para imágenes de lapso de tiempo para permitir la observación del efector, la conjugación del objetivo y la posterior muerte celular. Aquí, las células T car positivas no marcadas se coincubaron con las células diana NA LM seis GFP en una NOL y se sometieron a un seguimiento dinámico.

Cuando se añadió un Xin cinco al medio de cultivo, las células apoptóticas etiquetadas como rojas una vez dominadas. Esta técnica se puede realizar correctamente en 10 a 12 horas siguiendo este procedimiento. Se pueden utilizar otros métodos, como el microagarre, para determinar el perfil de secreción de citocinas de las células.