Recolección, aislamiento y enriquecimiento de bacterias naturales magnetotácticas del Medio Ambiente

El objetivo general de este procedimiento es aislar las bacterias magnetotácticas de un entorno de agua dulce. Esto se logra recolectando primero muestras de sedimentos de agua de la orilla de un río o lago. El segundo paso es aislar las bacterias magnetotácticas contenidas en la muestra ambiental utilizando un imán de barra.

A continuación, las bacterias magnetotácticas se enriquecen utilizando una pista de carreras capilar de vidrio y un imán. Por último, las bacterias magnetotácticas se caracterizan mediante microscopía óptica. En última instancia, la microscopía electrónica de transmisión se utiliza para mostrar el tamaño y la forma de las bacterias y sus zonas de magnetita que contienen magnetita.

Este método nos ayuda a comprender preguntas clave, microbiología ambiental, como cómo evolucionó el magneto en la tierra y cómo las bacterias magnetotácticas sintetizaron imanes de tamaño nanométrico. Demostrando el procedimiento hoy estará Zachary a Stryker. Zachary es candidato a doctorado en mi laboratorio.

Trabaja con mi hermano y conmigo aquí en la Universidad Estatal de Ohio. Al decidir sobre un sitio de agua dulce para recolectar bacterias magnetotácticas o MTB, a menudo es mejor comenzar con un estanque o arroyo de movimiento lento que tenga una capa de sedimentos fangosos suaves. En esta demostración, recolectamos una muestra en el borde del río Oland Tangy en el campus de la Universidad Estatal de Ohio en Columbus, Ohio.

Encuentre un lugar donde la profundidad del agua esté entre 10 y 100 centímetros, y usando un recipiente transparente con tapa de rosca, llene el recipiente con la capa superior de sedimento y el espacio restante con agua, tapando el recipiente bajo el agua en el laboratorio, afloje la tapa y déjelo cubriendo el recipiente para reducir la evaporación y almacene en la oscuridad durante varias horas o varios días para permitir que el sedimento y encontrar partículas para asentarse. Hacer pistas de carreras para enriquecer el MTB. Comience usando un bolígrafo de diamante o una lima para cortar la parte superior de una pipeta de vidrio de 5,75 pulgadas, dejando suficiente espacio para uno o dos mililitros de agua.

A continuación, use un quemador y para sellar el autoclave de punta. Varios levantan orugas junto con algodón y largas agujas de metal. Cuando esté listo para aislar el MTB, coloque imanes en los lados del contenedor de plástico, aproximadamente un centímetro por encima de la interfaz de agua sedimentada con los polos sur y norte en lados opuestos del contenedor.

Tenga cuidado de no alterar el sedimento. Espere de 30 minutos a varias horas para que las bacterias naden hacia el imán. A continuación, utilice una jeringa para extraer el líquido del recipiente de muestras cerca de la interfaz sedimento-agua.

Coloque un filtro en la jeringa y una aguja de metal en el filtro, asegurándose de que no haya burbujas en el capilar. Use la aguja para agregar el agua de muestra filtrada a una pista de carreras de autoclave con algodón estéril y la aguja de metal. Tape la pista de carreras empujando el algodón dentro del capilar a una distancia de 0,5 a un centímetro del extremo sellado.

Con una pipeta estéril, retire las bacterias de la táctica magnética del recipiente donde están agrupadas cerca del polo sur del imán y agregue el agua que contiene MTB al extremo abierto de la pista de carreras. Una vez que la pista de carreras esté llena de líquido de muestra, colóquelo de lado sobre una superficie horizontal y coloque el polo sur de una barra magnética junto a la punta del sello de la pista de carreras. Espere de cinco a 30 minutos para que la MTB migre a través del algodón.

Use un cuchillo de diamante para hacer suavemente un pequeño rasguño cerca del tapón de algodón y romper el extremo de la pista de carreras. Utilice una jeringa de un mililitro con una aguja estrecha para extraer el líquido enriquecido con MTB de la punta de la pista de carreras. Para observar el MTB mediante microscopía óptica, coloque una gota de la muestra enriquecida en un cubreobjetos.

Coloque la cubierta en una junta tórica que descansa sobre un portaobjetos de vidrio. A esto se le llama la caída colgante. La junta tórica debe tener un diámetro ligeramente más pequeño que el cubreobjetos.

A continuación, coloque el portaobjetos en una platina de microscopio óptico y concéntrese en un borde de la gota. Luego, para atraer la MTB a un lado de la caída, coloque el extremo sur de una barra magnética cerca de ese lado dentro de unos minutos, muchas MTB deben estar en el borde de la caída. Para observar el MTB por TEM, coloque una rejilla de cobre de malla 200 estabilizada con var y recubierta de carbono sobre la gota de las bacterias enriquecidas y deje que la muestra se asiente durante 10 minutos.

Después de lavar la muestra en una gota de agua durante 30 segundos, colóquela en una gota de acetato de urinario al 2% durante 30 segundos a cinco minutos, y luego use un trozo de papel de filtro para secar completamente las muestras utilizando microscopía electrónica de transmisión a 200 kilovoltios. Aquí se muestra una imagen de microscopio electrónico de transmisión de una sola bacteria magnetotáctica enriquecida a partir de una muestra de sedimento ambiental. La espiral y la morfología de las zonas de células y magneto son claramente visibles junto con un solo flegel.

Una vez que las bacterias de la táctica magnética se han recolectado del medio ambiente, la técnica de separación magnética tomará aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de ARN ribosómico 16 s, que responderán a preguntas adicionales como, ¿cuál es la relación filogenética de las bacterias magnetotácticas recién descubiertas con otros microorganismos?