Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

En este video, se presentará un protocolo muy sencillo y eficiente para obtener una suspensión celular de tejido testicular de roedores en solo 15 minutos. El método se ha aplicado a testículos de ratón, rata y cobaya, y utiliza un dispositivo mecánico para desagregar el tejido encapsulado. Tras una filtración y tinción, la suspensión celular está lista para citometría de flujo.

El análisis citométrico o la clasificación de la homogeneidad de las poblaciones celulares es un requisito previo para el análisis de eventos bioquímicos y moleculares durante la diferenciación gonadal masculina. Por lo tanto, la heterogeneidad testicular, con más de 30 tipos celulares diferentes, representa uno de los principales problemas en el estudio de la base molecular de la espermatogénesis en mamíferos. Por esta razón, se han utilizado diversos métodos para obtener poblaciones celulares testiculares enriquecidas o purificadas, incluyendo el ultracentrifugado y la ilustración centrífuga.

El primer paso para cualquier método de separación celular es la preparación de una suspensión celular. Sin embargo, los protocolos actuales suelen ser largos y pueden implicar la pérdida de moléculas de vida corta, como los ARN, lo cual es indeseable para análisis posteriores de expresión. La principal ventaja del protocolo aquí presentado es que elimina pasos entre el sacrificio del animal y los estudios moleculares específicos por etapa espermatogénica, pero al mismo tiempo garantiza una buena calidad y una excelente representación de los tipos celulares en las suspensiones celulares.

El procedimiento será demostrado por la Dra. Ana Rodríguez, investigadora del Laboratorio AL que desarrolló el método, y por Federico San López de citometría de flujo, quienes se encargaron del análisis citométrico. El procedimiento requiere una pieza pequeña de equipo, el sistema meach, con sus accesorios medicon y fcon. Sin embargo, los accesorios fcon pueden ser perfectamente reemplazados por membranas de nailon del mismo tamaño de poro.

Los únicos materiales y reactivos adicionales necesarios son una varilla de vidrio para extender, dos platos, tijeras y pinzas, una jeringa de tres a cinco mililitros, la cámara de intestino, medio de cultivo DMM suplementado con 10% de suero de feto bovino y NDA. Si se prevén aplicaciones posteriores que impliquen manipulaciones de ARN, entonces todos los materiales y soluciones deben tratarse de manera adecuada para realizar el protocolo. Coloque el testículo diseccionado en un vaso de vidrio de 96 milímetros por dato mostrado en hielo que contiene 10 mililitros de hielo suplementado denominado dm.

Retire el TAL Virginia, corte el testículo decapitado en trozos cuadrados de dos a tres milímetros por lado. Coloque cuatro a cinco de estos trozos en un medicon desechable junto con un mililitro de medio suplementado con D y procese en el sistema de máquina meta durante 50 segundos. Cada unidad médica contiene una malla fija de acero inoxidable con alrededor de cien orificios hexagonales rodeados por seis microcuchillas.

El tejido es llevado a cada orificio por un rotor metálico dentro de la cámara del medicon y se desagrega al pasar por los orificios afilados y a través de la malla metálica, mientras una microbomba situada debajo de la malla suministra líquido y elimina las cáscaras. Recupere el resultado en suspensión celular del medicon utilizando una jeringa de tres a cinco milímetros sin aguja. Posteriormente, humedezca un tubo Falcon de 50 micrómetros o una malla de nailon de tamaño cuatro con medio medio mililitro y filtre la suspensión a través de ella.

Repita el paso, pero utilizando un tamiz de nailon de 25 micrómetros o unidad Falcon equivalente, y coloque sobre hielo. Tome una alícuota de la suspensión celular para contar en una cámara de Noyes y ajuste la concentración celular a uno o dos veces 10⁷ células por mililitro en medio de cultivo. Finalmente, agregue NDA hasta una concentración final de 0,2 % para evitar la formación de grumos celulares y también para prevenir la obstrucción muscular durante los estudios posteriores de flujo. Si se desea evaluar la viabilidad celular, esto puede realizarse mediante el kit de viabilidad para células animales "Live/Dead", siguiendo las instrucciones del fabricante antes del análisis citométrico de flujo, agregando un colorante fluorescente.

La elección del fluorocromo dependerá de los láseres disponibles. En esta demostración, se mostrará el uso de diferentes colorantes que se unen al ADN. Aunque el yoduro de propidio es el colorante habitual para células fijadas o muertas a bajas concentraciones, hemos encontrado que cuando se utiliza a altas concentraciones, el ROM penetra en células testiculares no fijadas en las suspensiones preparadas mediante el método aquí presentado.

Esto probablemente se deba al estrés mecánico implicado, el cual, en combinación con la naturaleza sensorial del epitelio semial, podría provocar la ruptura de los puentes de conexión entre célula y célula con una manipulación mínima. Para la tinción con yoduro de propidio, añada 10 minutos antes del análisis de la muestra en la solución una concentración final de 50 microgramos por mililitro a la suspensión celular e incube a cero grados Celsius en la oscuridad. Para analizar las células teñidas con yoduro de propidio. Para ordenación adicional, utilizamos un citómetro de flujo FACS Vantage equipado con un láser de iones targon coherente ajustado para emitir a 488 nanómetros. La potencia del láser se establece en cien milivatios y la fluorescencia emitida por el yoduro de propidio se recoge en un detector FL2 utilizando un filtro de banda pasante de 575/26.

Utilice una boquilla de 70 micrómetros para mediciones de citometría de flujo y el software squa para analizar los siguientes parámetros: dispersión frontal, dispersión lateral, fluorescencia total emitida o área del pulso, y duración de las emisiones fluorescentes o ancho del pulso. Los resultados se presentan en gramos que representan el número de eventos en cada nivel de fluorescencia y en gráficos D que muestran la dispersión lateral frente al área del pulso fluorescente y el área del pulso fluorescente frente a su ancho.

Se excluyen los dobletes del análisis utilizando gráficos DO del área del pulso fluorescente frente a su anchura para clasificar poblaciones de monocitos SM con el modo de clasificación fax vantage en R normal o C normal, y se emplean tres gotas clasificadas como envolvente. Ajuste el diferencial de la muestra para analizar células a una velocidad de 500 a 1500 por segundo. Mantenga las muestras y los tubos de recolección entre tres y cuatro grados centígrados utilizando una unidad de refrigeración.

Alternativamente, las células en la suspensión pueden teñirse con otros fluorocromos. Por ejemplo, el colorante vital H33342 puede utilizarse a una concentración final de cinco microgramos por mililitro y se incuba durante al menos 10 minutos a 37 grados protegido de la luz para Hirsch.

Muestras de tinción 3, 3, 3, 4, 2. El análisis celular se ha realizado mediante un citómetro de flujo MO equipado con un láser de longitud de onda de excitación UV que opera a 25 milivatios y una boquilla de 70 micrómetros. Utilice el software Summit 4.3 o uno similar para analizar los mismos parámetros indicados anteriormente cuando las suspensiones celulares se analizan bajo óptica de contraste de fase, se observan suspensiones de calidad cortada.

Las principales ventajas de este protocolo son, en primer lugar, la preparación de suspensiones celulares testiculares utilizando la máquina Many, obteniendo resultados en solo 15 minutos, incluyendo la sección transversal del testículo, el corte del tejido, el procesamiento con la máquina y la filtración; este tiempo representa aproximadamente una octava parte del tiempo habitualmente requerido por otros protocolos. La brevedad de este protocolo, junto con la manipulación mínima involucrada, explicaría la buena conservación de macromoléculas de vida corta, lo cual es fundamental cuando se requiere una muestra representativa de los compuestos presentes en la población celular original. Dado que el método implica una manipulación mínima, es fácilmente reproducible, como se muestra en esta tabla.

Los porcentajes relativos de las diferentes poblaciones celulares testiculares para siete experimentos independientes realizados con ratas adultas y analizados mediante citometría de flujo se presentan como ejemplo para mostrar la reproducibilidad del método. A diferencia de la mayoría de las partículas utilizadas actualmente para la preparación de suspensiones celulares testiculares, el método aquí presentado no implica acción enzimática. Aunque la gota de colagenasa en un RNAs, que son las enzimas generalmente incluidas, contribuye a una segregación inadecuada del tejido, pueden afectar la preservación de macromoléculas de interés.

La ausencia de tratamientos enzimáticos no solo favorece la preservación de ARN y proteínas, sino que también hace que un protocolo sea más económico. Aunque se había informado previamente que las suspensiones celulares preparadas mecánicamente se agrupan más fácilmente que las tratadas con tripsina, hemos encontrado que este protocolo produce suspensiones celulares bien desagregadas en ausencia de acción enzimática. La inclusión de NDA ha demostrado ser muy útil para prevenir la formación de agregados celulares.

La buena calidad de las suspensiones también queda evidenciada cuando las muestras se someten a análisis citométrico, según lo indicado por la mínima cantidad de restos celulares observados. De acuerdo con información publicada, aproximadamente el 13 % de los espermatozoides redondos se encuentran como multinucleados, ya sea cuando las suspensiones celulares se preparan mediante un método exclusivamente mecánico o en presencia de tripsina. Sin embargo, muchas suspensiones preparadas mecánicamente presentan multinucleados muy escasos, muy probablemente debido a una menor formación de enredos, ya que se ha indicado que los multinucleados se producen principalmente como consecuencia de la manipulación del tejido.

Se observa en esta imagen un ejemplo de una suspensión de células preparada mediante muchos equipos a partir de testículo de rata. Como puede verse, los citoplasmas están bien conservados y los porcentajes relativos de las poblaciones celulares 2C y 4C en las suspensiones testiculares preparadas mediante muchos equipos para diferentes roedores coinciden con los de los tejidos intactos.

Esto respalda la suposición de que el método descrito aquí no daña selectivamente ningún tipo celular específico. Sorprendentemente, la representación de los tipos celulares en muchas suspensiones preparadas por medios mecánicos se mantiene mucho mejor que con los métodos clásicos de preparación por goteo. Como puede observarse, los citogramas obtenidos para las suspensiones celulares testiculares procesadas por mí no difieren sustancialmente de los previamente reportados.

De hecho, los histogramas y los gráficos de dispersión obtenidos muestran las tres poblaciones celulares testiculares características de cuatro C a C y de C, basadas en el contenido de ADN, así como la población aparentemente subhaploide, que representa los espermatozoides haploides altamente condensados. Estos perfiles se observaron tanto en suspensiones teñidas con yodo de propidio como con otras tinciones, y esto es válido tanto para ejemplares adultos como juveniles. La clasificación de células espermátogenas se ha logrado con éxito con una pureza superior al 98 %, ya sea para poblaciones testiculares seleccionadas según el contenido de ADN o incluso para subpoblaciones con el mismo contenido de ADN, pero con diferente grado de condensación de la cromatina, como las espermatidas y los espermatozoides.

Como pudimos observar en las suspensiones testiculares de conejillo de indias, dado que el protocolo no incluye tratamiento con RNAasa, las poblaciones ordenadas presentan una buena calidad de ARN y permiten estudios de expresión génica diferencial incluso para poblaciones teñidas con yoduro de propidio. En ese sentido, vale la pena recordar que, a diferencia de otros colorantes, el yoduro de propidio tiñe tanto el ADN como el ARN de doble cadena. Sin embargo, en este gráfico de un análisis de suspensión testicular de conejillo de indias, los perfiles similares obtenidos utilizando yoduro de propidio en paralelo con violeta ciclado naranja, un colorante vital específico para ADN, muestran que la tinción de ARN no influye significativamente en los patrones de histogramas citométricos.

Esta lista resume las principales ventajas del protocolo descrito. El método optimizado aquí descrito permite acelerar la preparación de suspensiones celulares testiculares adecuadas para el análisis citométrico de diferentes estadios espermáticos de roedores en solo 15 minutos, incluyendo la disección testicular, el corte del tejido y el procesamiento mediante el sistema de máquina ME. La brevedad, la mayor calidad de reproducibilidad y las proporciones de tipos celulares en las suspensiones celulares lo convierten en una buena alternativa frente a otras técnicas de preparación manual más tediosas y que consumen más tiempo actualmente en uso.

Además, dado que este método implica muy poca manipulación y evita el uso de enzimas y detergentes, es una opción ideal para aplicaciones delicadas posteriores, como estudios de expresión génica.