Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

En este video se presentará un protocolo muy simple y eficiente para obtener suspensión celular de material de prueba de roedores en solo 15 minutos. El método se ha aplicado a las pruebas de ratón, ratas y conejillos de indias y utiliza un dispositivo de máquina meta para desagregar el tejido encapsulado. Después de una filtración y tinción, la célula está lista para el flujo.

La homogeneidad de las poblaciones celulares es un requisito previo para el análisis de eventos bioquímicos y moleculares durante la diferenciación de AG masculino. Por lo tanto, la heterogeneidad testicular con más de 30 tipos diferentes de células representa uno de los principales problemas relacionados con el estudio de las bases moleculares de la espermatogénesis de los mamíferos. Por esa razón, se han utilizado varios métodos para obtener poblaciones de células testiculares enriquecidas a purificadas, incluyendo PU e ilustración centrífuga.

El primer paso para cualquier método de separación celular es la preparación de una suspensión celular. Sin embargo, los protocolos actuales suelen llevar mucho tiempo y pueden implicar la pérdida de moléculas de vida corta, como los ARN, lo que no es deseable para el análisis de expresión posterior. La principal ventaja del protocolo presentado aquí es que elimina los pasos entre el sacrificio de animales y los estudios moleculares específicos de la etapa de espermatozoides, pero al mismo tiempo garantiza una buena calidad y una excelente representación del tipo celular en las suspensiones celulares.

La demostración del procedimiento estará a cargo de la Dra. Ana Rodríguez, investigadora del Laboratorio AL que desarrolló el método y de la citometría de flujo Federico San López que estuvieron a cargo del análisis citométrico. El procedimiento requiere un pequeño equipo, el sistema de meloco, con sus accesorios medicon y fcon. Sin embargo, los accesorios fcon pueden sustituirse perfectamente por membranas de nailon del mismo tamaño de poro.

Los únicos otros materiales y reactivos necesarios son vasos, dos platos, tijeras y pinzas, una jeringa de tres a cinco mililitros para la cámara intestinal, medio de cultivo DMM complementado con suero para la tos fetal al 10% y NDA. Si se planean aplicaciones posteriores que involucren manipulaciones de ARN, entonces todos los materiales y soluciones deben tratarse en consecuencia para realizar el protocolo. Coloque los testículos diseccionados en un vaso de 96 milímetros según los datos que se muestran: hielo que contenga 10 mililitros de hielo suplementado llamado dm.

Retire la TAL Virginia, corte el testículo decap en trozos cuadrados de dos a tres milímetros de cada lado. Coloque cuatro o cinco de estas piezas en un medicon desechable desegregado junto con un mililitro de código D complementado y procesado en el sistema de metamáquina durante 50 segundos. Cada unidad médica contiene una pantalla fija de acero inoxidable con un centenar de orificios hexagonales rodeados por seis microcuchillas.

El tejido es llevado a cada orificio por un rotor de metal dentro de la cámara de medicon y desegregado pasando sobre los orificios afilados y a través de la pantalla de metal, mientras que una microbomba debajo de la pantalla suministra líquido y elimina los cascos. Recupere el resultado en suspensión celular del medicon utilizando una jeringa de tres a cinco milímetros sin aguja. Posteriormente, empape un halcón de 50 micrómetros o una malla de nailon de cuatro tamaños con medio de medio mililitro y filtre la suspensión a través de él.

Repita el paso, pero usando una malla de nylon de 25 micrómetros o una unidad de halcón equivalente y colóquela en hielo, tome una cotización ALI de la suspensión celular para contar en una cámara de noyer y ajuste la concentración celular a una o dos veces 10 a las siete células por mililitro en el medio de cultivo. Por último, añadir NDA a una concentración final del 0,2% para evitar el bombeo celular y también para evitar la obstrucción muscular durante los estudios de flujo posteriores. Si se pretende evaluar la viabilidad celular, esto se puede realizar mediante el kit de viabilidad de muertos vivos para células animales siguiendo las instrucciones del fabricante antes del análisis de citometría de flujo, añadir un colorante fluorescente.

La elección del fluorocromo dependerá de los láseres disponibles. En esta demostración, se mostrará el uso de diferentes tintes que unen el documento al ADN. A pesar de que el propidium yo diet es el colorante habitual para las células fijas o muertas a bajas concentraciones, hemos encontrado que cuando se utiliza a altas concentraciones, el ROM entra en las células testiculares no fijadas en las suspensiones preparadas por el método aquí presentado.

Esto se debe probablemente al estrés mecánico implicado, que en combinación con la naturaleza sensorial del epitelio semial podría provocar la rotura de los puentes de conexión de célula a célula con una manipulación mínima Para la tinción con yoduro de propidio 10 minutos antes del análisis de la muestra en la solución a una concentración final de 50 microgramos por mililitro a la suspensión celular e incubar a cero grados Celsius en la oscuridad Para analizar las células de tinción de propidium mu. Para una clasificación posterior, utilizamos un citómetro de flujo de fax equipado con un láser coherente de iones de targón ajustado para emitir a 488 nanómetros. La potencia del láser se establece en cien milivatios y la fluorescencia emitida por propidio I se recoge en un detector FL dos utilizando un filtro de paso de banda 5 7 5 5 slash 26

Utilice una boquilla de 70 micrómetros para las mediciones de citometría de flujo y un software squa para analizar los siguientes parámetros. Dispersión lateral directa, fluorescencia total emitida o área de pulso y duración de las emisiones fluorescentes o ancho de pulso. Los resultados se presentan en gramos, que representan el número de eventos en cada nivel fluorescente y en gráficos D, que muestran la dispersión lateral frente al área del pulso fluorescente y el área del pulso fluorescente frente a su anchura.

Los dobletes se excluyen del análisis utilizando gráficos de OD del área de pulso fluorescente frente a su anchura para clasificar las poblaciones de monocitos SM con el modo de clasificación del conjunto de ventaja de fax en R normal o C normal y se utilizan tres gotas clasificadas como sobre. Ajuste el diferencial de muestra para analizar celdas a una velocidad de 500 a 1500 por segundo. Mantenga los tubos de muestra y recolección de tres a cuatro grados centígrados mediante el uso de una unidad de refrigeración.

Alternativamente, las células de la suspensión se pueden teñir con otros fluorocromos. Por ejemplo, el tinte vital. HER 3 3 3 4 2 se puede utilizar hasta una concentración final de cinco microgramos por mililitro e incubarse durante al menos 10 minutos a 37 grados, protegido de la luz para Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 muestras de tinción. El análisis celular se ha realizado mediante un citómetro de flujo MO equipado con un láser de longitud de onda de excitación UV que funciona a 25 milivatios y una boquilla de 70 micrómetros. Utilice el software Summit 4.3 o similar para analizar los mismos parámetros indicados anteriormente cuando se analizan las suspensiones de celdas bajo óptica de contraste de caras, se observan suspensiones de calidad de corte.

Las principales ventajas de este protocolo son, en primer lugar, las suspensiones de células testiculares preparadas con la máquina many y la obtención de solo 15 minutos, incluida la prueba de cesárea, el corte de tejido, el dolor, el procesamiento de la máquina y la filtración, este lapso de tiempo es aproximadamente un octavo del tiempo que suelen tardar otros protocolos. La brevedad de este protocolo, junto con un manejo mínimo, explicaría la buena conservación de las macromoléculas de vida corta, lo cual es crítico cuando se requiere una muestra representativa de los compuestos presentes en la población celular original. Como el metano implica una manipulación mínima, es fácilmente reproducible en esta tabla.

Los porcentajes relativos de las diferentes poblaciones de células testiculares para siete experimentos independientes realizados con ratas adultas y analizados por citometría de flujo se presentan como ejemplo para mostrar la reproducibilidad del método. A diferencia de la mayoría de las partículas utilizadas actualmente para la preparación de suspensiones de células testiculares, el método presentado aquí no implica acción enzimática. Aunque el goteo de colagenasa en un ARN, que son las enzimas generalmente incluidas, contribuye a la segregación inadecuada del tejido, pueden afectar la preservación de las macromoléculas de interés.

La falta de tratamientos enzimáticos no solo favorece la conservación del ARN y las proteínas, sino que también abarata un protocolo. Aunque se había informado previamente que las suspensiones celulares preparadas mecánicamente se agrupaban más fácilmente que las tripsinizadas, hemos encontrado que este protocolo conduce a suspensiones celulares bien desegregadas en ausencia de acción enzimática. La inclusión de NDA ha demostrado ser muy útil para prevenir la aglomeración de células.

La buena calidad de las suspensiones también se evidencia cuando las muestras se someten a análisis citométricos, a juzgar por los mínimos restos celulares observados. Según la información publicada, alrededor del 13% de los espermatozoides redondos se encuentran como multinucleados, ya sea cuando las suspensiones celulares se preparan por un método exclusivamente mecánico o en presencia de tripsina. Sin embargo, muchas suspensiones preparadas a máquina hacen que el multinucleado sea muy escaso, probablemente debido a la reducción de los enredos, ya que se ha afirmado que los multinucleados se producen principalmente como consecuencia de la manipulación de tejidos.

En esta imagen se observa un ejemplo de una suspensión celular preparada a máquina a partir de testículos de rata. Como se puede ver. Los citoplasmas están bien conservados, los porcentajes relativos de las poblaciones de células C, dos C y cuatro C en muchas suspensiones testiculares preparadas a máquina para diferentes roedores reensambladas las de los PE intactos.

Esto apoya la suposición de que el método descrito aquí no daña selectivamente ningún tipo de célula específica. Sorprendentemente, la representación del tipo de celda en muchas suspensiones preparadas a máquina se mantiene mucho mejor que con los métodos clásicos de preparación por goteo. Como se puede observar, los citográficos obtenidos para las suspensiones de células testiculares procesadas meine no difieren sustancialmente de los informados anteriormente.

De hecho, los histogramas y diagramas de puntos obtenidos exhiben las tres poblaciones características de células testiculares cuatro C a C y C basadas en el contenido de ADN, así como la población aparentemente subha, que representa los espermatozoides haploides altamente condensados. Estos perfiles se observaron para sus suspensiones de tinción de yoduro de propidio o sostenidas, respectivamente, y esto también se aplica a los especímenes adultos y juveniles. La clasificación de las células sper mitogénicas se ha logrado con éxito con una pureza superior al 98%, ya sea para poblaciones testiculares seleccionadas en función del contenido de ADN o incluso para subpoblaciones con el mismo contenido de ADN, pero con diferente nivel de condensación de cromatina, como los miocitos de tina y los miocitos de tina del sueño.

Como pudimos observar en las suspensiones de prueba de cobayas, como el protocolo no incluye tratamiento con ARN, las poblaciones clasificadas rinden una buena calidad de ARN y permiten estudios de expresión génica diferencial incluso para poblaciones teñidas con yoduro de propidio. En ese sentido, vale la pena recordar que a diferencia de otros colorantes, las tinciones de yoduro de propidio, el ADN y el ARN bicatenario, sin embargo, en este gráfico de un análisis de suspensión testicular en cobayas, los perfiles similares obtenidos utilizando yoduro de propidio en paralelo con naranja de ciclo vibrante. Ese es un colorante vital específico del ADN que muestra que la tinción de ARN no influye significativamente en los patrones de histograma citométrico.

Esta lista resume las principales ventajas del protocolo porcentual. El método optimizado descrito aquí permite acelerar la preparación de suspensiones de células testiculares adecuadas para el análisis citométrico de diferentes etapas de espermatozoides de roedores en solo 15 minutos, incluida la disección de testículos, el corte de tejido y el procesamiento a través del sistema de máquina ME. La brevedad, la mayor calidad de reproducibilidad y las proporciones de tipo de célula en las suspensiones celulares lo convierten en una buena alternativa para otras técnicas de autopreparación más tediosas y que requieren mucho tiempo en uso actualmente.

Además, dado que este método implica muy poca manipulación y evita las enzimas y los detergentes, es una opción ideal para aplicaciones posteriores delicadas, como los estudios de expresión génica.