Métodos experimentales para probar los efectos del péptido neurotrófico, ADNF-9, contra la apoptosis inducida por el alcohol durante el embarazo en C57BL / 6 ratones

El objetivo de este procedimiento es evaluar los efectos neuroprotectores de los péptidos tróficos en un modelo de exposición fetal al alcohol. Esto se logra apareando primero a los animales de experimentación y luego tratando a las hembras embarazadas con péptidos tróficos, como segundo paso, los fetos se diseccionan para aislar los cerebros fetales para usos experimentales. A continuación, los cerebros fetales se sumergen en gelatina para su seccionamiento, seguido de una tinción en túnel para determinar la muerte celular, se obtuvieron los resultados.

Esto demuestra que la exposición prenatal al alcohol aumenta el número de células de túnel positivo en la eminencia ganglionar. En comparación con la administración del péptido trófico en el grupo de control, un D y F nueve redujeron significativamente el aumento inducido por el alcohol en las células tunnel positivas en comparación con los animales de control tratados con alcohol. Por lo tanto, la demostración visual de este metal es fundamental, ya que la disección del cerebro fetal y los pasos incrustados son difíciles de aprender porque los cerebros fetales son muy pequeños para diseccionar y procesar la sección de ratones negros de seis negros de primera raza C 57 colocando ratones hembra de seis semanas de edad de alrededor de 20 gramos en jaulas domésticas masculinas durante dos horas inmediatamente después de la extracción.

Revise cada hembra para ver si hay un tapón de esperma para confirmar que se ha producido el apareamiento. Si hay un tapón de espermatozoides, designe este día cero embrionario en E siete pesos para que las hembras embarazadas se dividan en cuatro grupos. Un grupo de dieta líquida y alcohólica proporcionó acceso libre como única fuente de nutrientes.

Dos grupos de control Perfed grupo de tratamiento de tres péptidos, que deben recibir una inyección intraperitoneal de un péptido DNF nueve junto con la exposición al alcohol. Dieta líquida. Registre el volumen de dieta líquida consumida por los animales en 24 horas a partir de tubos de rosca graduados de 30 mililitros para determinar la cantidad diaria de alcohol, dieta líquida o dieta líquida emparejada que se puede proporcionar a través de un exceso libre como única fuente de nutrientes.

Asegúrese de que se le proporcione una dieta líquida recién preparada diariamente desde E 7 hasta E 13 después de sacrificar a la embarazada Myer E 13 mediante eutanasia con dióxido de carbono, seguida de dislocación cervical. Coloque el cadáver en la tabla de disección en posición supina y limpie el abdomen con etanol al 70%. Use tijeras y fórceps estériles para hacer una incisión abdominal.

Una vez que el abdomen esté abierto, sostenga el útero con fórceps y use una segunda pinza para separar lenta y suavemente el endometrio del útero sin perforar los embriones. Retire con cuidado los embriones del útero y transfiéralos a la solución de clasificación equilibrada de Hank En un plato de cultivo celular de 60 milímetros por 15 mililitros sobre hielo húmedo, coloque el plato y el recipiente de hielo en el escenario de un microscopio estereoscópico utilizando pinzas ultrafinas para la microdisección. Retira la piel de los embriones en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.

Una vez que el cráneo esté expuesto y claramente visualizado bajo el microscopio estereoscópico, agarre la base del cráneo a nivel de la médula espinal y el tronco encefálico con pinzas y comience a despegar el cráneo. Continúe despegando el cráneo pieza por pieza, desde la parte posterior hasta la anterior de la cabeza. Una vez que el cerebro esté completamente expuesto, use fórceps para extraerlo.

A continuación, diseccionar el cerebro fetal desde la base del bulbo primordial o de fábrica hasta la base del Met Postfix, todos los cerebros fetales diseccionados en 4% de paraldehído durante dos o tres días. Los cerebros fetales también se pueden congelar si se analizan para Western blot o ensayos enzimáticos. Después de preparar una solución al 10% de gelatina de grado A preparada en agua destilada, llene un molde de incrustación de cáscara hasta la mitad y espere hasta que la gelatina se solidifique.

Coloque los cerebros fetales de control y tratados prenatalmente uno al lado del otro encima de la gelatina solidificada. Esto es para mantener condiciones consistentes entre los grupos de control y experimental. Asegúrese de que la gelatina no esté demasiado caliente y agregue gelatina líquida encima de los cerebros fetales para hacer un molde completo.

El molde final debe parecerse a esta imagen, refrigere el molde de gelatina preparado que contiene los cerebros fetales durante 15 minutos. A continuación, retire el plástico del molde de inclusión. El molde final debe verse así y luego transferir la gelatina que contiene cerebros fetales al 4% de paraldehído durante dos días.

Al tercer día, coloque un bloque de gelatina que contenga cerebros fetales fijos en la etapa del viome. A continuación, seccione los cerebros con un vioma de 25 a 50 micras de grosor para el corte coronal. Recoja las secciones del cerebro fetal en PBS, luego monte las secciones del cerebro fetal en súper heladas más portaobjetos en agua y déjelas secar durante 15 minutos.

Transcurridos 15 minutos. Coloque los portaobjetos en PBS para la prueba de reacción en túnel al día siguiente. Primero, sumerja los portaobjetos en una solución de 20 microgramos por mililitro de proteinasa K y PBS durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Luego enjuague tres veces en PBS durante cinco minutos cada una en un agitador orbital. Incubar las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitar. A continuación, lave los portaobjetos como antes.

A continuación, incube las secciones en una solución permeable durante dos minutos en hielo. Después de la incubación, lavados dos veces en PBS. Al igual que antes, use un pañuelo de laboratorio para secar el área del portaobjetos alrededor de las secciones.

A continuación, utiliza un bolígrafo para dibujar alrededor de las secciones de la diapositiva. Esto evita la fuga de la solución de tinción, lo que permite utilizar un pequeño volumen. Incubar una sección en cada par con una mezcla de reacción en túnel preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Añada una solución portadora sin reactivo túnel a la sección de control negativo. A continuación, incubar los portaobjetos durante una hora a 37 grados centígrados. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, lavar los portaobjetos tres veces en PBS en un agitador orbital como antes.

Luego, seque el área alrededor del tejido con una toallita de laboratorio. A continuación, incubar las secciones con una solución de POD convertidor durante 30 minutos a 37 grados centígrados sin agitar. A continuación, enjuague las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con tris HCL.

Transfiera los portaobjetos a un soporte y colóquelos en un frasco de coplin que contenga 0,05 % de DAB y 0,003 % de peróxido de hidrógeno. Cubra el frasco con papel de aluminio y colóquelo en un agitador orbital sobre hielo durante siete minutos después de la incubación, lavando PBS como antes si lo desea. Las diapositivas se pueden almacenar en PBS antes de proceder a la tinción del contador de misiles, como se detalla en la parte de texto del protocolo.

Las siguientes imágenes muestran los efectos del péptido neurotrófico A DNF nueve contra la apoptosis inducida por el alcohol utilizando un ensayo de túnel en la eminencia ganglionar ya que la exposición prenatal al alcohol en la etapa E 13 indujo aumentos en la muerte celular como lo indican las puntas de flecha en el grupo A LC en comparación con el grupo PF. La administración de A D NF NINE junto con la exposición prenatal al alcohol indujo una disminución de las células túnel positivas. El análisis estadístico demostró que la administración de AD y F nine previno los aumentos inducidos por el alcohol en las células del túnel positivo.

Los valores se muestran como medias más menos error estándar de la media. Un solo asterisco indica un valor P inferior a 0,052. El asterisco indica un valor de P inferior a 0,01 mediante la prueba post hoc de Newman Coles.

Cada grupo contenía un N de cuatro. Entonces, después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores y al campo del desarrollo del cerebro explorar los efectos de los medicamentos o compuestos y el desarrollo del cerebro en ratones.