Name: Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Aprende a preparar suspensiones de células testiculares de roedores en solo 15 minutos sin enzimas, usando disgregación mecánica. Este método preserva la viabilidad celular y la integridad de macromoléculas para análisis de citometría de flujo y estudios de expresión génica.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el CSIC (I + D del proyecto C022) y PEDECIBA. Los autores desean agradecer a Mariela Bollati y Valentina Porro de la Unidad de Biología Celular (Institut Pasteur de Montevideo) por su generosa colaboración relativo a la clasificación de células MoFlo y Merial-Montevideo para proporcionar gentilmente todos los ejemplares de cuyes utilizados en este proyecto. Figura 1 se reproducen con autorización de BioMed Central, las figuras 2 y 3, y en la Tabla 1 con el permiso de S. Karger AG, Basilea, y las figuras 4 y 5 fueron reproducidas o adaptadas con permiso de John Wiley &amp; Sons, Inc (copyright propiedad de Wiley- Blackwell, 2011).

1. Preparación de las suspensiones celulares <ol><li> Sacrificar la muestra para ser utilizados siguiendo las recomendaciones de las comisiones especializadas como IACUC o equivalente (en Uruguay, la Comisión Nacional de Experimentación Animal [CNEA]). En nuestro caso, se administró una sobredosis de pentobarbital. </li><li> Diseccionar los testículos siguientes procedimientos aprobados normales y colocarlos en un vaso de 96 mm de placa de Petri en hielo, que contiene 10 ml de DMEM enfriado con hielo suplementado con 10% de suero de ternera fetal. </li><li> Retire la túnica albugínea y cortar los testículos descapsulados en trozos cuadrados de 2 a 3 mm en cada lado. </li><li> Esas piezas se procesan entonces en un Medimachine, un molino mecánico automatizado donde el tejido se desagrega el interior de una unidad desechable que contiene una pantalla de acero inoxidable perforada y un rotor de metal. Para ello, colocar 1 ml de DMEM complementado fría y 4-5 de estas piezas en una unidad de 50 micras, desechable, encienda el disaggregator, y el proceso de<html> para 50 seg siguiendo las instrucciones simples del fabricante. </li><li> Recuperar la suspensión de células resultante de la unidad de desagregación usando un 3 - 5 de jeringa ml sin aguja. </li><li> Filtrar con un 50 micras de malla de nylon, previamente remojadas con 0,5 ml DMEM suplementado. </li><li> Se filtra la suspensión de nuevo con un empapado 25 micras de malla de nylon, y el lugar en el hielo. </li><li> Contar en una cámara de Neubauer y ajustar la concentración celular a 1 - 2 x 10 7 células / ml con DMEM suplementado. Al menos 4 x 10 7 células / gramo de material testicular por lo general se obtiene. </li><li> Por último, añadir NDA (2-naftol-6 ,8-disulfónico, sal dipotásica) a una concentración final de 0,2% con el fin de evitar la aglutinación de células. </li><li> Opcional: comprobar la viabilidad celular de las suspensiones de células testiculares con un kit de viabilidad comercialmente disponible para las células animales, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 2. Análisis de citometría de flujo ve_content &quot;&gt; Hemos utilizado un Becton-Dickinson FACSVantage citómetro de flujo equipado con un láser de iones de argón coherente sintonizado para emitir a 488 nm para el análisis de las células teñidas con altas concentraciones de yoduro de propidio (PI) (El tema de la entrada en PI no fijadas. Las células sometidas a estrés se ha abordado en otra parte 9,10). <ol><li> Para la tinción PI, añadir fluorocromo a una concentración final de 50 mg / ml a la suspensión de células, y se incuba durante 10 min a 0 ° C en la oscuridad. </li><li> La potencia del láser se ajusta a 100 mW y un filtro de paso de 575/26 banda se utiliza para recoger PI-la fluorescencia emitida en FL2. </li><li> Realizamos mediciones de FC con una boquilla de 70 micras. Para ordenar las poblaciones spermatocyte, establezca el modo de clasificación en Normal o Normal-R-C, con 3 gotas clasificados como sobre. Mantenga la muestra y los tubos de recogida en 3 - 4 ° C mediante el uso de una unidad de refrigeración. Ajuste diferencial de la muestra a analizar las células a una velocidad de 500 a 1.500 por segundo. </li><li> Utilice el software CellQuest (BD) para analizarlos siguientes parámetros: dispersión frontal (FSC-H); dispersión lateral (SSC-H); fluorescencia emitida o total de pulso-área (FL2-A), y la duración de la emisión de fluorescencia o de ancho de pulso (FL2-W). </li></ol> Alternativamente, hemos empleado el colorante vital Hoechst 33342 a una concentración final de 5 g / ml y se incubaron durante 10 min a 37 ° C en la oscuridad. Análisis celular se realizó por medio de un citómetro MoFlo (DakoCytomation) equipados con una excitación de longitud de onda UV láser que opera a 25 mW y el uso de una boquilla de 70 micras. Manipulación de los datos se realizó con el software Summit v4.3 (Dako).

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

El método optimizado descrito aquí permite la preparación de suspensiones de células a partir de tejido testicular roedor de una manera muy rápida y reproducible, evitando enzima y detergente tratamiento y mantener una buena integridad de la célula y las proporciones de tipo. La brevedad del procedimiento (el lapso de 15 min incluye disección testículo, corte de tejido, y el procesamiento), la manipulación mínimos correspondientes, y la ausencia de tratamientos enzimáticos son algunas de las principales ventajas. Todos ...

<table><tbody><tr><td>Sistema Medimachine</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>unidad Medicon (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Unidad Filcon (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Solución madre 5 mg/ml; utilizado a una concentración final de 5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>solución madre 1 mg/ml; utilizado a una concentración final de 50 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Testículos de mamíferos son órganos muy complejos que contienen más de 30 tipos diferentes de células, incluyendo las células somáticas testiculares y las diferentes etapas de las células germinales. Esta heterogeneidad es un inconveniente importante relación con el estudio de las bases de la espermatogénesis de mamíferos, ya que se necesitan poblaciones de células puros o enriquecidos en ciertas etapas del desarrollo de los espermatozoides para la mayoría de los análisis moleculares 1. Varias estrategias tales como Staput 2,3, elutriación centrífuga 1, y citometría de flujo (FC) 4,5 se han empleado para obtener poblaciones de células testiculares enriquecidos o purificados con el fin de permitir a los estudios de expresión génica diferencial. Se requiere que las células están en suspensión para la mayoría de los enfoques de enriquecimiento / purificación. Idealmente, la suspensión celular será representativo del tejido original, tienen una alta proporción de células viables y unos multinucleates - que tienden a formar debido a lasincitial naturaleza del epitelio seminífero 6,7 - y grupos de células falta 1. En informes anteriores habían evidenciado que las suspensiones de células testiculares preparados por un método exclusivamente mecánica agrupados más facilidad que las tratadas con tripsina 1. Por otra parte, los tratamientos enzimáticos con RNAsas y / o enzimas disgregantes como tripsina y la colagenasa conducen a la degradación de macromoléculas específica, lo cual es indeseable para ciertas aplicaciones industriales. El proceso ideal debe ser tan corta como sea posible e implicar un mínimo de manipulación, a fin de lograr una buena conservación de las macromoléculas de interés, tales como ARNm. Los protocolos actuales para la preparación de suspensiones de células de tejidos sólidos son por lo general mucho tiempo, altamente dependiente del operador, y pueden dañar selectivamente ciertos tipos de células 1,8. El protocolo presentado aquí combina las ventajas de una desagregación mecánica altamente reproducible y extremadamente breve con la unabsence de tratamiento enzimático, que conduce a suspensiones de células de buena calidad que se pueden utilizar para análisis de citometría de flujo y clasificación 4, y ulteriores estudios de expresión génica 9.

Un ejemplo de una suspensión de células y desagregada de testículos de ratas preparadas con el protocolo descrito aquí se muestra en la Figura 1. En comparación a los tratamientos enzimáticos 6,8 y para los métodos descritos anteriormente desagregación mecánica 2, la que se presenta aquí es mucho más rápido, implica menos manipulación, es fácilmente reproducible (no depende del operador), y hace que los desechos celulares escasos (especialmente en compa...

Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

En este video, se presentará un protocolo muy sencillo y eficiente para obtener una suspensión celular de tejido testicular de roedores en solo 15 minutos. El método se ha aplicado a testículos de ratón, rata y cobaya, y utiliza un dispositivo mecánico para desagregar el tejido encapsulado. Tras una filtración y tinción, la suspensión celular está lista para citometría de flujo.El análisis citométrico o la clasificación de la homogeneidad de las poblaciones celulares es un requisito previo para el análisis de eventos bioquímicos y moleculares durante la diferenciación gonadal masculina. Por lo tanto, la heterogeneidad testicular, con más de 30 tipos celulares diferentes, representa uno de los principales problemas en el estudio de la base molecular de la espermatogénesis en mamíferos. Por esta razón, se han utilizado diversos métodos para obtener poblaciones celulares testiculares enriquecidas o purificadas, incluyendo el ultracentrifugado y la ilustración centrífuga.El primer paso para cualquier método de separación celular es la preparación de una suspensión celular. Sin embargo, los protocolos actuales suelen ser largos y pueden implicar la pérdida de moléculas de vida corta, co

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Investigación

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Biology

Biología

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de las células de Sertoli de los túbulos seminíferos de ratón, un componente de los testículos. La digestión enzimática y los lavados repetidos promueven la liberación de células de Sertoli en la solución, que se pueden cultivar aún más para la proliferación y el crecimiento.

Aislamiento de células de Sertoli inmunorreguladoras de túbulos seminíferos de ratón

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

El material aquí describe un método desarrollado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares. Esto se ha denominado el método de diapositiva tridimensional (3D). Este método mejora la sensibilidad para la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH).

Método de preparación de diapositivas para preservar la arquitectura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares

Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.

Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas

Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Aquí se presenta un protocolo para enriquecer los espermacitos de paquiteno, espertáidos redondos y elongafines espermatíides de testículos de ratón adultos utilizando un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina con equipo de laboratorio estándar.

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Aprende a preparar suspensiones de células testiculares de roedores en solo 15 minutos sin enzimas, usando disgregación mecánica. Este método preserva la viabilidad celular y la integridad de macromoléculas para análisis de citometría de flujo y estudios de expresión génica.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

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