Name: Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende a registrar potenciales de campo extracelulares en el prosencéfalo de larvas de Danio rerio. Esta técnica permite monitorear actividad similar a convulsiones en vivo para investigar epilepsia.

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El autor desea dar las gracias a Pedro Castro y Dinday Mateo para sus primeros esfuerzos por establecer pez cebra en el laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención EUREKA (# R01NS079214-01).

1. Huevo de Producción y Recolección <ol><li> El pez cebra cría sigue los procedimientos estándar descritos previamente 8. En pocas palabras, el pez cebra adultos se instalan en acuarios de cría con separadores en su lugar. Cuando las luces de la habitación se enciende a la mañana siguiente, los divisores son retirados de los tanques de cría y los peces se permiten aproximadamente 20 a 60 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados. </li><li> Los huevos procedentes de tanques de cría se recogen en un filtro y se enjuagó con agua huevo. Los huevos se transfieren entonces a una placa de Petri con agua huevo. Huevos no fertilizados y desechos se eliminan utilizando una pipeta de transferencia. </li><li> Coloque una placa de Petri que contiene los huevos recolectados en una incubadora (28-32 ° C). Después de incubar huevos, unos dos días después de la fertilización (dpf), retire cualquier residuo corion y otro con una pipeta de transferencia. </li><li> En el día deseado después de la fertilización (3 a 8 dpf) eliminar placa de Petri que contiene las larvas libremente natación y el lugar en el banco de laboratorio a temperatura ambiente. </li></ol><ol><li> El uso de un extractor de micropipeta, tire de 1,2 mm de diámetro externo de borosilicato de vidrio capilar en dos agujas y guárdelos en un plato de Petri de 150 mm o caja pipeta vacía por encima de las rampas de plastilina. Las agujas pueden ser tirado por adelantado. Diferente OD capilares de vidrio se pueden utilizar dependiendo del tipo de headstage amplificador disponible. </li><li> Retrocarga el microelectrodo con solución de registro extracelular (2 M NaCl) utilizando una jeringa de 1 ml con un filtro de jeringa Nalgene (4-mm) y Microfil filamento (Warner Precision Instruments) conectado. Agitar o golpear ligeramente el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún restantes. </li></ol> 3. Inmovilización en Agar <ol><li> Preparar una solución fresca de agar 1,2% bajo punto de fusión en agua huevo. Place solución de agar en un conjunto de baño de agua a ~ 37 ° C. </li><li> Preparar un cubreobjetos con cámara de registro y el lugar en el congelador (min 5-10). La cámara de grabación debe MATCh que se utiliza en la plataforma de electrofisiología. Usamos un bajo perfil baño abierto diamante cámara de imágenes de Warner Instruments (modelo RC-26GLP). </li><li> El uso de un Pasteur o pipeta de transferencia, coloque una larvas de pez cebra en una pequeña gota de agua de huevo en una placa de Petri plato limpio. Para esta gota, añadir una gota de solución que contiene un anestésico (0,02% tricaína) y agente paralizante (1 mg / ml de α-bungarotoxina). </li><li> Monitorear el pez cebra para la pérdida de movimiento (5 a 10 min). </li><li> Quite el cubreobjetos / cámara de registro del congelador. Coloque la cámara en la etapa de un microscopio estereoscópico. Usando una pipeta de transferencia, se mezcla con algunos mililitros de bajo punto de fusión 1,2% de agarosa con la gotita y solución de transferencia (de pescado) a la cámara de cubreobjetos / grabación. </li><li> Utilizando una punta de pipeta o aguja fina romo, larvas posición bajo el estereomicroscopio de modo que la cara dorsal del pescado se expone a la superficie del gel de agarosa. Permita que se endurezca agarosa (min 5-10), y luego usando una espátula plana la transferencia b agarbloquear a una cámara de grabación puede configurarse en una plataforma de electrofisiología. </li></ol> 3. Grabación de campo extracelular <ol><li> Añadir 2-5 ml de medio de grabación de pez cebra para la cámara de grabación. Si los cambios son drogas cámara necesaria, perfundir con solución de grabación a una velocidad de aproximadamente 1 ml / min. No oxigenación de la solución de grabación es necesario. </li><li> Insertar un microelectrodo (aproximadamente 1 m diámetro de la punta, 2-7 mW) en el headstage amplificador montado en un micromanipulador de tres dimensiones. Comprobar que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir un rango de movimiento y ajuste. Llevar la punta microelectrodo en el plano de visión del microscopio, alta de la etapa, y el uso de ajuste grueso inferior a un punto justo por encima y ligeramente por delante de la cabeza del pez cebra. </li><li> Con el amplificador en &quot;corriente-clamp&quot; modo cero del electrodo. </li><li> Uso del ajuste del grueso inferior de la punta del electrodo para que apenas toque el surface del pez cebra, ligeramente por delante del prosencéfalo. </li><li> El uso de pasos de ajuste fino avanzar la punta del electrodo hasta que perfora la piel del pez cebra. Deje que se asiente y luego avanzar el electrodo varias micras en cerebro anterior. </li><li> Registrar la actividad eléctrica en modo de corriente-clamp utilizando software AxoScope. Los datos se adquirieron a una velocidad de muestreo de 10 kHz. </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y 11 pacientes 12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones también se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Agarosa de bajo punto de fusión </td><td> Fisher Scientific- </td><td> BP1360-100 </td><td> Disolver en los medios de embriones en el 1,2% </td></tr><tr><td> Soporte de grabación </td><td> Fisher Scientific- </td><td> BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 </td><td> 1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM de MgCl 2, 10 mM de dextrosa, 2,1 mM CaCl 2 pH a aproximadamente 7,3 con 1 N NaOH </td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Argent Labs </td><td> MS-222 </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> α-bungarotoxina </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 2133 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Tubo capilar de vidrio </td><td> Warner Instruments </td><td> G120TF-3 </td><td> Tire a una resistencia de 2 -7 mW </td></tr><tr><td> Patch amplificador de pinzamiento </td><td> Warner Instruments </td><td> PC-505B </td><td> Nosotros usamos un amplificador de Warner en modo de corriente-clamp, ganancia fijó en 2 mV / Pa y filtro de Bessel fijado en 2K. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </td></tr><tr><td> Filtro / amplificador </td><td> Cygnus Tecnología </td><td> FLA-01 </td><td> Usamos un pre-amplificador de Cygnus, ganancia ajustada a 10-20; Frecuencia límite fijado en el 1-2K, filtro Notch IN. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </td></tr><tr><td> Axon A / D bordo y software AxoScope </td><td> Molecular Devices </td><td> Axon Digidata 1320A; AxoScope 8,2 </td><td> Los datos se recogen en AxoScope utilizando brecha sin modo de adquisición, el muestreo a 10 kHz. Modelos comparables y programas pueden ser utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </td></tr><tr><td> Huevo agua </td><td&gt; Instant Ocean </td><td></td><td> 3 g de sal Instant Ocean mar, 2 ml 0,1% de azul de metileno en 10 ml de agua desionizada </td></tr></tbody></table>

prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado 1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección in vivo de compuestos de ensayo 4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra 5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el &quot;estándar de oro&quot; para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.

Ejemplos de electrográfica convulsiva de descarga registrada en el cerebro anterior de un agar-incrustado larvas de pez cebra se muestra en la figura 1. De gran amplitud multi-pico de descarga ráfaga en estas muestras fue evocado por baño de aplicación de un fármaco anticonvulsivo, pilocarpina 40 mM (en A; 6 dpf) o 1 mM picrotoxina (en B; 8 dpf). En estas grabaciones, y inmovilizada agar-encajados pez cebra se controlan continuamente durante un máximo de 90 min. Fish siendo viable bajo estas condiciones...

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta<em&gt; In vivo</em&gt; Lectura de actividades similares a convulsiones. Esta técnica se puede utilizar con larvas de pez cebra transgénico que lleva genes relacionados con la epilepsia o las convulsiones provocadas por la administración de fármacos anticonvulsivos.

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener registros de campo extracelular del prosencéfalo de una larva de pez cebra intacta. Esto se logra inmovilizando primero las larvas de pez cebra en un bloque de aros. A continuación, se coloca un microelectrodo de registro en el prosencéfalo bajo visualización directa.El paso final es registrar la actividad eléctrica del prosencéfalo. En última instancia, los resultados se pueden utilizar para monitorear la actividad anormal de las convulsiones electrográficas en larvas intactas de pez cebra. Tuve la idea de este método por primera vez cuando buscaba demostrar que las convulsiones podían provocarse en larvas de pez cebra: la cría de pez cebra sigue los procedimientos estándar descritos anteriormente. Brevemente.Los peces cebra adultos se instalan en tanques de cría con divisores colocados. Cuando se encienden las luces de la habitación a la mañana siguiente, se retiran los divisores y se permite a los peces de 20 a 60 minutos de tiempo de apareamiento sin interrupciones. Luego, los huevos se recogen de los tanques, se transfieren a una placa de Petri con agua de huevo y se limpian de escombros con una pipeta de transferencia, ahor

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El protocolo describe el procedimiento para realizar electrofisiología en pez cebra adulto. Este método se puede utilizar para medir la actividad neuronal in vivo.

Electrofisiología del pez cebra adulto: un método para medir la actividad eléctrica extracelular de las neuronas in vivo

Este video muestra el registro de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra paralizada colocando una micropipeta cerca del ganglio de la línea lateral y formando un sello suelto para la captura de señales. La solución extracelular mantiene la viabilidad neuronal durante este proceso.

Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.

Análisis conductual y fisiológico en un modelo de epilepsia de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende a registrar potenciales de campo extracelulares en el prosencéfalo de larvas de Danio rerio. Esta técnica permite monitorear actividad similar a convulsiones en vivo para investigar epilepsia.

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