Name: La transfección de proteínas de ratón de pulmón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Aprende la transfección de proteínas en pulmón de ratón utilizando un microspray ultrafino y reactivos lipídicos. Este método eficiente minimiza efectos secundarios y mejora la expresión proteica en estudios pulmonares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (7R01HL098528-03) y el Premio a la Innovación Clínica de FAMRI.

1. Preparación de Proteína reactivo de transfección <ol><li> Disolver el reactivo Pro-Ject mediante la adición de 250 l de metanol o cloroformo al tubo que contiene la película seca. </li><li> Vortex durante 10-20 segundos a velocidad máxima. </li><li> Pipetear 20 l de reactivo de Pro-Ject en tubos de microcentrífuga separados. </li><li> Evaporar el disolvente mediante la colocación de los tubos de microcentrífuga que contiene el reactivo Pro-Ject bajo una campana de flujo laminar durante un mínimo de 6 horas a temperatura ambiente. Debe estar completamente seco. Alternativamente, secar el reactivo Pro-Ject utilizando un secador de vacío. </li><li> Guarde los tubos a -20 ° C. Son válidos por un año a esta temperatura. </li></ol> 2. Añadir proteína a reactivo Pro-Ject <ol><li> Pipetear 50 l de PBS, que contenía 2,0 g de la proteína de interés, en un tubo que contiene 20 l de reactivo de transfección Pro-Ject seca. </li><li> Después de agregar la proteína, mezcle la solución mediante agitación a baja velocidad fo 3-5 seg seguido por incubación durante 30 min a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Administración intratraqueal de Proteína <ol><li> Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg). </li><li> Después se logra la sedación, los ratones son suspendidos de sus incisivos superiores utilizando una plataforma especialmente diseñado (Figura 1). </li><li> El uso de pinzas y un clip de papel como un laringoscopio, se abre la orofaringe modo que el catéter puede ser introducido (Figura 2). Las cuerdas vocales se visualizan mediante la colocación de una fuente de luz frente a la tráquea del ratón. </li><li> La mezcla de reactivos proteína / Proyecto (50 l) se inyecta a través de la tráquea utilizando un siglo Microsprayer Penn. </li></ol>

<ol><li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li>
<li>D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+expression+in+the+lungs+of+transgenic+mice+causes+pulmonary+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema.</a> Cell. 71, 955-961 (1992).</li>
<li>Foronjy, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+expression+attenuates+cigarette+smoke-+or+elastase-generated+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice.</a> Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).</li>
<li>Foronjy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+roles+of+secreted+frizzled+related+protein-1+%28SFRP1%29+in+lung+morphogenesis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema.</a> Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).</li>
<li>Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+mouse+lung+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in mouse lung development and function.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).</li>
<li>Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+the+respiratory+epithelium+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse.</a> Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).</li>
<li>Morimoto, M., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rtTA+toxicity+limits+the+usefulness+of+the+SP-C-rtTA+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse.</a> Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li>
<li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li>
<li>Liu, Q., Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+inflammatory+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.</a> Gene Ther. 10, 935-940 (2003).</li>
<li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression%3A+effect+of+mouse+strain%2C+animal+gender+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulates+innate+immune+and+proteolytic+responses+to+cigarette+smoke+exposure+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung.</a> Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Phosphatase+2a+%28Pp2a%29+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

La ventaja de esta técnica sobre otros métodos es que produce aumentos en los niveles de proteína y la actividad en el tejido pulmonar en sí. Por otra parte, penetra a las regiones más distales del pulmón en lugar de alojarse sólo dentro de las vías respiratorias. Hemos medido aumento de la actividad de proteínas de nuestra inyectado incluso después lavaging las vías respiratorias con solución salina 15. Los análisis de actividad del tejido indican que la proteína está entrando en las células y no sólo perman...

<table><tbody><tr><td>Pro-Ject</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Micropulverizador</td><td>Penn Century</td><td>FMJ-250</td><td></td></tr><tr><td>Beta-galactosidasa</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo beta-galactosidasa</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>SC-19119</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica de ratón</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3139</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina/xilacina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr></tbody></table>

la transfección de proteínas de ratón de pulmón

Protein Transfection of Mouse Lung

El aumento de la expresión de proteínas permite a los investigadores a entender mejor el papel funcional de esta proteína en la regulación de procesos biológicos clave 1. En el pulmón, esto se ha logrado típicamente a través de enfoques genéticos que utilizan ratones transgénicos 2,3 o vectores virales o no virales que elevan los niveles de proteína a través de aumento de la expresión del gen 4. Los ratones transgénicos son costosos y requiere mucho tiempo para la generación y la inserción aleatoria de un gen de expresión del transgen o crónica pueden alterar el desarrollo normal de los pulmones y por lo tanto limitar la utilidad del modelo 5. Mientras que los transgénicos condicionales evitar problemas asociados con la expresión crónica gen 6, los ratones transactivador controlado por tetraciclina inverso (rtTA), que se utilizan para generar la expresión condicional, se desarrollan espontánea aire ampliación espacio 7. Al igual que con los transgénicos, el uso de vectores virales y no virales es caro 8 y puede provocar dosis-drespuestas inflamatorias ependent que confunden los resultados 9 y dificultan la expresión 10. Por otra parte, la eficacia de las dosis repetidas están limitados por las respuestas inmunes mejoradas a el vector de 11,12. Los investigadores están desarrollando adeno-asociado vectores virales (AAV) que provocan una menor inflamación y tener una expresión más larga dentro del pulmón 13. Uso de β-galactosidasa, se presenta un método para incrementar la expresión rápida y eficazmente la proteína dentro del pulmón utilizando una técnica directa de transfección de proteína. Este protocolo se mezcla una cantidad fija de proteína purificada con 20 l de un reactivo de transfección a base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir la penetración en el tejido pulmonar en sí. La mezcla de proteína liposómica se inyecta entonces en los pulmones de los ratones a través de la tráquea utilizando un microsprayer (Penn Century, Filadelfia, PA). El microsprayer genera una fina nube de aerosol líquido a través de los pulmones. Utilizando la técnicahemos demostrado la deposición uniforme de la proteína inyectada a través de las vías respiratorias y los alvéolos de los ratones 14. La técnica de transfección de lípidos permite el uso de una pequeña cantidad de proteína para lograr el efecto. Esto limita la respuesta inflamatoria que de otro modo sería provocado por alta administración de la proteína. En efecto, el uso de esta técnica hemos publicado que hemos sido capaces de aumentar significativamente la actividad de PP2A en el pulmón sin afectar pulmón celularidad lavado 15. Lavado pulmonar celularidad tomada 24 horas después de la exposición fue comparable a los controles (27 ± 4 Control vs 31 ± 5 albúmina transfectadas, N = 6 por grupo). Además, aumenta los niveles de proteína sin inducir cambios en el desarrollo del pulmón o cambios en la arquitectura que pueden ocurrir en modelos transgénicos. Sin embargo, la necesidad de administraciones repetidas puede hacer esta técnica menos favorable para los estudios que examinan los efectos de los aumentos a largo plazo en la expresión de la proteína. Esto sería particularmente true de las proteínas con una vida media corta.

<html> Para demostrar la eficacia de nuestra técnica se utilizó una microsprayer (Penn Century) para inyectar la tráquea de los ratones con 2 mg de albúmina de ratón (Sigma) disuelto en 50 l de PBS que contenía 20 l de reactivo de transfección Pro-Ject. Los ratones tratados con albúmina se compararon con ratones que fueron tratados de manera idéntica con 2 g de proteína beta-galactosidasa (Pierce Bio). Después de veinticuatro horas los ratones fueron sacrificados y los pulmones se procesaron para el análisis histológico....

Los ratones transgénicos o vectores virales se han utilizado para aumentar la expresión de la proteína en el pulmón. Sin embargo, estas técnicas son mucho tiempo, y técnicamente difícil tener efectos fuera de objetivo que pueden confundir los resultados. Nuestro protocolo de transfección de proteína utiliza un reactivo de transfección basado en lípidos y un microsprayer ultrafino para entregar de manera uniforme proteína activa a las células pulmonares.

La transfección de proteínas de ratón de pulmón

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

El objetivo general de este procedimiento es transfectar una proteína en el pulmón del ratón. Esto se logra suspendiendo primero la proteína de interés en el reactivo de transfección del proyecto. A continuación, se anestesia un ratón y se coloca sobre una plataforma especial para la inyección.Se utiliza una fuente de luz para facilitar la inserción del microaspersor en la tráquea. Finalmente, se inyectan 50 microlitros de fluido que contiene la proteína de interés. En última instancia, esta técnica de transfección proteica se utiliza para demostrar niveles aumentados de proteína en los pulmones de los ratones.Aunque este método fue diseñado para utilizarse en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, también puede emplearse en otros estados patológicos como el asma o la fibrosis pulmonar. La demostración visual de este método es fundamental. Dado que los pasos de la inyección intratraqueal son difíciles de aprender, requieren una colocación adecuada de la vía aérea del ratón y una transiluminación de las cuerdas vocales.Comience preparando primero el reactivo de transfección de proteínas. Añada 250 microlitros de metanol o cloroformo al tubo que contiene la película seca del proyecto. A continuación, vortexee el tubo durante 10 a 20 segundos a velocidad máxima.Una vez disuelto, pipetee 20 microlitros del reactivo del proyecto en tubos separados de microcentrífuga. Coloque estos tubos bajo una campana de flujo laminar para evaporar el disolvente durante un mínimo de seis horas. A temperatura ambiente, los tubos deben quedar completamente secos.Guarde los tubos a menos 20 grados Celsius, donde permanecerán buenos durante un año. El día de la transfección, retire una alícuota del reactivo de transfección y 50 microlitros de PBS que contengan dos microgramos de la proteína de interés. Mezcle la solución mediante vortex a baja velocidad durante tres a cinco segundos, y luego incube a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarla.Cuando la proteína esté lista, anestesie un ratón para prepararlo para la administración intratraqueal. Se utiliza una plataforma especialmente diseñada para la inyección intratraqueal. Esta tiene una rampa con un ángulo de 45 grados respecto a su base y un alambre metálico que cuelga de dos ganchos en la parte superior.Una vez anestesiado, este alambre se utiliza para colgar al ratón de sus incisivos superiores. Después de asegurar al ratón, coloque una fuente de luz contra la tráquea para facilitar la visualización de las cuerdas vocales mediante pinzas y un clip de papel. Como un laringoscopio, abra el orofaringe e introduzca el catéter.Al usar el pulverizador Micros, es importante aplicar una fuerza suficiente al presionar el émbolo. De lo contrario, en lugar de generar una fina niebla, se formarán gotas que podrían obstruir la vía aérea del ratón. Una vez que todo esté en su lugar, inyecte 50 microlitros de la mezcla de proteínas a través de la tráquea utilizando un micro pulverizador tipo bolígrafo Century.En este ejemplo, se inyectaron ratones por vía intratraqueal con albúmina de ratón o beta galacto 24 horas después de la transfección proteica con beta galacto intenso. La tinción indicada aquí mediante grandes flechas se detectó dentro de las vías respiratorias de los ratones tratados con beta galacto, pero no en los ratones tratados con albúmina. Una vez dominada, esta técnica podría realizarse en 10 o 15 minutos si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar inyecciones intratraqueales en ratones para la transfección de proteínas.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón de diseminación pleural mediante la inyección de suspensión de células de cáncer de pulmón en la cavidad torácica de un ratón inmunodeficiente.

Establecimiento de un modelo murino de cáncer de pulmón pleural diseminado

Las células epiteliales bronquiales humanas primarias son difíciles de transducir. Este protocolo describe la producción de lentivirus y su concentración, así como las condiciones óptimas de cultivo necesarias para lograr transducciones altamente eficientes en estas células a lo largo de la diferenciación a un epitelio pseudoestratificado.

Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Este manuscrito proporciona una descripción de la metodología utilizada para establecer modelos de ratón de transducción-trasplante. Se da cuenta detallada de los errores técnicos que se deben evitar al realizar trasplantes de médula ósea. Se debe obtener una comprensión clara de la importancia del título viral alto, la transfección/transducción y la irradiación.

Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas

Aquí, presentamos un protocolo para promover la integración del transgén y la producción de ratones transgénicos fundador con alta eficacia por una simple inyección de lentivirales vector en el espacio perivitelino de un ovocito fertilizado.

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

Aquí describimos un modelo de trasplante orthotopic syngeneic mínimamente invasivo de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón como un modelo de reducción de costos y tiempo para el estudio de cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Trasplante ortotópico de células de Adenocarcinoma de pulmón Syngeneic para estudiar la expresión de PD-L1

Este protocolo describe las medidas tomadas para inducir tumores pulmonares KRAS en ratones, así como la cuantificación de tumores formados por imágenes por ultrasonido. Los tumores pequeños se visualizan en los primeros puntos de tiempo como líneas B. En momentos posteriores, las mediciones relativas del volumen del tumor se logran mediante la herramienta de medición en el software de ultrasonido.

Detección de la progresión del tumor pulmonar en ratones por imágenes por ultrasonido

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

Aprende la transfección de proteínas en pulmón de ratón utilizando un microspray ultrafino y reactivos lipídicos. Este método eficiente minimiza efectos secundarios y mejora la expresión proteica en estudios pulmonares.

La transfección de proteínas de ratón de pulmón

Explorar más videos