La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Este protocolo produce complejos estabilizados covalentemente de péptidos transmembrana para estudios estructurales destinados a comprender cómo las proteínas de membrana interactúan entre sí a través de sus dominios incluidos en lípidos. En primer lugar, expresar una proteína de fusión marcada con hist que contenga la secuencia transmembrana de interés en E. coli. A continuación, extraiga la proteína de la fracción corporal de inclusión utilizando guina y detergente utilizando una matriz de afinidad de níquel.

Concentre la proteína de fusión marcada con hist y el disulfuro y retilícela a la forma diametral lavando la columna en una solución que contenga agentes oxidantes. A continuación, eluya la proteína de fusión reticulada en ácido acético trifluor y trátela con bromuro de cianógeno para liberar el socio de fusión, proceda a aislar el producto peptídico reticulado de la mezcla de digestión mediante HPLC de fase reversa. En última instancia, la identidad y la pureza de los productos se verifican mediante análisis de espectrometría de masas y páginas SDS.

La principal ventaja de esta técnica es que se producen complejos sociométricos puros para estudios estructurales utilizando técnicas como la RMN en solución o en estado sólido. Incluso cuando se sabe que dos dominios transmembrana interactúan, la solubilidad de los péptidos y la formación de complejos a menudo están en desacuerdo en condiciones experimentales. Comenzar con un complejo bien definido y estabilizado covalentemente puede ampliar significativamente la gama de condiciones experimentales que se pueden probar para la recopilación de datos de alta calidad.

Por lo general, las personas nuevas en este método lucharán con la dificultad de manejar estos fragmentos de proteínas extremadamente hidrofóbicos. Este protocolo y los consejos proporcionados en el manuscrito adjunto están diseñados para proporcionar una solución simple a algunos de los desafíos más comunes en el proceso de predicción y purificación. Paladar, un cultivo de un litro de bacterias que expresan la fusión del péptido de la tripa y se resuspenden en 50 mililitros de tampón de lisis.

A continuación, realice tres ciclos de sonicación a máxima potencia durante un minuto y enfríe en hielo durante cinco minutos. Recolectar el material corporal de inclusión insoluble por centrifugación a 20.000 g durante 15 minutos decantar y reservar el sobrenadante. Las etapas de sonicación y centrifugación pueden repetirse si se requiere una pureza mejorada de la fracción IB.

Reserve muestras del pellet y del material sobrenadante para el análisis de la página SDS para confirmar el viaje. La localización de la fusión de TM en los cuerpos de inclusión ahora disuelve los gránulos del cuerpo de inclusión en la solución de guina utilizando entre 25 y 50 mililitros por litro de cultivo. Mezcle suavemente a temperatura ambiente durante varias horas con sunación ocasional.

A continuación, limpie el lisado del cuerpo de inclusión por centrifugación a 75.000 a 100.000 veces G durante una hora. A temperatura ambiente, filtre el supernat a través de una membrana de 0,2 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Combine el lisado del cuerpo de inclusión aclarado con la resina de afinidad de níquel que se ha equilibrado para unir la solución de guina al lote de unión.

Mezcle la suspensión suavemente durante la noche a temperatura ambiente. Cargue la suspensión de resina de níquel lisado del cuerpo de inclusión en una columna de flujo de gravedad vacía con soporte de lecho poroso hasta que fluya todo el volumen. Recoja y ponga a un lado el flujo a través del cual aún puede contener proteína de fusión no unida.

A continuación, lavar la resina de níquel por gravedad. Flujo con cinco volúmenes de lecho de solución de urea que contiene mercaptoetanol de haz de cinco milimolares. Realizar un segundo lavado sin haz de mercaptoetanol para el tercer lavado.

Utilice una solución de urea suplementada con sulfato de cobre y glutatión oxidado. A continuación, cierre la salida de la columna e incube 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la máxima formación de enlaces de disulfuro. Lave la solución de urea oxidante con 10 volúmenes de lecho de agua.

A continuación, aplique una línea de vacío para secar el lecho de la columna y cierre la salida de la columna. Ahora en una campana de seguridad química, agregue 1,5 volúmenes de lecho de TFA puro, revuelva la resina de níquel con una espátula pequeña para garantizar una exposición uniforme al ácido e incube durante cinco minutos. Recoja el eluido ácido, presurizando suavemente con una línea de aire comprimida si es necesario para expulsar todo el líquido.

Repita el paso de dilución ácida con otros 1,5 volúmenes de lecho de TFA puro Para medir el rendimiento de proteína, diluya el TFA EIT en etanol trifluorado y mida la absorbencia a 280 nanómetros contra A-T-F-A-T-E. Diluir el elu ácido hasta el 80% de la concentración final de TFA gota a gota. Agregue agua mientras mezcla suavemente.

Si precipita las formas, vuelva a agregar una pequeña cantidad de TFA hasta que la solución se aclare. Luego vuelva a corregir al 80% con agua. Reserve una muestra de predigestión de cinco microlitros para el análisis de la página SDS y congélela inmediatamente en nitrógeno líquido.

A continuación, pese los cristales de bromuro de cianógeno durante aproximadamente 0,2 gramos por mililitro de muestra. Teniendo cuidado de pesar el producto químico tóxico de manera segura. Agregue el bromuro de cianógeno a la muestra en una campana de seguridad y mezcle suavemente hasta que se disuelva por completo.

Ahora enjuague el recipiente de reacción dentro del sello de gas inerte e incube durante tres o cuatro horas a temperatura ambiente, protegido de la luz. Reserve una muestra de postdigestión de cinco microlitros para el análisis de la página SDS, congelándola inmediatamente en nitrógeno líquido y liofilícela junto con la muestra de predigestión. A continuación, transfiera la reacción de digestión a un casete de diálisis de celulosa regenerada, lo que permite un aumento significativo del volumen.

Diálisis la muestra durante la noche contra cuatro litros de agua en la campana química. A la mañana siguiente, retire la solución de reacción dializada con precipitado de proteína en suspensión del casete de diálisis y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, congele y liofilice la muestra durante varios días para eliminar el agua y cualquier rastro de cianógeno, bromuro y TFA y disuelva hasta 100 miligramos de productos de digestión liofilizados en tres mililitros de mezcla de ácido fórmico puro hasta que la solución se aclare por completo.

Cargue la muestra en una columna de báscula preparativa zoax SB 300 C3 en un flujo de disolvente A utilizando un circuito de muestra de cinco mililitros. A continuación, eluir los productos digeridos en un gradiente de disolvente B, en al menos cinco volúmenes de columna. Analizar las fracciones de HPLC mediante página SDS y espectrometría de masas MALDI TOF para identificar las especies de interés y confirmar su liofilización masiva esperada.

Las fracciones de HPLC que contienen el producto peptídico reticulado. Si el producto se seca hasta convertirse en una película en lugar de un polvo, se puede volver a disolver en un pequeño volumen de HFIP congelado en líquido y liofilizado. Una vez más, el resultado será un cono blanco esponjoso que se inclina y pesa fácilmente como una secuencia de ADN que codifica las regiones transmembrana y de señalización de la molécula de señalización transmembrana del receptor inmunológico.

DAP 12 se clonó en el vector peptídico PMM utilizando los sitios de restricción Hindi tres y BAM H uno. La construcción de expresión bacteriana resultante produce una proteína de fusión de viaje marcada con residuos internos únicos de metionina y cistina para la escisión de bromuro de cianógeno y la reticulación oxidativa. El nivel de expresión alcanzado para las fusiones de callos varía en función de la secuencia de aminoácidos del péptido adjunto.

Esta preparación produjo aproximadamente 120 miligramos de proteína de fusión pura e intacta a partir de un litro de cultivo y cuatro mililitros de matriz de níquel. Después de la lisis celular, la proteína de fusión se localizó en el pellet del cuerpo de inclusión. Aproximadamente el 70% de la fusión de la tripa purificada con níquel DAP 12 TM era disulfuro reticulado a la forma DME.

Aunque los productos peptídicos DAP 12 TM no son fácilmente identificables en las muestras totales de digestión de bromuro de CIANÓGENO, la comparación de las bandas intactas de fusión y fragmento de disparo en la muestra de digestión reducida indica que la digestión de la fusión se completó aproximadamente en un 60% en esta separación típica de productos de digestión. En una columna C3 a escala preparatoria utilizando HPLC de fase inversa, los productos unidos aludieron en un gradiente de dos etapas del solvente B. El producto peptídico reticulado de sulfuro de diss es identificable en el análisis de la página SDS de las principales fracciones de HPLC en condiciones reductoras y no reductoras. El análisis de espectrometría de masas de Maldi tof confirma la identidad del péptido deme en el pico cuatro con el producto principal en 6729.2 Daltons.

No olvide que trabajar con bromuro de cianógeno, solventes orgánicos y ácidos concentrados puede ser extremadamente peligroso. Se debe usar el equipo de protección adecuado mientras se realizan estos procedimientos y el bromuro de cianógeno nunca debe manipularse fuera de la cubierta de seguridad química aprobada. Esta técnica ha proporcionado el material de estudio clave para tres estructuras diferentes de solución n mr de complejos de péptidos transmembrana, lo que demuestra cómo los receptores inmunes de múltiples subunidades se ensamblan a través de interacciones de proteínas dentro de la membrana de los linfocitos.

Creemos que la aplicación de esta técnica resultará igualmente valiosa para otros sistemas de proteínas de membrana.