Name: C. elegans Ensayo de quimiotaxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprende a cuantificar la quimiotaxis en Caenorhabditis elegans mediante un ensayo simple y económico. Este método permite evaluar respuestas conductuales en neurociencia con precisión y facilidad.

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Damos las gracias a Ciencias de la Vida y de la Facultad de Artes y Ciencias en la Universidad de la Reina para la financiación de este trabajo. Además, agradecemos al laboratorio Chin-Sang de proporcionar los reactivos necesarios, equipo y soporte técnico. También agradecemos a QGEM 2011, especialmente de Tony El, por su contribución a la discusión.

1. Preparación / lavado de los gusanos <ol><li> Sincronizar los gusanos adultos jóvenes 11. </li><li> Pipetear 2 ml de la basal S sobre una placa de 5 cm quimiotaxis de escena gusanos que han borrado sólo el césped del OP50 E. coli. Incline la placa según sea necesario para asegurar que los gusanos se lavan de la superficie de la placa en el búfer. </li><li> Pipetear 1 ml de la solución basal gusano-S en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar durante 10 segundos utilizando un PicoFuge a 6.600 rpm. </li><li> Aspirar el Basal S, dejando el sedimento de gusanos inalteradas. </li><li> Añadir 1 ml de solución S Basal al tubo de microcentrífuga, invertir varias veces para lavar los gusanos. </li><li> Repetir los pasos 1.4 a 1.6 otras tres veces. </li><li> Centrifugar durante 10 seg quinta vez, esta vez de aspirar el sobrenadante a un volumen final de ca. 100 l. </li><li> Pipetear 2 l de los gusanos en una placa de NGM para garantizar que no entre 50 y 250 gusanos en cada uno de 2 l de muestra. Ajustarla concentración de gusanos en la basal S según sea necesario por la resuspensión de los gusanos en un volumen más pequeño o más grande de S basal. </li><li> Usa los gusanos en el ensayo inmediatamente después de lavar los gusanos durante un máximo de 1 hora. </li></ol> 2. Preparación de las placas de prueba <ol><li> Con motivo de la parte inferior de una placa de 5 cm, dividir el plato en 4 cuadrantes iguales. La quimiotaxis de agar NGM o pueden ser utilizados. Un mínimo de 3 ensayos son necesarios por cepa genética se está probando. </li><li> Marque un círculo de radio de 0,5 cm alrededor del origen (Figura 1). </li><li> Marque un punto en cada cuadrante, ya sea con una &quot;T&quot; de &quot;Test&quot; o &quot;C&quot; para el &quot;control&quot;, asegurar que los sitios son equidistantes del origen y la otra. Los puntos deben ser de al menos 2 cm de distancia desde el origen. Marque los cuadrantes superiores izquierda e inferior derecha como cuadrantes de prueba y de la parte superior derecha y los cuadrantes inferior izquierda como controles (Figura 1). </li></ol> 3. Ejecución del ensayo </p&gt; <ol><li> Mezclar la solución de ensayo mediante la combinación de volúmenes iguales del compuesto de ensayo y 0,5 M de azida (un anestésico utilizado para detener a los gusanos al llegar a un cuadrante). Mezclar la solución de control mediante la combinación del disolvente utilizado para diluir el compuesto de ensayo con 0,5 M de azida. </li><li> Pipetear 2 l de la solución de tornillo sin fin (preparado en 1.8) a partir del sedimento en el origen (donde las dos líneas se cruzan). </li><li> Inmediatamente después, pipeta de 2 l de la solución de prueba en los dos sitios de &quot;T&quot;. Del mismo modo, pipetear la misma cantidad de la solución de control en los dos sitios de &quot;C&quot;. </li><li> Una vez que las gotas de gusanos y olor han sido absorbidos en el agar, reemplace las tapas e invertir las placas. </li><li> Después de 60 minutos, colocar los gusanos en un 4 ° C incubadora. Sólo quitar una placa de la incubadora cuando se puede contar. Dejando gusanos a temperatura ambiente puede permitir a movilizar de nuevo. </li><li> Anote el número de gusanos en cada cuadrante que cruzó por completo la circ interiorle. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.6 con la solución de control, tanto en la prueba y cuadrantes de control. Esto servirá como la placa de control. Tres de tales placas se deben hacer y ejecutar para servir como un control apropiado. </li></ol> 4. Interpretación de los Resultados / Determinación del índice de quimiotaxis <ol><li> Calcular el índice de quimiotaxis utilizando la ecuación 1. Esto dará lugar a un índice de quimiotaxis entre -1,0 y 1,0. </li></ol> (1) La quimiotaxis Index = (# Los gusanos de las casillas de prueba - # gusanos de las casillas de control) / (# total de Worms arco) Una puntuación de 1,0 indica atracción máxima hacia el objetivo y representa el 100% de los gusanos que llegan en los cuadrantes que contienen el objetivo química. Un índice de -1,0 evidencia de repulsión máxima. Métodos de ensayo similares ya se han empleado 3 (Tabla 1). <ol start="2"><li> Reporte el Chemotaxi medias Índice (IC) y el error estándar de la media (SEM). Realizar la prueba T de Student comparando los datos de las placas de prueba y de control. </li></ol>

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467(2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li>
<li>Hart, A. C. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+AC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (1895).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La quimiotaxis, aunque controlada por un complejo conjunto de mecanismos neuronales y celulares, puede ser fácil y objetivamente cuantificado utilizando ensayos de quimiotaxis. Para obtener los mejores resultados de los ensayos, se deben tomar ciertos pasos críticos. En primer lugar, la celebración de los gusanos es esencial en la obtención de resultados experimentales consistentes. Gusanos en diferentes etapas de la vida se comportan de manera diferente 13; gusanos etapa tan mixtas pueden sesgar los resultad...

Ward, desarrollado por primera vez el ensayo de quimiotaxis en 1973 5, y desde entonces ha tenido aplicaciones de gran alcance. Neurobiología es un campo que se ha beneficiado del uso de una variedad de ensayos de quimiotaxis. Adaptación olfativa, una forma simple de aprendizaje y la memoria, se ha demostrado en C. elegans utilizando ensayos de quimiotaxis 6. Ellos también se han utilizado para mostrar que C. elegans pueden desarrollar tolerancia a etanol-un resultado que no sólo demuestra la plasticidad de comportamiento de los gusanos, pero que también muestra que los gusanos pueden ser muy útiles en el estudio de la dependencia del alcohol en los seres humanos 3. Los ensayos incluso han sido desarrollados para demostrar la capacidad de C. elegans para almacenar la memoria a corto y largo plazo, mostrando que las asociaciones son hechos por los gusanos entre quimioatrayentes y alimentos (OP50) 7. Además, dada la amplia información disponible en la actualidad con respecto a la C. elegans genoma, la chemotaxis comportamiento de C. elegans ha sido modificado varias veces mediante la inducción de mutaciones 1,8. Esto permite muchas posibilidades excitantes de ingeniería, tales como el desarrollo de C. elegans como una herramienta de biorremediación. Así, desde el desarrollo inicial del ensayo de quimiotaxis en 1973, ha sido frecuentemente alterado y utilizado para dilucidar misterios en una variedad de disciplinas. Algunos ensayos dirigidos a descubrir la ruta específica adoptada por los gusanos hacia un objetivo. El ensayo de prototipo de este tipo fue desarrollado por Ward 5. Tres gusanos fueron colocados en agar fundido durante 15 min. Sus movimientos fueron rastreadas por la huella que dejan al viajar de la periferia de la placa hasta un gradiente de un atrayente en el centro de la placa. Todos los gusanos en la placa fueron detenidos usando cloroformo al final de cada ensayo. Una descendiente de este método coloca un solo tornillo sin fin en el centro de la placa con el atrayente y el control de unt distancias iguales y opuestas desde el origen 2. Pierce-Shimomura et al. desarrollado un ensayo para observar la naturaleza exacta del movimiento involucrados en la quimiotaxis 9. Gusanos individuales se colocaron en placas de Petri de 9 cm que contienen ya sea una concentración uniforme del atrayente o un gradiente de forma radial, que culmina en la fuente del atrayente. Un programa de software que reconoce el gusano se utiliza para registrar el comportamiento observado. Una cámara de vídeo conectada a un microscopio trabajó conjuntamente con la etapa de ajustar la placa de Petri automáticamente como el ensayo corrió para asegurar el gusano se mantuvo en el campo de visión. A partir de esto, la información más detallada fue descubierto con respecto a la causa de piruetas mostrados por C. elegans. Otros ensayos, más similares a la descrita aquí, a prueba la respuesta de una gran población de gusanos a los compuestos de ensayo. Ensayos de dos cuadrantes quimiotaxis han sidoutilizados para explorar los roles que varios receptores, neuronas, y las moléculas de transducción de señales reproducen cuando C. elegans fue expuesto a varios compuestos 1. Entre 20-50 gusanos lavados se colocan cerca del centro de la placa con un atrayente y un control en los extremos polares junto con el anestésico, azida de sodio (NaN3). Después de 60 min, se generó un índice de quimiotaxis con valores de -1,0 a 1,0 en base a la diferencia entre el número de gusanos se colocará en el atrayente o el control. Un índice quimiotáctico similar se utilizó en el ensayo descrito en este artículo, aunque el ensayo anterior no evaluó estrictamente gusanos no móviles. A continuación, este ensayo se aplica aún más al ensayo de los efectos de la ablación neuronal sobre la quimiotaxis. Otra variación del ensayo mencionado anteriormente se lleva a cabo donde 100-200 gusanos fueron colocados en el centro de una placa que contiene cuatro cuadrantes 3. Cuadrantes adyacentes o bien contenían la prueba olas sustancias controladas. Al igual que en los ensayos anteriores, los gusanos fueron inmovilizados por la acción de azida de sodio antes de ser marcado. Un método similar se describe aquí como una forma de evaluar la respuesta de C. elegans a diversos compuestos. Sin embargo, el siguiente método tiene la ventaja añadida de sólo evaluar los gusanos que han pasado un umbral de distancia que separa móvil de gusanos inmóviles. Otros ensayos han incorporado directrices similares para ignorar gusanos inmóviles. Frøkjær-Jensen et al. desarrollaron un ensayo versátil que puede ser utilizado para probar compuestos solubles tanto volátiles y el agua 10. Una placa de Petri se dividió en cuatro cuadrantes. Los cuadrantes superior e inferior no contienen disolventes. El cuadrante izquierdo contenía agua y el derecho mencionado el atrayente. Al probar sustancias olorosas volátiles, el analito se coloca en la tapa de la placa, sobre el cuadrante correcto, mientras que los compuestos solubles en agua se colocaron directamente sobre la AGAr. Los métodos existentes en la actualidad para evaluar la respuesta quimiotáctica de C. elegans están siendo constantemente refinado para optimizar su facilidad de uso, la eficiencia y exactitud. Así, mientras que el ensayo descrito aquí tiene la capacidad de evaluar el mayor número de gusanos (máximo rendimiento:. 250 gusanos / hora por placa, ligeramente mayor que el rendimiento demostrado por Lee et al 3); la fuerza real de este método es el sucinta culminación de muchos de los atributos de los ensayos anteriores (Tabla 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- colesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K fosfato de potasio, pH 6.0; dH2O hasta 1 litro.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopios</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disección</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipa P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipa P10</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M de azida sódica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar de Quimiotaxia [1.6% de agar BBL (Benton-Dickinson) o 2% de agar Difco. Autoclave. Añadir 5 mM de fosfato de potasio, pH 6.0; 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol/Agua Destilada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compuestos de prueba (ej. 0.5% de diacetil)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans ensayo de quimiotaxis

C. elegans Chemotaxis Assay

Muchos organismos utilizan la quimiotaxis a buscar las fuentes de alimentos, evitar sustancias nocivas, y encontrar pareja. Caenorhabditis elegans tiene impresionante comportamiento quimiotaxis. La premisa detrás de probar la respuesta de los gusanos a un odorante es colocarlos en un área y observar el movimiento evocada en respuesta a un odorante. A pesar de los muchos ensayos disponibles, optimizando gusano de partida ubicación con respecto a tanto las zonas de ensayo y de control, y reducir al mínimo la interacción de los gusanos uno con el otro, mientras se mantiene un tamaño de la muestra significativa sigue siendo un trabajo en progreso 1-10. El método descrito aquí tiene como objetivo hacer frente a estos problemas mediante la modificación del ensayo desarrollado por Bargmann et al. 1. Una placa de Petri se divide en cuatro cuadrantes, dos cuadrantes opuestos marcados &quot;Prueba&quot; y dos se designan como &quot;control&quot;. Anestésico se coloca en todos los sitios de control de prueba y. Los gusanos se colocan en el centro de la placa con un circle marcado alrededor del origen para asegurarse de que se ignoran los gusanos no móviles. La utilización de un sistema de cuatro cuadrantes en lugar de uno o dos 2 1 elimina el sesgo en el movimiento de los gusanos, ya que son equidistantes a partir de muestras de prueba y de control, independientemente de qué lado del origen que comenzaron. Esto evita el problema de los gusanos que se ven obligados a viajar a través de un conjunto de otros gusanos de responder a un olor, lo que puede retrasar gusanos u obligar a tomar una ruta más tortuosa, dando una interpretación incorrecta de su ruta prevista. Este método también presenta ventajas prácticas por tener un tamaño de muestra más grande y permite al investigador para ejecutar el ensayo sin supervisión y marcó los gusanos una vez que el tiempo asignado ha expirado.

Comparación de tipo salvaje (N2) C. elegans para el ODR-10 (KY10) mutante. Se utilizó diacetilo, un conocido C. elegans quimioatrayente, para comparar los gusanos de tipo salvaje a la de un mutante que carece del receptor para diacetil 1,12. Para los gusanos de tipo salvaje (N2), el índice de quimiotaxis fue 0,100 ± 0,066 a etanol y 0,839 ± 0,031 hasta 0,5% diacetil. Como era de esperar, diacetilo provoca una respuesta quimioatrayentes significativ...

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de los<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Se describe. Un índice quimiotáctico (CI) se empleó como una forma de evaluar con precisión la respuesta de los gusanos a ciertos objetivos, y servir como una plataforma de la comparación entre las cepas y los compuestos de interés.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la respuesta quimiotáctica de C elegance utilizando un ensayo simple y económico. Esto se logra aislando gusanos en etapa determinada y colocándolos en el centro de una placa marcada. A igual distancia de todos los sitios de prueba y control depositados en cada sitio se encuentra un compuesto de interés o un compuesto de control, ambos combinados con un anestésico que detendrá a los gusanos a medida que se acerquen.Después de 60 minutos, se contabiliza la distribución final de los gusanos en la placa y se utiliza la proporción de las ubicaciones de los gusanos para proporcionar un índice de ensayo. En última instancia, la cuantificación de la atracción de sea elegance hacia ciertos compuestos puede utilizarse para evaluar las consecuencias conductuales de las manipulaciones experimentales subyacentes. La principal ventaja de esta técnica es que incluye muchos aspectos beneficiosos de sus predecesores, al tiempo que permite una mayor facilidad de uso.Este ensayo proporciona información sobre el comportamiento de sea elegance y es especialmente útil en combinación con manipulaciones neurogenéticas y otros ensayos neurobiológicos. Comience con placas de cinco centímetros cargadas con agar de quimiotaxis o NGM. Marque la parte inferior de las placas en cuatro cuadrantes iguales.Prepare al menos tres placas para al menos tres ensayos por cepa genética que se esté probando y por condición probada. Luego, marque un círculo con un radio de 0.5 centímetros alrededor del origen. Luego marque puntos en los cuadrantes opuestos con una T para prueba o una C para control, asegurándose de que los sitios estén a igual distancia del origen y entre sí.Los puntos deben estar al menos a dos centímetros del origen para este ensayo. Tenga preparados gusanos adultos jóvenes en desarrollo sincronizado en placas de quimiotaxis de cinco centímetros. Los gusanos que se encuentran en diferentes etapas de desarrollo pueden responder de manera diferente a los analitos.Como resultado, es muy importante que todos los gusanos empleados en el ensayo estén en la misma fase de desarrollo. Una vez que los gusanos hayan limpiado un césped de OP 50 e coli, pipetee dos mililitros de tampón basal S en la placa. Manipule la placa para meter todos los gusanos en el tampón para lavar los gusanos.Pipetee un mililitro de los gusanos en tampón en un tubo de microcentrífuga y céntrífugalos durante 10 segundos. Usando un pico fuge a 6,600 RPM, aspire el basil como, dejando el pellet de gusanos sin perturbar. Ahora lave estos gusanos tres veces más usando el mismo método.Comience agregando el tampón basil S al tubo e invierta el tubo para poner los gusanos de nuevo en solución. Después del lavado final, céntrífuguel los gusanos durante otros 10 segundos y luego aspire el sobrenadante hasta un volumen final de 100 microlitros. A continuación, asegúrese de una densidad suficiente de gusanos pipeteando dos microlitros de los gusanos lavados del pellet en una placa NGM.Debe haber al menos 50 gusanos, pero no muchos más de 250 gusanos. Si hay demasiados gusanos, aumente el volumen de la solución ESP basil. Y si hay muy pocos gusanos, centrifúguelos y resuspenda en un volumen menor.Coloque el tubo de gusanos en una campana de extracción. Una vez preparados, los gusanos están listos para usarse en el ensayo de quimiotaxis hasta por una hora. Primero, prepare las soluciones.Mezcle la solución de prueba combinando volúmenes iguales del compuesto de prueba con el anestésico azida 0.5 molar. Luego, mezcle una solución de control del solvente utilizado para diluir el compuesto de prueba con azida de sodio 0.5 molar. Ahora prepare una placa de prueba.Primero pipetee dos microlitros de solución de gusanos del pellet en el origen de una placa de prueba. Segundo, agregue los odorantes pipetee dos microlitros de la solución de prueba en los dos sitios T y pipetee dos microlitros de la solución de control en los dos sitios T. Una vez que los gusanos y las gotas de odorante se hayan absorbido en el agar, reemplace las tapas, invierta las placas y deje 60 minutos para el tiempo de ensayo.Para que el tiempo de difusión de ASI de sodio esté estandarizado entre ensayos. Es importante que los gusanos se agreguen inmediatamente antes de los odorantes.Además, cada placa debe estar completamente preparada y el ensayo debe comenzar antes de preparar la siguiente placa. Después de la prueba de 60 minutos, coloque los gusanos en un refrigerador de cuatro grados Celsius. Más tarde, retire la placa del refrigerador cuando se pueda contar.No contarlos inmediatamente y dejar los gusanos a temperatura ambiente puede permitirles movilizarse. Nuevamente. Registre la ubicación de los gusanos que cruzaron completamente el círculo interior de los datos. Calcule el índice de quimiotaxis.El valor variará de menos uno a más uno, representando repulsión máxima a atracción máxima. Repita el proceso usando la solución de control tanto en los cuadrantes de prueba como de control. Esto servirá como placa de control.Tres.Se deben hacer y ejecutar placas de este tipo para cada condición experimental. Diacetyl. Se utilizó un conocido quimioatrayente C elegance para comparar gusanos de tipo salvaje con mutantes que carecen del receptor para diacetyl. Como se esperaba, el diacetyl provocó una respuesta quimioatrayente significativa de los gusanos de tipo salvaje.En contraste, los mutantes ODR 10 no se sintieron más atraídos por el diacetyl de lo que lo estaban por el compuesto de control etanol. Una vez dominado. Este técnica puede completarse en menos de 90 minutos si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar eficientemente la respuesta quimiotáctica de sea elegance a soluciones de analitos.Tenga especial cuidado para asegurarse de que todos los gusanos probados obtengan una etapa sincronizada de desarrollo y que se emplee un número suficiente de gusanos. Cada prueba.

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Biología

A continuación se describen los métodos de ensayo C. elegans aprendizaje asociativo y la memoria a corto y largo plazo asociativo. Estos ensayos se emplean las habilidades de la población de gusanos chemotax hacia olores volátiles, y la forma de asociaciones positivas en maridaje con el butanona chemoattractant. Aumentar el número de períodos acondicionado induce memoria a largo plazo.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Este video presenta la quimiotaxis en el nematodo C. elegans y muestra un protocolo de muestra que prueba la aversión quimiotáctica al sulfato de cobre.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis: un método para probar la quimiosensación en gusanos

Los investigadores pueden desencadenar el movimiento a demanda en C. elegans mediante la aplicación de un campo eléctrico que los gusanos detectan y responden. Este video presenta el comportamiento electrotáctico y muestra un protocolo de muestra que se realiza en un dispositivo microfluídico.

Ensayo de electrotaxis: un método para observar la locomoción en C. elegans

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Presentamos una configuración de grabación de comportamiento y un protocolo que permite el análisis automatizado del nematodo, la preferencia de Caenorhabditis elegans por compuestos solubles en un ensayo basado en la población. Este artículo describe la construcción de una cámara de comportamiento, el protocolo de ensayo conductual y el uso de software de análisis de vídeo.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

Hemos desarrollado previamente protocolos para Caenorhabditis elegans para formar memorias asociativas a corto y largo plazo mediante entrenamiento masivo y espaciado, respectivamente. Aquí, se describen protocolos detallados para el acondicionamiento de C. elegans emparejando 1-propanol y ácido clorhídrico como estímulos condicionados y no condicionados, respectivamente, para formar memoria asociativa aversiva.

Aprendizaje asociativo aversivo y formación de la memoria mediante el emparejamiento de dos sustancias químicas en Caenorhabditis elegans

Aquí, presentamos un protocolo para probar el aprendizaje asociativo mediante la realización de condicionamientos clásicos en el organismo modelo C. elegans. El paradigma se basa en emparejar la concentración de sal en el ambiente con la presencia o ausencia de alimentos, lo que altera su quimiotaxis hacia o lejos de la sal.

Medición del aprendizaje asociativo en la quimiotaxis del nematodo Caenorhabditis elegans

Este protocolo establece métodos para extraer y cuantificar las respuestas a la feromona sexual volátil en C. elegans, proporcionando herramientas para estudiar la comunicación química y la trayectoria de navegación.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Aprende a cuantificar la quimiotaxis en Caenorhabditis elegans mediante un ensayo simple y económico. Este método permite evaluar respuestas conductuales en neurociencia con precisión y facilidad.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

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