Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

El objetivo general de este procedimiento es obtener cultivos puros de astrocitos mediante el aislamiento y cultivo de células corticales mixtas de P uno a P cuatro crías de ratón. Esto se logra primero recolectando las cortezas cerebrales de las crías de ratón y eliminando las meninges. El segundo paso es cortar la corteza en trozos pequeños, disociar los trozos de la corteza por tripsina y tación para obtener células individuales y colocar las células individuales en matraces de cultivo de tejidos recubiertos de poli de licina.

A continuación, después de siete u ocho días, los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos habrán formado diferentes capas y la separación de los astrocitos de la microglía y los oligodendrocitos se logra agitando el matraz de cultivo de tejidos en un agitador orbital. El paso final es la ionización y recolección de los astrocitos restantes, que luego se resiembran en un matraz de cultivo de tejidos. En última instancia, de 12 a 14 días después de la primera división celular, los astrocitos se siembran en la concentración adecuada para los experimentos y la pureza celular se puede examinar mediante inmunocitoquímica utilizando marcadores específicos de astrocitos.

El método descrito aquí se basa en la preparación del cultivo de astrocitos a partir de cerebros neonatos de roedores, descrito originalmente por McCarthy y desarrollado en 1980. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como las preguntas sobre la interacción entre los osteocitos y las neuronas, así como el papel de los osteocitos en ciertas enfermedades S, donde los osteocitos se activan y contribuyen a la formación de cicatrices inhibitorias. La demostración visual de este método es útil para que los jóvenes científicos señalen los pasos críticos del método de aislamiento y visualicen la morfología astrocítica durante los diferentes pasos del procedimiento de aislamiento para garantizar cultivos de astrocitos puros y saludables.

La demostración de este procedimiento será realizada por dos estudiantes graduados de mi laboratorio, Sebastian Hilker y Khristian Bora. Antes de comenzar este procedimiento, asegúrese de que todos los reactivos de cultivo de tejidos y los reactivos y materiales de disección estén preparados con anticipación de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito. Después de sacrificar una cría de ratón P uno a P cuatro, realice una incisión en la línea media posterior a anterior a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo, corte cuidadosamente el cráneo desde el cuello hasta la nariz, luego haga un corte anterior al bulbo olfativo y otro inferior al cerebelo. Para desconectar el cráneo de la base del cráneo, use pinzas de punta plana para voltear suavemente los colgajos craneales hacia un lado.

A continuación, corte los bulbos olfativos y el cerebelo, y luego levante el cerebro. Deposite el cerebro en un plato de HBSS frío y colóquelo en hielo. Ahora repita el procedimiento para cosechar los cerebros de tres animales adicionales.

Cuatro cerebros proporcionarán suficientes astrocitos para sembrar un matraz de cultivo de tejidos T 75 con la densidad adecuada. Una vez que se hayan extraído todos los cerebros, transfiera el plato que contiene los cerebros a un microscopio estereoscópico. A continuación, para aislar las cortezas, agarre el extremo posterior de cada cerebro con pinzas finas y realice una incisión en la línea media entre los hemisferios.

A continuación, inserte un segundo juego de pinzas en el surco creado y retire la estructura en forma de placa de la corteza del resto del cerebro. Una vez que se hayan aislado todas las cortezas, retire con cuidado las meninges de la corteza tirando con las pinzas finas. Este paso evita la contaminación del cultivo final de astrocitos por células meníngeas y fibroblastos.

Transfiera los hemisferios corticales preparados a un segundo plato lleno de HBSS frío y colóquelo en hielo. Continúe en consecuencia con las cuatro cortezas. Finalmente, corte cada hemisferio en cuatro a ocho pedazos pequeños usando cuchillas afiladas en condiciones estériles.

Transfiera los trozos de corteza a un tubo de halcón de 50 mililitros y agregue HBSS hasta un volumen final de 22,5 mililitros. A continuación, añada 2,5 mililitros de 2,5%. Vuelva a colocar la mezcla de tapas e incube el tejido en el baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Mezclar agitando cada 10 minutos. Luego, después de la centrifusión, durante cinco minutos a 300 veces G para pellet. Los pedazos de tejido de la corteza decantan cuidadosamente el sobrenadante S.

Agregue 10 mililitros de medio de siembra de astrocitos al pellet y use una pipeta de 10 mililitros para pipetear vigorosamente el medio que contiene el tejido hacia arriba y hacia abajo de 20 a 30 veces hasta obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, agregue el medio de siembra de astrocitos hasta un volumen final de 20 mililitros y cuente las células usando un hemo o un contador de células automatizado. De acuerdo con los procedimientos estándar, una preparación de cuatro cortezas de cachorros de ratón debe producir de 10 a 15 veces 10 a las seis células individuales disociadas.

Por último, aspirar el poly de licina de un matraz previamente preparado y transferir la suspensión celular disociada al matraz. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados en la incubadora de cultivo de tejidos durante dos días y, a continuación, cambiar el medio. A continuación, los medios deben cambiarse cada tres días.

A partir de entonces, los astrocitos deben aparecer complementarios con una capa suprayacente de microglía después de siete a ocho días de cultivo. En este punto, coloque el matraz T 75 en un agitador orbital configurado a 180 rotaciones por minuto durante 30 minutos para eliminar la microglía, desechar el supinato que contiene microglía o girarlo hacia abajo y colocar la placa para el cultivo. Luego agregue 20 mililitros de medio de cultivo de astrocitos frescos y continúe agitando el matraz a 240 RPM durante seis horas para eliminar las células precursoras de oligodendrocitos.

Dado que algunas OPC no se desprenderán completamente de la capa de astrocitos, continúe agitando vigorosamente con la mano durante un minuto. Para evitar la contaminación por OPC, nuevamente, deseche el supinato o gírelo en una placa para cultivar sus OPC. Enjuague la capa de astrocitos confluentes restante dos veces con PBS, aspire el PBS y agregue cinco mililitros de viajes en EDTA en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.

Verifique el desprendimiento de astrocitos cada cinco minutos y refuerce el desprendimiento de astrocitos golpeando el matraz contra la palma de su mano dos o tres veces. Una vez que los astrocitos se hayan desprendido del matraz, añadir cinco mililitros de medio de cultivo de astrocitos. Girar las células a 180 veces G durante cinco minutos, aspirar el supinato y añadir 40 mililitros de placa de astrocitos frescos. Medio.

Un matraz T 75 de células corticales mixtas debe rendir alrededor de un centímetro de las seis células enriquecidas para astrocitos después del primer paso, colocar las células en dos matraces de cultivo T 75 e incubar a 37 grados centígrados en la incubadora de cultivo de tejidos. Cambie el medio cada dos o tres días, de 12 a 14 días después de la primera placa de masaje, los astrocitos a la concentración celular adecuada de 24 a 48 horas antes de realizar el experimento. Un matraz de cultivo de tejidos T 75 debe rendir alrededor de 1,5 a dos veces 10 a las seis celdas después de la segunda división.

Esta imagen muestra células corticales mixtas un día después de la siembra. Las flechas negras indican astrocitos adheridos al fondo del matraz. Las neuronas moribundas se pueden ver flotando en el supinado tres días después de la colocación de placas en las células corticales mixtas.

La capa de astrocitos se está formando como lo indican las flechas negras y las neuronas están casi ausentes. El mismo cultivo cortical mixto se observa aquí cinco días después de la siembra. Las primeras microglías y OPC en la parte superior de una capa de astrocitos son evidentes, como lo indican las flechas negras que se ven aquí.

La capa de astrocitos es completamente confluente siete días después de la siembra de células corticales mixtas. Esta imagen muestra el cultivo de astrocitos enriquecido. Dos días después de la división.

Las células adheridas muestran morfología de astrocitos con baja densidad. Aquí, las áreas indican celdas individuales. Dos semanas después, la capa de astrocitos ha alcanzado una alta densidad.

La barra de escala representa 10 micras. Esta imagen demuestra la pureza de los cultivos de astrocitos. Cada panel muestra las células que han sido inmunoteñidas para los marcadores de astrocitos, G-F-A-P-G-L-A-S-T-S, 100 B, Aquaporin, cuatro A, LDH, una L one y BLBP en verde.

Los núcleos son revelados por una contratinción de DAPI. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar astrocitos corticales. El aislamiento y cultivo de astrocitos corticales descrito en este protocolo proporciona una poderosa herramienta para investigar la biología de los astrocitos.

Ya que su manejabilidad en diversas aplicaciones puede completar en gran medida su investigación in vivo.