La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

El objetivo de este procedimiento es visualizar el ARN mensajero que está asociado con el retículo endoplásmico o re. Esto se logra colocando primero células de cultivo de tejidos de mamíferos en cubreobjetos. El segundo paso del procedimiento es tratar las células con tampón de extracción para eliminar el ARNm citoplasmático no unido al RE.

Los siguientes pasos son fijar rápidamente las células y teñir el ARNm mediante hibridación fluorescente in situ. Los pasos finales son obtener imágenes y luego cuantificar la cantidad de fluorescencia asociada con el re. En última instancia, los resultados pueden mostrar cómo los ARNm se asocian con la superficie de este orgánulo en diferentes condiciones.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología celular, como si los ARNm que codifican proteínas secretoras pueden mantenerse en la superficie del RE, independientemente de los ribosomas o la síntesis de proteínas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que implica algunos pasos complicados de manipulación celular. Siembrar las células de cultivo de tejidos en cubreobjetos tratados con ácido durante al menos un día antes del experimento cuesta siete y, debido a la OS, las células son opciones adecuadas, ya que tienen una alta producción de proteínas secretadas y RE bien definidas.

Si se está investigando un MR NA exógeno, transfecte las células un día después de la siembra y luego incube las células durante 18 horas adicionales para permitir la RM. Expresión NA. El día del experimento. Para lograr una alta eficiencia de extracción, las células no deben exceder el 80% de la fluidez en el cubreobjetos para detectar si los ARNm interactúan con el RE independientemente de la traducción. Las células pueden tratarse con agentes que interrumpan la interacción entre los ribosomas y el ARNm en estos agentes o medios de control a las células 30 minutos antes de la extracción.

En este caso, se utilizan inhibidores de la traducción, micina pura y Homo Harrington in o HHT. Comience calentando la solución de extracción recién preparada que contiene tonina de excavación y un tampón de trabajo de un XCHO a 37 grados centígrados. Ajuste un bloque calefactor a 40 grados centígrados e inserte un bloque de metal invertido para formar una superficie de trabajo plana.

Humedece el bloque de metal con agua, luego cúbrelo con un trozo nuevo de paraforma y alisa las burbujas con guantes sin ARN y pañuelos sin pelusa. A continuación, para cada par de cubreobjetos, prepare una placa de seis pocillos para lavar y fijar las celdas a cuatro pocillos. Agregue dos mililitros de tampón CHO calentado a los dos últimos pocillos.

Añadir dos mililitros de la solución de fijación. Luego guarde el plato a 37 grados centígrados hasta que lo necesite. En el bloque calefactor, coloque una gota de 100 microlitros de la solución de extracción por cada cubreobjetos de células a procesar.

Ahora, usando unas pinzas de joyero, tome un cubreobjetos recubierto de celdas y sumérjalo en el primer y segundo pocillo que contiene tampón CHO. Esto lava el medio de crecimiento. A continuación, limpie rápidamente el exceso de tampón de la parte trasera del cubreobjetos.

Y coloque brevemente la celda deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la solución de extracción. Después de 10 segundos, transfiera el lado de la celda deslizante de la cubierta hacia arriba al tampón de fijación, donde debe permanecer al menos 15 minutos. El paso de extracción celular es esencial para eliminar todo el ARNm plastificado que no esté unido al RE.

Además, prepare una hoja de cubierta de control donde se fijen las celdas sin la extracción. Paso después de la fijación. Lave estas celdas de control no extraído dos veces con PBS y luego permea en PBS y TRITTON X 100.

Aunque no es obligatorio, la excavación en las células extraídas también debe lavarse con la misma solución de PBS y Triton para reducir la fluorescencia de fondo después de que las células se hayan permeado. Lave los portaobjetos dos veces con PBS para eliminar el fijador y el detergente. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con 60% fide en tampón de citrato de sodio de un solo uso o SSC.

Sin embargo, si se utiliza una sonda de pez DT oligonucleótido para teñir todas las células, el ARNm poligonótido reduce el nivel de fide al 25%A continuación, prepare el tampón de hibridación con la sonda de pescado. Diluir la sonda de pescado a 0,2 micromolares en la misma concentración de fide en tampón de hibridación. Ahora prepare la cámara de tinción.

Llena el fondo de una placa de Petri de 150 milímetros con agua. A continuación, haz flotar un trozo de paraforma en el agua y dale la vuelta al plato. La película para se adherirá al fondo del plato a medida que se escape el agua.

Si hay burbujas de aire, retírelas con guantes y pañuelos sin pelusa para cada pipeta de cubreobjetos 100 microlitros de la solución de hibridación que contiene la sonda de pescado en la película para. Ahora coloque la celda deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la solución. Finalmente, incube la cámara durante cinco a 24 horas en una cámara húmeda y tibia.

Antes de que termine el tiempo de tinción del pescado, prepare un área de lavado libre de ARN, nivele la superficie plana más húmeda con agua y cúbrala con tiras de param. Elimine las burbujas de aire con guantes y pañuelos desechables. Cuando termine la tinción, transfiera la cámara al área de trabajo para cada cubreobjetos. Pipetee un mililitro de tampón de lavado en el área de lavado.

Para la película para transferir los cubreobjetos Primero pipetee medio mililitro de tampón de lavado de pescado cerca del borde de cada cubreobjetos. El líquido se arrastrará por debajo de la cubierta por capilaridad. A continuación, con unas pinzas, retire los cubreobjetos de la cámara y colóquelos sobre las gotas de tampón de lavado.

Y espera cinco minutos. Repite esta técnica de lavado tres veces más. Usando gotas frescas de un mililitro de tampón de lavado en el área de lavado.

Mientras tanto, limpie los portaobjetos de vidrio con etanol al 70% y séquelos con pañuelos sin pelusa. Luego, para cada cubreobjetos, aplique 25 microlitros de solución de montaje DPI a un portaobjetos con pinzas, tome un cubreobjetos y seque su parte posterior con un pañuelo sin pelusa para eliminar el exceso de tampón de lavado. A continuación, transfiera el lado de la celda deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la gota de la solución de montaje.

Las diapositivas terminadas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados hasta que se visualicen. Siete células que fueron transfectadas con plásmidos que contenían fosfatasa alcalina placentaria o citocromo P 4 58 B, una fueron extraídas con tonina y luego fijadas o fijadas directamente para determinar el porcentaje de estos ARNm que está asociado a RE. La fluorescencia no nuclear se cuantificó en ambas muestras y se calculó la fracción de ARNm asociado al RE para ambos ARNm.

Alrededor del 60% de la fracción citoplasmática se asoció con el RE para monitorear la asociación del RE de estos transcritos. Después de los costos transfectados de disociación de ribosomas, siete células fueron tratadas con medios control, pur MYCIN o HHT, y luego se extrajeron tonina y ARNm fijado. La tinción reveló que el PYP A, pero no el ARNm del CYP ocho P uno, permanecieron asociados con el RE después de la interrupción del ribosoma.

La cuantificación del ARNm apoyó esta observación y, lo que es más importante, mostró que el nivel de ARNm nuclear era consistente en todas las muestras. Estos datos revelan que un subconjunto de ARNm dirigidos al RE, como la transcripción A LPP, se mantiene en la superficie del RE después del desensamblaje del ribosoma. Utilizando este protocolo, podemos comenzar a investigar cómo varios ARNm se localizan en distintos compartimentos subcelulares, como la retícula endoplásmica, cuando se combinan con otros ensayos utilizados para analizar la exportación nuclear de ARNm.

Este procedimiento se puede utilizar para estudiar la orientación inicial de los ARNm recién sintetizados a la superficie del RE.