Name: Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a medir la rigidez a la flexión de microtúbulos mediante ensayos de deslizamiento impulsados por kinesina. Este método permite determinar la longitud de persistencia de biopolímeros individuales in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Melissa Klocke de asistencia preparando la Figura 1 y Ratliff Anna para demostrar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Corporación de Investigaciones para el Avance de la Ciencia.

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones Prepárese con ensayo de deslizamiento. <ol><li> Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica 22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas. </li><li> Purificar biotina-quinesina 21 a aproximadamente 1 mM. Almacenar a -80 ° C en 5 ml de alícuotas para su uso en los experimentos individuales. </li><li> Preparar el tampón de ensayo (AB) de imidiazole 50 mM, 50 mM de cloruro de potasio (KCl), 4 mM de cloruro magnésico (MgCl 2), 2 mM etilenglicol tetraacético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C. </li><li> Disolver albúmina de suero bovino biotinilada (biotina-BSA) a 2 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras.Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 º C hasta por un mes. </li><li> Disolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 20 l durante largos períodos de tiempo, a 4 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Disolver α-caseína a 5 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Disolver ditiotreitol (DTT) en agua desionizada a 200 mM. Almacenar a -20 ° C en 100 ml de alícuotas, utilizar antes de 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar. </li><li> Disolver paclitaxel (PT) en grado HPLC-dimetil sulfóxido (DMSO) a 4 mM. Almacenar en 10 ml de alícuotas a -80 º C a largo plazo, -20 ° C a corto plazo. Usar dentro de las 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar. </li><li> Disolver la glucosa en agua desionizada a 120 mg / ml. Almacenar en 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Se puede volver a congelar. </li><li> Disresolver el trifosfato de adenosina (ATP) en agua desionizada a 150 mM, pH 7,0. Tienda en 5 alícuotas a -80 ° C, utilizar antes de 8 horas de descongelación. </li><li> Preparar 100x acciones de captación de oxígeno 25 mediante la disolución de 10.000 unidades de glucosa oxidasa y catalasa 156.000 unidades en 600 l tampón de ensayo total. Centrifugar brevemente en una microcentrífuga para sedimentar los sólidos; sobrenadante filtro con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 10 l durante largos períodos de tiempo, a 4 º C durante hasta una semana. </li></ol> 2. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos, Preparación misma solución de Día Preparar las soluciones en 2.1-2.6 en el día del experimento. Con la práctica, las soluciones de 2.2-2.6 se pueden preparar durante el lavado de celda de flujo. A menos que se indique lo contrario, mantener soluciones madre en hielo. <ol><li> Preparar AB, 1 ml de tampón de ensayo con 10 l de DTT de stock (AB con 2 mM DTT). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar bio-tampón BSA, 40 y mu; L de una mezcla 1:1 de la población de biotina-BSA y AB. Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampón de BSA, la mezcla de 645 l de AB con 5,5 l de BSA (1 mg / ml de BSA en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampón SA, mezclar 57 l de AB con 3 l de stock estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar α-caseína tampón, mezclando 200 l de tampón BSA, 50 l de stock caseína, y 0,8 l de ATP mu M 15 (1 mg / ml de α-caseína, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM ATP en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar fluorescencia anti-cloro tampón, mezclar 95 l α-caseína tampón, 2,5 stock de glucosa l, 1 l mezcla oxígeno 100x compactación, 1 stock de paclitaxel l, 1 l de 2-mercaptoetanol (βME). Añadir βME bajo campana de humos. Utilice fluorescencia anti-blanqueo tampón dentro de 1 hora de preparación PRECAUCIÓN:. ΒME es altamente tóxico y huele horrible. Asegúrese de abrir sólo en la campana de humos. Tienda botella en laausencia de luz, la luz degrada βME y su capacidad para reducir photobleaching. </li></ol> 3. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos <ol><li> Construir sobre cuatro carriles de flujo entre un cubreobjetos de 24 x 60 mm y 22 x 22 mm cubreobjetos utilizando grasa de vacío, extruidos de una jeringa a través de una punta de pipeta, como un espaciador. Cada carril de flujo debe ser de aproximadamente 10 l en volumen (escala volúmenes subsiguientes). </li><li> Lavar 10 l de bio-tampón BSA en cada carril. Incubar 5 min para permitir la BSA para revestir las superficies de vidrio. </li><li> Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre biotina-BSA, mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. Utilice un Kimwipe o papel de filtro para eliminar el tampón desde el lado opuesto de la cámara de flujo, asegurándose de no permitir que las burbujas de aire que pasar por la cámara de flujo. </li><li> Lávese 15 l SA-buffer en cada carril. Esperar 10 min, o hasta 2 hr. La estreptavidina se une a la superficie unida a biotina-BSA. </li><li> Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre SA mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. </li><li> Lavar cada carril con 15 l α-caseína tampón. α-caseína ayuda adicional bloquear la unión no específica de kinesin y los microtúbulos en el cristal. </li><li> Diluir kinesin a 10 nM en tampón de α-caseína y lavar cada carril con 15 l de esta kinesin - α-caseína solución. Esperar 15 min (o hasta una hora) para la quinesina biotinilada para unirse específicamente a la estreptavidina unida a la superficie. Los dominios kinesin motor seguirá siendo gratuito a los microtúbulos se unen. </li><li> Diluir paclitaxel a 40 micras a temperatura ambiente α-caseína de amortiguamiento, y lave cada carril con 15 l de esta solución para lavar kinesin libre y para precargar cada cámara de flujo con una solución de paclitaxel de microtúbulos para prevenir la despolimerización. Fría también despolimeriza microtúbulos, así que asegúrese de estas medidas se producen a temperatura ambiente con habitación temre soluciones. </li><li> Diluir la etiqueta fluorescente microtúbulos 1:100-1:1,000 de la fluorescencia anti-blanqueo tampón con 1 mM ATP. Lavar 15 l en un carril y observar dentro de 30 min. </li></ol> 4. Recopilación de datos <ol><li> Observe el deslizamiento microtúbulos mediante microscopía de fluorescencia, un microscopio capaz de resolver los fluoróforos individuales, tales como una configuración de TIRF comercial o doméstica de aumento se requiere 26 (Figura 2). Los microtúbulos debe ser propulsado por los motores de quinesina sobre el sustrato a aproximadamente 0,5 m / s, dependiendo de la temperatura. Si el campo de visión del microscopio es de 50 micras, los microtúbulos individuales debe ser visible para aproximadamente 100 seg. Establecer la intensidad de iluminación de manera que los fluoróforos individuales no fotoblanqueador más rápidamente que 100 seg. Si se utiliza láser de excitación, un ajuste de potencia de aproximadamente 3-5 mW es apropiado. </li><li> Recoger secuencias de imágenes para el análisis. 600 imágenes en5 Hz (2 en total min) funciona bien. Usar secuencias tiempo suficiente que los microtúbulos atravesar todo el campo de visión. </li></ol> 5. Análisis de Datos Una rutina de IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , se adjunta. Esta rutina devuelve un valor de longitud de persistencia basado en toda deslizamiento microtúbulos en una secuencia de imagen dada. O utilizar esta rutina en cada secuencia de imágenes, modificar parámetros de intensidad en función de la configuración del microscopio especial, o haga lo siguiente: <ol><li> El seguimiento de cada fluoróforo unido a un microtúbulo para crear trayectorias de fluoróforo. </li><li> Combinar todas las trayectorias de fluoróforos sobre un microtúbulo determinado en una trayectoria de microtúbulos en general, repetir para cada uno de los microtúbulos en la secuencia de imágenes (Figura 3). </li><li> Calcular el ángulo tangente a cada punto a lo largo de la trayectoria (Figura 4)Y calcular &lt;cos θ s&gt; en la ecuación. 1 promediando el coseno de la diferencia de ángulo para cada par de puntos separados por una longitud de recorrido s (Figura 5). Halla la longitud de persistencia para un microtúbulo o grupo de microtúbulos por &lt;cos ajuste θ s&gt; a la ecuación. 1, la ponderación de los puntos de datos individuales en el ajuste por el número de valores independientes de cos θ s que se utilizan para calcular el promedio. </li></ol>

<ol><li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li>
<li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102(2008).</li>
<li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li>
<li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li>
<li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li>
<li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li>
<li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physical+chemistry+b%22%5BJournal%5D)">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li>
<li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li>
<li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Gliding+assays%22+for+motor+proteins%3A+A+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li>
<li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627(2011).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li>
<li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li>
<li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+tensegrity+in+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biomech%22%5BJournal%5D)">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li>
<li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+nanoscience%22%5BJournal%5D)">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li>
<li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li>
<li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li>
<li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li>
<li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+R+%22Physical+biology+of+the+cell%22">Physical biology of the cell</a>. , Garland Science. (2008).</li>
<li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li>
<li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific%2C+high-precision+label+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li>
<li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curve+reconstruction+from+unorganized+points%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+aded+geometric+design%22%5BJournal%5D)">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por polimerización...

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo 12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas 13,14 y está implicado en la motilidad celular 15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un área activa de estudio para las dos últimas décadas 1. La flexibilidad (o rigidez) de los biopolímeros se caracteriza por la persistencia de longitud, la longitud de polímero que se dobla por aproximadamente un radián menores fluctuaciones térmicas a temperatura ambiente. Una serie de técnicas han sido desarrolladas para medir la longitud de persistencia 16, para example activos técnicas que implican doblar el polímero utilizando flujo hidrodinámico, trampas ópticas, o campos eléctricos 4,17,18, y técnicas pasivas que miden las fluctuaciones de polímeros libres en solución 5,6. Las mediciones activos, sin embargo, requieren configuraciones especiales para aplicar fuerzas conocidas en la escala del micrómetro, y las mediciones de libre fluctuación puede ser difícil debido a la difusión fuera del plano de foco del microscopio utilizado. En este artículo, se describe un complementaria, técnica pasiva, para medir la longitud de persistencia de los microtúbulos, un polímero citoesquelético. La técnica consiste en ensayos de deslizamiento, que aseguran que el polímero permanece siempre en el plano focal 19. Por otra parte, implica el seguimiento fluoróforos individuales unidos permanentemente al polímero de interés, de modo que los lugares específicos a lo largo del polímero están bien caracterizados. Una caricatura del método se muestra en la Figure 1. Kinesin mueve específicamente hacia el extremo + de microtúbulos, por lo que los microtúbulos en un ensayo de deslizamiento son impulsados ​​unidireccionalmente. El extremo delantero de los microtúbulos, más allá de la quinesina último unido, es libre de fluctuar bajo las fuerzas térmicas de la solución circundante. Como los microtúbulos es propulsado hacia adelante, el extremo fluctúa hasta la unión a una molécula de quinesina nuevo aún más a lo largo de la lámina de vidrio se congela en una fluctuación dada. Debido a kinesin concede microtúbulos muy fuertemente, los microtúbulos se ve obligado a seguir el camino del extremo delantero. Por lo tanto, las fluctuaciones estadísticas congelados en la trayectoria de microtúbulos son las mismas que las fluctuaciones estadísticas del extremo libre 11 de los microtúbulos, y por lo tanto se puede utilizar para calcular la longitud de persistencia de acuerdo con 20 <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; donde p es l la longitud de persistencia de los microtúbulos, s θ es el ángulo entre las tangentes a la trayectoria separados por una longitud de contorno s, y &lt;&gt; denota un promedio sobre todos los pares de posiciones separadas por una longitud de contorno s. El ensayo de deslizamiento misma utiliza kinesin biotinilado en el enrollado de la bobina 21 se unía específicamente a la placa de vidrio mediante un enlace estreptavidina-biotina. Esta unión se asegura de que los dominios de motor son libres para unirse a microtúbulos y propulsar. Con el fin de seguir la trayectoria de microtúbulos, los microtúbulos están escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos 22,23 - las etiquetas deberán ser lo suficientemente escasa que fluoróforos individuales se pueden resolver utilizando microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Fluoróforos individuales son rastreados utilizando rutinas de análisis de imágenes escrito en IDL. Las trayectorias de cada fluoróforo unido a un micrófono dadorotubule se combinan en una trayectoria de microtúbulos compuesto automáticamente 24. Los ángulos tangentes θ para cada punto a lo largo de una trayectoria se calculan, a partir de estos ángulos tangentes de la &lt;cosθ s&gt; valor se calcula para cada longitud de contorno s. Finalmente, estos datos se ajustan a la ecuación. 1 con el fin de extraer una longitud de persistencia para un microtúbulo dado, o para muchos microtúbulos en el mismo ensayo de deslizamiento. El método es lo suficientemente robusto como para trabajar con los microtúbulos preparados en una amplia variedad de condiciones (con diferentes agentes estabilizantes u otras moléculas pequeñas unidas a los microtúbulos, con las proteínas microtubulares unidos asociadas (MAPs), o con una variedad de soluciones viscosas). En nuestro laboratorio, la técnica se ha utilizado para caracterizar la longitud de persistencia de los microtúbulos como una función de la longitud a lo largo de los microtúbulos y los microtúbulos con diferentes agentes estabilizantes. La restricción principal es que los microtúbulos todavía debe spoyo kinesin motilidad. Desde quinesina es una enzima motor robusto, esta es una restricción bastante suelta. Mediante la sustitución de microtúbulos con la actina y la quinesina con una enzima de familia de la miosina, la longitud de persistencia de la actina puede ser medida utilizando la misma técnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reactivos</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro potásico</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro de magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilado BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseína</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estreptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratorios</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa oxidasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Comprar pequeña cantidad.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N º 1 1/2 tapa de vidrio</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm N º 1 cubierta de vidrio</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasa de alto vacío</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Equipos</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscopio TIRF</td&gt;<td&gt; Muchos</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; El microscopio TIRF utilizado en este método fue hecho en casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; ¿Podría sustituir MATLAB, ImageJ, u otro software de análisis de imágenes.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de vuelo a vela

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas 1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos 2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud 5-9. A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento 10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas 11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL. Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde uno se cruz...

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un ensayo de deslizamiento para medir la rigidez UAL de los microtúbulos. Esto se logra uniendo primero específicamente la proteína motora kinesina a un portaobjetos de microscopio con dominios motores libres para unirse a los microtúbulos. El segundo paso es añadir a la muestra microtúbulos marcados con fluorescencia, que son traducidos por la kinesina.A continuación, se recogen vídeos de microtúbulos deslizantes mediante microscopía de fluorescencia. El paso final es analizar los videos del ensayo de deslizamiento para calcular la rigidez a la flexión de los microtúbulos. En última instancia, los ensayos de deslizamiento se utilizan para determinar la rigidez a la flexión de microtúbulos individuales.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecánica del citoesqueleto, como la rigidez a la flexión de los polímeros del citoesqueleto individuales. La comprobante de este procedimiento será Anna Ratliff, una estudiante de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare el tampón de ensayo de trabajo agregando 10 microlitros de 200 milimoles de DIO tres atol o DTT a un mililitro de la solución tampón de ensayo madre y mezcle.Mantenga esta y todas las demás soluciones de trabajo a temperatura ambiente durante el procedimiento. A continuación, utilizando el tampón de ensayo de trabajo, prepare 40 microlitros de tampón BSA de biotina combinando albúmina sérica bovina biotinilada filtrada estéril a dos miligramos por mililitro con el tampón de ensayo de trabajo en una proporción de uno a uno y mezclando la solución. A continuación, prepare el tampón BSA combinando 645 microlitros de tampón de ensayo con 5,5 microlitros de 117 miligramos por mililitro BSA y mezclando la solución.Prepare también el tampón de tritina mezclando 57 microlitros de tampón de ensayo con tres microlitros de estreptococo filtrado estéril a 10 miligramos por mililitro en tampón de ensayo. A continuación, construya los carriles de flujo en un cubreobjetos de 24 por 60 milímetros y extruya cinco líneas delgadas de grasa al vacío de una jeringa de 10 mililitros. Usando una punta de pipeta de 200 microlitros para regular el flujo, las líneas deben estar separadas aproximadamente por cuatro milímetros.Coloque un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros encima de la grasa de la aspiradora y presione ligeramente hacia abajo para formar los canales. Con un volumen aproximado de 10 microlitros, las líneas de grasa al vacío deben extenderse hasta aproximadamente el doble del ancho original. El siguiente paso es recubrir los carriles con albúmina sérica bovina biotinilada pipeteando 10 microlitros del tampón bioTE BSA en cada carril de flujo, utilizando la fuerza capilar para aspirar el tampón e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.A continuación, enjuague cada carril tres veces inyectando 15 microlitros del tampón BSA en un lado de cada carril mientras extrae la solución por el otro lado con una toallita Kim o papel de filtro. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en los carriles. En el siguiente flujo, 15 microlitros de estreptavidina se colocan en tampón en cada carril y se incuban durante un máximo de dos horas con un mínimo de 10 minutos.Durante la incubación, prepare el alfa KC en tampón mezclando 200 microlitros de tampón BSA, 50 microlitros de alfa KC filtrado estéril a cinco miligramos por mililitro en tampón de ensayo y 0,8 microlitros de 15 micromolares a TP a pH siete. También prepare la solución de kinesina pipeteando el tampón alfa KCM en un nuevo tubo y agregando la biotina kinesina a 10 nano molares y luego mezclando después de la incubación con el tampón de estreptavidina. Enjuague cada carril tres veces con 15 microlitros de tampón BSA.A continuación, enjuague cada carril con 15 microlitros del tampón alfa kcn para reducir la unión inespecífica de la kinesina y los microtúbulos al vidrio. A continuación, agregue 15 microlitros de solución de kinesina a cada carril e incube durante 15 minutos a una hora. Durante este tiempo, la biotina kinesina formará un fuerte enlace con la estreptavidina unida a la superficie y permitirá que los dominios motores de la kinesina sean accesibles para unirse a los microtúbulos.Mientras tanto, prepare una solución de 40 micromolares de paclitaxel y alfa KC y tampón. El paclitaxel es importante para evitar que los microtúbulos se despolimericen. En una campana extractora, prepare el tampón antiblanqueo de fluorescencia mezclando 95 microlitros de tampón alfa KCM, 2,5 microlitros de caldo de glucosa, un microlitro de 100 x eliminación de oxígeno.Mezclar un microlitro de Paclitaxel y DMSO a cuatro milimolares. Y por último, un microlitro de etanol beta me capto. Después de la incubación, enjuague la biotina kinesina libre lavando cada carril con 15 microlitros de temperatura ambiente.El paclitaxel en solución de alfa Kian utilizando tampón frío puede despolimerizar los microtúbulos. Finalmente, canalice el tampón antiblanqueador de fluorescencia a un nuevo tubo y agregue los microtúbulos marcados con fluorescencia a una dilución de uno a 100 a uno a 1000. A continuación, añade un milimolar un TP y mezcla.Inyecte 15 microlitros de la solución de microtúbulos en un carril y observe mediante microscopía de fluorescencia en 30 minutos. Los aspectos más críticos de este procedimiento es tener una concentración óptima de microtúbulos para garantizar que no se superpongan y tener un fondo bajo. Los carriles restantes se utilizan para optimizar la concentración de los microtúbulos, y utilizamos el propio microscopio para alinearlos y enfocarlos.La obtención de imágenes de los microtúbulos deslizantes se realiza utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total casero. Un objetivo de apertura numérica alta de 100 x muestra un campo de aproximadamente 50 micras por 50 micras, que es suficiente espacio para ver el movimiento durante aproximadamente 100 segundos a una velocidad de 0,5 micras por segundo. El láser se utiliza para la excitación a un ajuste de potencia de tres a cinco milivatios.Esta potencia es lo suficientemente baja como para evitar el fotoblanqueo del piso de cuatro en cuatro más rápido que 100 segundos para permitir un tiempo de imagen adecuado. Con el software de captura de imágenes, recopile secuencias de imágenes a cinco fotogramas por segundo durante dos minutos. Las secuencias deben ser lo suficientemente largas para que los microtúbulos atraviesen todo el campo de visión.Analice los datos de la imagen utilizando una rutina IDL como el archivo, obtenga LP Pro, que se puede obtener del material complementario. Esta rutina DL devuelve un valor de longitud de persistencia que se basa en todos los microtúbulos que se deslizan en una secuencia de imágenes determinada. Modifique los parámetros de intensidad en función de la intensidad del fluorocuatro y la configuración del microscopio.Aquí se muestra un ensayo de deslizamiento tomado con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Los cuatro fluorados se pueden ver escasamente decorados a lo largo de los microtúbulos. Las trayectorias de cuatro fluorescentes que se acaban de mostrar se fusionan, combinando un promedio de 10 cuatro fluorados en un solo punto por cada 100 nanómetros para mejorar el análisis de datos.Al observar un solo microtúbulo, el ángulo tangente entre cada punto se puede calcular y mapear fácilmente en función de la longitud. Usando ángulos tangentes, se puede calcular la longitud de persistencia y el cosignatario promedio por longitud de segmento se puede trazar usando la ecuación que se muestra aquí. Se puede determinar la línea de mejor ajuste una vez dominada.Esta técnica se puede utilizar para medir la rigidez a la flexión de varias docenas de microtúbulos en tres o cuatro horas si se realiza correctamente.

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

La durabilidad de los polímeros y los compuestos poliméricos reforzados con fibra en servicio es un aspecto crítico para sus diseños y mantenimiento basado en la condición. Presentamos una novedosa plataforma de pruebas de laboratorio de bajo costo para la investigación de la influencia de las cargas mecánicas y ambientales concurrentes, y puede ayudar a diseñar estructuras compuestas más eficientes y seguras.

Una plataforma de pruebas de Estudios de durabilidad de Polímeros y reforzados con fibra de polímero composites bajo estímulos Concurrente Hygrothermo-mecánica

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Una metodología novedosa se presenta para sintetizar y elastómeros programa principal de cadena líquido-cristalinas usando monómeros de partida comercialmente disponibles. Una amplia gama de propiedades termomecánicas fue adaptado mediante el ajuste de la cantidad de agente de reticulación, mientras que el rendimiento de accionamiento era dependiente de la cantidad de tensión aplicada durante la programación.

Síntesis de programable principal cadena Elastómeros líquido-cristalinas utilizando una reacción de tiol-acrilato de dos etapas

Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.

Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible

Presentamos un protocolo para la realización de pruebas de flexión de tres puntos en las fibras de escala submilimétrica utilizando un dispositivo mecánico a la medida. El aparato puede medir las fuerzas que van desde 20 µN hasta 10 N y por lo tanto puede acomodar una variedad de tamaños de fibra.

Un milímetro a la flexión prueba sistema de la escala para medir las propiedades mecánicas de espículas de esponja marina

Sustratos con rigidez en la gama de kilopascal son útiles para estudiar la respuesta de las células a rigidez de microambiente fisiológicamente relevante. Con sólo un microscopio de fluorescencia de campo amplio, módulo de Young de geles de silicona blanda puede ser determinado mediante una muesca con un ámbito adecuado.

Medición de la rigidez de sustratos de silicona blanda mecanobiología estudios utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio

Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.

Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Desarrollo de ensayos personalizados en la plataforma de Vibe para más sensibles, reproducibles, automatizado en matrices complejas se describe. El cartucho universal permite ensayos para ser adaptado fácilmente para su uso con los ensayos de costumbre. Esta versatilidad permite un rápido desarrollo y validación de nuevos ensayos o versiones automatizadas de los actuales ensayos manuales, ejemplificado en este video.

Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Aprende a medir la rigidez a la flexión de microtúbulos mediante ensayos de deslizamiento impulsados por kinesina. Este método permite determinar la longitud de persistencia de biopolímeros individuales in vitro.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Explorar más videos