Name: Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a encapsular células β pancreáticas en hidrogeles de PEG-péptido mediante fotopolimerización tiol-eno y recuperarlas con tripsina para análisis biológicos posteriores.

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Este proyecto fue financiado por el NIH (R21EB013717) y IUPUI OVCR (RSFG). El autor agradece a la Sra. Han Tzu por su asistencia técnica.

A. Síntesis de péptidos y Macrómero <ol><li> Sintetizar 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y arylphosphanate fotoiniciador de litio (LAP) utilizando protocolos establecidos. 18,19 </li><li> Sintetizar bis-cisteína que contiene quimotripsina sensible al péptido CGGY ↓ C (la flecha indica el sitio de escisión quimotripsina) utilizando estándar de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Calcular la cantidad de resina (Rink-amida resina MBHA) necesario en base a la relación de sustitución de la resina y la escala de síntesis. Hinchar la resina en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de reacción (RV) durante 15 min. </li><li> Eliminar el grupo protector Fmoc de la resina usando una solución de desprotección que contiene 20% de piperidina y 0,1 M de HOBt en DMF. Utilizar los parámetros enumerados en la tabla siguiente para asistida por microondas Fmoc-desprotección (para todos los ácidos Fmoc-aminoácidos): <table border="1"><tbody><tr><td> Síntesis escala </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td></tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tiempo </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Después de la desprotección, enjuague de la resina con DMF y realizar la prueba de ninhidrina para confirmar la eliminación de Fmoc (exposición de amina N-terminal). Resina debe ponerse azul después de 2 min a 95 ° C. </li><li> Después de la desprotección con éxito par, la primera Fmoc-aminoácido en el extremo C-terminal (síntesis va de C a N-terminal) en una solución de base activador (0,28 M diisopropiletilamina (DIEA) en DMF) con los parámetros enumerados en la tabla siguiente . <table border="1"><tbody><tr><td> Síntesis escala </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> * Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tiempo * </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Para quiste y Su, use 50 ° C y 10 minutos para reducir la racemización. </li><li> Enjuagar la resina y realizar una prueba de ninhidrina para confirmar cualitativamente la finalización de acoplamiento (desaparición de amina N-terminal). Resina debe ser clara después de 5 min a 95 ° C. Repita el paso de acoplamiento (A.2.d) si la prueba de ninhidrina devuelve un resultado positivo (color azul). </li><li> Desprotección repetición (paso A.2.b) y el acoplamiento (A.2.d paso) para aminoácidos adicionales en la secuencia termina con una etapa de desprotección final. </li><li> Escurrir la RV, enjuague resina con 25 ml de diclorometano (DCM). Este paso es para enjuagar DMF, que es una base y obstaculizará escisión del péptido. </li><li> Preparar un cocktail de escisión mediante la mezcla de 250 mfenol en 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) y 0,125 ml ddH 2 O. g </li><li> Añadir solución de escisión en el RV y escindir durante 30 minutos en el sintetizador de péptidos de microondas (potencia = 20 W; Temperatura = 38 ° C). </li><li> Recoger la solución de péptido en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando colector de vacío. </li><li> Péptido escindido precipitado en 40 ml de éter, el tubo vortex y se centrifuga a 3.000 rpm durante 5 min para recoger el péptido. </li><li> Vaciar el sobrenadante y repetir A.2.k paso dos veces. </li><li> Recoger y secar péptido en el vacío. </li><li> Se purifica el péptido mediante HPLC y caracterizar con espectrometría de masas. </li></ol></li></ol> B. Preparación de Material y Esterilización <ol><li> Preparar solución en peso PEG4NB 20% en PBS, vórtice la mezcla hasta que se disuelve completamente el macrómero, y esterilizar la solución de macrómero utilizando un filtro de jeringa. Guarde la solución se esterilizó a -20 ° C (preparar alícuotaspara almacenamiento a largo plazo). </li><li> Preparar y esterilizar fotoiniciador 2% en peso (LAP) en solución de PBS. Almacenar la solución esterilizada a temperatura ambiente protegido de la luz. </li><li> Disolver el péptido (CGGYC) en PBS, la mezcla de vórtice y filtro de jeringa de la solución para la esterilización. Alícuota de la solución de péptido y se almacena a -20 ° C hasta su uso (evitar ciclos de congelación-descongelación). </li><li> Determinar tiol (-SH) concentración en la solución de péptido preparado usando el reactivo de Ellman (seguir el protocolo del fabricante). Este paso dará la concentración de péptido exacta (es decir, [SH] / 2) que se requiere para el cálculo de la cantidad de péptidos a usar en tiol-eno de fotos clic reacciones. </li><li> Preparar los moldes de gelificación por el corte de la porción superior fuera de jeringas de 1 ml estériles desechables usando una hoja de afeitar (punta abierta para la eliminación de gel). Esterilizar los moldes de jeringa por autoclave. </li><li> Basado en la formulación de gel deseada (relación de tiol a eno = 1) y las concentraciones de compañero de stockriales, calcular el volumen requerido de polímero, agente reticulante péptido, fotoiniciador, y soluciones de tampón requerido. </li></ol> C. Preparación de la célula <ol><li> Equilibrar medio de cultivo celular (alta glucosa DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino; antibiótico-antimicótico con 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 250 ng / ml de Fungizone, y 50 mM β mercaptoetanol-), Hank de solución salina equilibrada ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + libre) y tripsina-EDTA a 37 º C. </li><li> Retirar frascos que contienen MIN6 β-células de CO 2 incubadora y colocar los frascos en la campana de flujo laminar. </li><li> Aspirar los medios de cultivo de células de los matraces y lavar la cubeta con HBSS. </li><li> Tripsinizar las células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA y se incuban los matraces durante 4 min a 37 ° C y 5% CO 2. <ul><li> Nota: Utilice 2X solución de tripsina permite la disociación completa de MIN6 β-células en suspensión de células individuales. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Después de la incubación, los matraces toque en la superficie de la campana suavemente para desprender completamente las células. Confirmar el desprendimiento y la disociación de las células utilizando un microscopio. </li><li> Añadir un volumen igual de medio de cultivo celular para neutralizar la tripsina. Mezclar bien la solución mediante pipeteo suave, a continuación, transferir la mezcla a un tubo de centrífuga y canónica durante 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente las células en 4 - 5 ml de medios de cultivo. </li><li> Determinar la densidad celular usando Trypan 50% tampón azul en un hemocitómetro. </li></ol> D. Fabricación de hidrogel y encapsulación de células <ol><li> Una vez que las células están listas, mezcla (basado en una relación de 1:1 a tiol eno) los volúmenes requeridos de PEG4NB, CGGYC, LAP, solución de células, y HBSS en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Mezclar la solución suavemente con una pipeta para obtener una mezcla homogénea y añadir 25 ml de la solución resultante a un molde de jeringa. Exponer la jeringa a la luz UV (365nm, 5 mW / cm 2) durante 2 min. </li><li> Después de fotopolimerización, geles de inmersión en una solución estéril de 24 pocillos placa que contiene medio de cultivo celular y se incuban los hidrogeles en 37 º C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar los hidrogeles de células cargadas en medio de cultivo celular durante 30 minutos para enjuagar las células poco adheridas y macrómeros no reticulado. Transferir los geles en medio fresco. </li><li> Actualizar medios de cultivo celular cada 2 a 3 días. </li></ol> E. Ensayo de Viabilidad Celular Morfología celular encapsulado se puede observar al microscopio de luz (ya que los hidrogeles sintetizados son transparentes). La viabilidad celular se puede visualizar y medir cualitativamente usando Live / Dead manchas y cuantitativamente utilizando el reactivo AlamarBlue. E.1. Live / Dead tinción <ol><li> Descongelar Live / Dead reactivos de tinción a temperatura ambiente. </li><li> En un tubo canónica añadir PBS de acuerdo con el número de muestras (n) a ser teñido: <strong&gt; volumen total de PBS = n × 500 l </li><li> Pipetear 0,25 l de calceína AM y 2 l de EthD-1 por 1 ml de PBS al tubo canónica que contiene PBS. Vortex la solución para mezclar los componentes. </li><li> Incubar células cargadas de hidrogeles en solución de tinción LIVE / DEAD (0,5 ml / muestra) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, se retira la solución colorante y enjuagar la muestra dos veces con PBS. </li><li> Colocar la muestra en un cubreobjetos o portaobjetos de vidrio. Observar y celdas de imagen con un microscopio confocal. </li></ol> E.2. AlamarBlue Ensayo <ol><li> Preparar 10 v / v% AlamarBlue solución en medio de cultivo celular. </li><li> Eliminar los hidrogeles de la incubadora y aspirar los medios de comunicación de cada pocillo sin hacer contacto con el hidrogel. </li><li> Incubar células cargadas de hidrogeles y un (control negativo) se vacía bien en 500 l de 10% de solución de AlamarBlue durante 16 horas. </li><li> Después de la incubación, pipeta 200 lde la solución de AlamarBlue en una placa de 96 pocillos y la fluorescencia medida usando un lector de microplacas (excitación: 560 nm, emisión: 590 nm). <ul><li> Actividad metabólica celular Superior reduce el tinte para dar mayor lectura de fluorescencia. </li><li> Asegúrese de incluir por lo menos dos pozos de solución al 10% alamarBlue como espacios en blanco. Al analizar los datos, se resta el valor de fluorescencia promedio en blanco de la lectura de la fluorescencia de las muestras. </li></ul></li></ol> F. La quimotripsina mediada Gel Erosión y recuperación Esferoide <ol><li> Preparar 1 mg / ml de tripsina libre de α-quimotripsina solución en HBBS y solución estéril de filtro. </li><li> Incubar hidrogeles en solución quimotripsina (500 l para cada gel) a temperatura ambiente con agitación suave hasta que la erosión del gel completo se logra. <ul><li> Para un gel de 25 l, el tiempo para la erosión total es de aproximadamente 5 min. </li></ul></li><li> Colocar la placa en hielo durante unos minutos para reducir la actividad de losquimotripsina. </li><li> Transferir la solución de células en un tubo de 1 ml y se centrifuga a 300 rpm, 4 º C durante 2 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de pastos y resuspender suavemente los esferoides en HBSS. </li><li> Transferir la solución recuperada esferoide a una placa de 24 pocillos y coloque la placa en hielo para permitir que los esferoides para establecerse. </li><li> Para el análisis de tamaño, adquirir imágenes de contraste de fase de los esferoides se establecieron utilizando un microscopio óptico. Medida recuperado diámetro esferoidal utilizando un programa como elemento de Nikon o software ImageJ. </li></ol> G. Ensayo Funcional de esferoides recuperados G.1. Glucosa estimulada por insulina, la secreción de los esferoides de células recuperadas <ol><li> En una placa de 24 pocillos, se incuban los geles en 500 l de 2 mM de glucosa bajo Kerbs-Ringer (KRB) durante 1 hora. </li><li> Erode el gel y recuperar esferoides celulares usando pasos F.1 a F.6. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente sin hacer ningúncontacto con los esferoides de células y resuspender los esferoides en 500 l de 2 KRB mM glucosa baja. </li><li> Transferir 100 l de solución de células esferoides a un tubo de 0,6 ml y colocarlo en hielo durante intracelular cuantificación ATP. </li><li> Dividir la solución de células restante esferoide en un medio (en dos tubos de microcentrífuga) y centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm y 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante (casi hasta el fondo) y resuspender el medio primero de esferoides de células en 1 ml de 25 mM glucosa KRB alto y medio segundo en 1 ml de 2 mM KRB bajo en glucosa. </li><li> Suavemente la pipeta y transferir la solución que contiene recuperados esferoides de células a una placa de 24 pocillos. Incubar la placa durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Después de la incubación, transferir la solución a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga durante 2 min a 1.000 rpm y 4 ° C. </li><li> Transferir 500 l del sobrenadante del tubo se centrifugó a otro tubo de microcentrífuga y se almacena a 4 ° C durante la insulinaELISA. </li><li> Realizar protocolo de insulina fabricante ELISA siguiente. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Ensayo <ol><li> Normas ATP: Preparar una solución de 10 mM ATP y realizar diluciones en serie para obtener una serie de soluciones estándar 8. </li><li> Para un color blanco placa de 96 pocillos, se añaden 50 l de solución de células esferoide (del paso G.1.6) y las normas. </li><li> A cada pocillo que contiene muestras y estándares, se añaden 50 l de reactivo CellTiter Glo e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Después de la incubación, el recuento de medida de la luminiscencia de las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas y calibrar muestra las concentraciones de ATP utilizando una curva de regresión lineal generado por los estándares de ATP. </li><li> Determine el total de la concentración de ATP en la muestra y se multiplica por el factor de dilución de la muestra para obtener la concentración intracelular de ATP en una célula cargada de hidrogel. </li></ol> G.3. Determinar la secreción de insulina <ol><li> Calcular la amount de insulina secretada a partir de los esferoides recuperados tomando la relación de la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa mayor a la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa baja. </li><li> Normalizar el contenido de insulina cuantificada de esferoides de células con cantidad respectiva de ATP intracelular de los esferoides de células recuperadas. </li></ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+controlled+release+formulations%3A+network+design+and+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li>
<li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophil+elastase+responsive+delivery+from+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+beta-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments.</a> Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+mimicry+with+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li>
<li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5%27-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li>
<li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K-sensitive+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li>
<li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+science.+Polymer%22%5BJournal%5D)">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li>
<li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-click+chemistry%3A+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo descrito presenta detalles sobre la encapsulación fácil de células en tiol-eno hidrogeles formados por fotopolimerización por crecimiento en etapas. Mientras que una relación estequiométrica de 1:1 de norborneno de grupos funcionales tiol se utilizó en este protocolo, la relación puede ser ajustada dependiendo de los experimentos. Además de una formulación correcta, es importante para mantener la homogeneidad en la solución de pre-polímero. En particular, el uso pipeteo suave para asegurar que las células e...

Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados con un potencial excepcional como los materiales del armazón para tejidos reparación y regeneración. 1-3 El alto contenido de agua de los hidrogeles permite la fácil difusión de oxígeno y el intercambio de nutrientes y productos metabólicos celulares, todas las cuales son cruciales para mantener la viabilidad celular. Además, los hidrogeles son excelentes portadores para la liberación controlada y suministro de células debido a su alta capacidad de ajuste. 2 hidrogeles sintéticos tales como los preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) se utiliza cada vez más en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en gran parte debido a su cytocompatibility, tejido- como elasticidad, y capacidad de sintonización de alta en el material de propiedades físicas y mecánicas. 4-6 Aunque una plataforma de hidrogel de uso común, los estudios han demostrado que el PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por photopolymerizations crecimiento de cadena tienen una tendencia a dañar las células encapsuladas during reticulación de la red y en la encapsulación de células in situ. 7 El daño celular se atribuyó en gran medida a las especies de radicales generados por las moléculas de fotoiniciador, que se propagan a través de los grupos vinilo sobre PEGDA para reticular las cadenas de polímero en hidrogeles. Desafortunadamente, estas especies de radicales también causar tensiones y daño celular durante la encapsulación de células, especialmente para las células sensibles a radicales tales como el de páncreas β-células. 8-10 Con el fin de obtener un tamaño de malla más alta para una mejor difusión y la supervivencia celular, pesos moleculares más altos PEGDA se utilizan a menudo para la encapsulación de células. Esto, sin embargo, compromete la cinética de polimerización y causa sub-óptimas propiedades de gel biofísicos. 7,11,12 Además de las desventajas anteriormente mencionadas, es muy difícil de recuperar las estructuras celulares a partir de hidrogeles PEGDA debido a la naturaleza heterogeneidad y no degradable de las redes reticuladas. Mientras sensibles a la proteasa péptidos pueden ser incorporadosen esqueleto de PEG macrómero para hacer que los hidrogeles PEGDA otra parte inertes sensibles a la escisión enzimática, la conjugación a menudo usa reactivos caros y las redes resultantes contienen todavía alto grado de heterogeneidad debido a la naturaleza de la polimerización de crecimiento de cadena. 13-15 Recientemente, PEG-péptido hidrogeles formados a través de tiol-eno por crecimiento en etapas de fotopolimerización se ha demostrado que exhiben propiedades preferentes para la encapsulación de células a través de los hidrogeles formados por fotopolimerización crecimiento de cadena. 7 La cinética de gelificación superiores de tiol-eno hidrogeles se atribuye al clic &quot; &quot;la naturaleza de la reacción entre tiol y funcionalidades ENE. En comparación con la polimerización de crecimiento de cadena PEGDA, tiol-eno de reacción es menor de oxígeno inhibe la que los resultados de la tasa de gelificación más rápido. 16,17 tiol-eno hidrogeles también tienen una mayor eficiencia de polimerización y mejores propiedades biofísicas de gel en comparación con PEGDA crecimiento de cadena hidrogeles, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt;, que se traduce en un daño limitado celular causada por especies de radicales durante la fotopolimerización. Anteriormente, tiol-eno hidrogeles formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y bis-cisteína que contienen reticulantes de péptidos, tales como péptidos sensibles a proteasa se ​​han utilizado para encapsulación de células. 7,18 tunability alta de las redes de hidrogel de PEG ofrece una microambiente 3D flexible y controlable para investigar la supervivencia celular y la actividad, mientras que el uso de proteasa sensible a la secuencia del péptido proporciona una manera suave para la recuperación de las construcciones de células formadas naturalmente dentro de los hidrogeles. En este protocolo, se utilizan por crecimiento en etapas fotopolimerizado tiol-eno hidrogeles fabricados usando 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGY ↓ C) para la encapsulación de las células MIN6 β. Este protocolo sistemáticamente elabora técnicas para el estudio de la formación de la supervivencia, proliferación y esferoide de MIN6β-células en tiol-eno hidrogeles. Además proveímos método para la recuperación de las células β esferoide y caracterización biológica de los esferoides recuperados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 4-brazo PEG (20 kDa) </td><td> Jenkem Tecnología de EE.UU. </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-aminoácidos </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead celular kit de viabilidad </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Incluye calceína AM y homodímero de etidio-1 </td></tr><tr><td> AlamarBlue reactivo </td><td> AbD Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo reactivo </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Sin Ca +2 y Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> SinCa +2 y Mg +2 </td></tr><tr><td> DMEM alto en glucosa </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina libre de α-quimotripsina </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón Inusin kit ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml jeringa desechable </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación y recuperación de β-células esferoides de peg-péptido de crecimiento paso hidrogeles

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Los hidrogeles son polímeros reticulados hidrófilos que proporcionan un microentorno tridimensional con tejido-como elasticidad y alta permeabilidad para el cultivo de células o tejidos terapéuticamente relevantes. Los hidrogeles preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) derivados se utilizan cada vez más para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, en parte debido a sus propiedades sintonizables y citocompatible. En este protocolo, se utilizó tiol-eno de crecimiento paso a photopolymerizations para fabricar PEG-péptido hidrogeles para encapsular pancreático MIN6 células b. Los geles fueron formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGYC). La naturaleza hidrófila y no la formación de incrustaciones de PEG ofrece un microambiente citocompatible para la supervivencia y la proliferación celular en 3D, mientras que el uso de la secuencia del péptido con quimotripsina sensible (C GGY ↓ C, flecha indica el sitio de escisión de enzima, mientras que el quiste terminalesresiduos eine se añadieron para tiol-eno reticulación) permite una rápida recuperación de los constructos de células que forman dentro del hidrogel. El siguiente protocolo elabora técnicas para: (1) La encapsulación de MIN6 β-células en tiol-eno hidrogeles, (2) ensayos de células cualitativos y cuantitativos de viabilidad para determinar la supervivencia y la proliferación celular; (3) Recuperación de esferoides de células usando quimotripsina mediada gel erosión, y (4) Análisis estructural y funcional de los esferoides recuperados.

<html> Las figuras 1-4 muestran los resultados representativos para la encapsulación, la supervivencia, la proliferación, la formación de esferoides, y la recuperación esferoide en tiol-eno hidrogeles. Figura 1 muestra el esquema de reacción de (1) por crecimiento en etapas tiol-eno fotopolimerización usando PEG4NB y CGGYC, y ( 2) quimotripsina erosión gel mediada que sigue un mecanismo de erosión de la superficie. Figuras 2 y 3 los resultados de viabili...

El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar técnicas para encapsular células en hidrogeles fotopolimerizados, así como la posterior recuperación del pH de las células beta formadas naturalmente a partir de los hidrogeles sensibles a las enzimas a partir de la caracterización biológica. Esto se logra mezclando primero las seis células beta mins con una clavija en el antebrazo, norbertina macer y un reticulante de péptidos sensible a las enzimas. A continuación, las células se encapsulan utilizando fotopolimerizaciones mediadas por radicales libres y luego fotopolimerizaciones para formar un hidrogel.El segundo paso es cultivar células encapsuladas en hidrogeles en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Una vez que las células han proliferado para formar agregados, los hidrogeles cargados de células se enjuagan con una solución tampón y luego se incuban en una solución de chía y tripsina. Bajo una suave agitación para la erosión del gel, los agregados recuperados se lavan cuidadosamente para eliminar la solución enzimática y el polímero erosionado.En última instancia, estos agregados celulares se pueden utilizar para el análisis estructural y funcional. Por lo tanto, la principal ventaja del crecimiento escalonado y luego de la fotoquímica es que sus condiciones de reacción son más suaves que el crecimiento en cadena tradicional PEG dde. Por lo tanto, los hidrogeles proporcionan un excelente microambiente para muchos tipos de células, incluidas las células beta pancreáticas.La implicación de esta técnica se extiende a varias terapias basadas en células, ya que este sistema DIN proporciona un excelente microambiente para experimentos in vitro y una gran plataforma para la administración de células. Mientras sintetizamos los péptidos utilizados en estos experimentos en nuestro laboratorio, hay muchas empresas de las que se pueden obtener los reticulantes de péptidos que describimos. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de PEG al 20% de cuatro NB en el vórtice de PBS de la mezcla hasta que el rimer se disuelva por completo.A continuación, pase la solución de Kermer a través de un filtro de jeringa para esterilizarla y almacene Eloqua a menos 20 grados centígrados hasta que lo necesite. A continuación, prepare una solución al 2% del fotoiniciador fosfonato de arol de litio en PBS. Pase la solución fotoiniciadora a través de un filtro de jeringa y almacene la solución esterilizada a temperatura ambiente, protegida de la luz.Otro paso preparatorio es disolver el reticulante del péptido sensible a la crisina en PBS y filtrar la solución con una jeringa para la esterilización. Las alícuotas adicionales se almacenan a menos 20 grados centígrados. Determine la concentración del grupo hidro de sulfo en la solución peptídica preparada utilizando el reactivo de Elman de acuerdo con el protocolo del fabricante.A continuación, prepare los moldes de ación cortando la porción superior de un centímetro de jeringas desechables estériles de un mililitro. Con una cuchilla de afeitar se volvieron a esterilizar los moldes de la jeringa. Usando un autoclave, prepare una hoja de cálculo que contenga los cálculos de la formulación de gel deseada, incluido el volumen y la concentración de los materiales madre, incluido el péptido polimérico, el reticulante, el fotoiniciador y las soluciones tampón.Primer cultivo celular precalentado, solución salina balanceada de madeja media y dos viajes x en EDTA a 37 grados Celsius. A continuación, retire los matraces de un mínimo de seis células beta de la incubadora y colóquelos en la campana de flujo laminar. Después de aspirar los medios de cultivo celular de los matraces, enjuague las células con tanques precalentados, equilibre la solución salina.A continuación, pruebe a congelar las células con tres mililitros de precalentamiento, dos viajes x en EDTA e incube los matraces durante cuatro minutos. Después de la incubación, golpee suavemente los matraces en la superficie de la campana para separar completamente las celdas. Confirmar el desprendimiento y disociación de las células bajo un microscopio.A continuación, agregue un volumen igual de medio de cultivo celular. Para neutralizar la tripsina, mezcle bien la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera la mezcla a una centrífuga de tubo cónico estéril, introduzca la suspensión celular durante cinco minutos a 200 RCF después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en cuatro a cinco mililitros de cultivo precalentado. Medio.Finalmente, determine la densidad celular mezclando parte de la suspensión celular con azul triano al 50% y contando las células con un hemocitómetro. Una vez que las celdas estén listas, mezcle los volúmenes requeridos de fotoiniciador de reticulación de péptido PEG cuatro y B a una concentración final de celdas de un milimolar y HBSS en un tubo de microcentrífuga basado en una proporción de TH a EEN de uno a uno y mezcle suavemente mediante pipeteo. En esta demostración se utiliza un 4%PEG cuatro y B.A continuación, pipetee 25 microlitros de la solución resultante en cada molde de jeringa. Exponga los moldes de jeringa a una luz ultravioleta de 365 nanómetros a una potencia de cinco milivatios por centímetro cuadrado durante dos minutos. Para polimerizar el gel después de la fotopolimerización, sumerja los geles en una placa estéril de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio de cultivo celular e incube los hidrogeles a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para enjuagar las células sueltas o las macros no reticuladas.Después de 30 minutos, retire la placa de la incubadora y transfiera los geles a un mililitro de medio fresco. Actualice los medios cada dos o tres días. Prepare una solución enzimática de miligramo por mililitro agregando una solución de sal equilibrada de Hanks a la tripsina alfa chimi sin tripsina.A continuación, esterilice la mezcla con un filtro de jeringa. A continuación, retire la placa de cultivo de la incubadora y enjuague los geles con la solución salina equilibrada de Hank. A continuación, añada 500 microlitros de solución de tripsina a cada pocillo, a continuación, incube a temperatura ambiente agitando suavemente en un agitador durante aproximadamente cinco a 10 minutos para lograr la erosión completa del gel.Una vez que el gel esté completamente disociado, coloque la placa en hielo durante unos minutos para reducir la actividad de la tripsina CH. El siguiente paso es transferir la suspensión celular a un tubo de un mililitro y centrifugar lentamente a 45 RCF y cuatro grados Celsius durante dos minutos. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de PEI y suspenda suavemente el esteroide en la solución salina equilibrada de Hank.Luego, transfiera la solución de esteroides recuperada a una nueva placa de 24 pocillos y coloque la placa en hielo durante cinco a 10 minutos para permitir que el esteroide se asiente y se adhiera a la superficie para el análisis de tamaño. Adquiera imágenes de contraste de fase de los esferoides sedimentados utilizando un microscopio óptico, mida los diámetros de los esferoides recuperados utilizando software como el software de elementos de Nikon o la imagen J. Este método de encapsulación garantiza una alta viabilidad celular inicial cuantificada por la tinción de muertos vivos. Con el tiempo en el cultivo celular, el metabolismo celular medido por alamar, reactivos azules aumentó durante un período de 10 días en todas las concentraciones estudiadas.Después de 10 días en cultivo celular, los esteroides aumentaron de tamaño y aún mantuvieron una alta viabilidad celular. En los hidrogeles, el hidrogel peptídico PEG apoyó la supervivencia y proliferación de las células beta encapsuladas, que se muestran aquí después de 10 días en cultivo, en recuperación somática con alfa chim tripsina libera los esteroides de la matriz de hidrogel, produciendo una distribución estrecha de tamaños de esteroides que son independientes de la concentración de la matriz. Estos esteroides se pueden usar para caracterizaciones y aplicaciones adicionales mientras se intenta este procedimiento.Es importante mantener la homogeneidad en la solución de prepolímero durante la encapsulación para garantizar que las células estén bien distribuidas. Siguiendo este procedimiento, las células recuperadas se pueden caracterizar utilizando otras técnicas como la inmunotinción de montaje completo y el Western blot para estudiar el efecto de la condición de la matriz de hidrogel en la expresión y el fenotipo de las proteínas celulares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo encapsular células en hidrogeles, así como cómo recuperar las células de los geles para caracterizaciones biológicas adicionales.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

Aquí, presentamos una metodología para generar y administrar microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas de interés a islotes de ratón intactos en cultivo con el posterior análisis de inmunofluorescencia de la proliferación de células β. Este método es adecuado para determinar la eficacia de los mitógenos candidatos a β células.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

El cáncer de páncreas sigue siendo uno de los cánceres más difíciles de tratar. Por lo tanto, es fundamental que los modelos preclínicos que evalúan la eficacia del tratamiento sean reproducibles y clínicamente relevantes. Este protocolo describe un procedimiento simple de cocultivo para generar esferoides desmoplásticos reproducibles y clínicamente relevantes.

Cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Aprende a encapsular células β pancreáticas en hidrogeles de PEG-péptido mediante fotopolimerización tiol-eno y recuperarlas con tripsina para análisis biológicos posteriores.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

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