Name: Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprenda a aislar miocitos auriculares y ventriculares de ratones modificados genéticamente para estudios de electrofisiología cardíaca mediante la técnica de patch clamp. Este protocolo permite analizar corrientes de canales de potasio.

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Este trabajo fue financiado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz Thyssen-Stiftung y Charité / MDC.

1. Animal Anestesia y sustracción de órganos <ol><li> Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (ip) de inyección de ketamina (200 mg / kg de peso corporal) y xilazina (20 mg / kg BW). </li><li> Para anticoagular inyectar ip 250 UI de heparina para evitar la formación de trombos y coágulos sanguíneos. </li><li> Esperar hasta que la narcosis se alcanza, que se caracteriza por arreflexia. Para comprobar si hay prueba de reflejo arreflexia corneal tocando suavemente la córnea o el reflejo vuelo de prueba de pellizco cola. </li><li> Transferir el ratón sobre mesa de operaciones y fijarlo en posición supina. </li><li> Incisión de la piel y la pared abdominal por debajo del apéndice xifoides y realizar una toracotomía clamshell: Extender el corte a lo largo de ambos lados del arco costal y posteriormente cortar las costillas en la línea axilar media, desviar hacia arriba la caja torácica. </li><li> Abra pericardio, localizar los grandes vasos. Presione suavemente caudal corazón para mostrar mejor la aorta. Sujete la aorta utilizando fórceps. </li><li> Colocar el corazón en la concavidad de un par de s<html> cissors y diseccionar todos los barcos que conectan con un solo corte. Asegúrese de preservar una parte suficientemente grande de la aorta ascendente para la canulación de Langendorff. </li><li> Transferir corazón extirpados inmediatamente a una placa de Petri llena de hielo frío y pre-oxigenada solución 1 (para soluciones, véase la Tabla 1). </li></ol> 2. Preparación de perfusión del corazón y Langendorff <ol><li> Canular la aorta con una cánula de acero 1.8F. Asegúrese de evitar una embolia gaseosa. </li><li> Fije aorta en la cánula con una sutura quirúrgica y coronarias ras con 1 ml de solución 1. </li><li> Conectar la cánula con un aparato Langendorff. </li><li> Asegúrese de que el tiempo de toracotomía de la canulación Langendorff no exceda de 120 segundos para evitar extendida por isquemia / reperfusión en el miocardio. </li><li> Corazón perfundir con 10 ml de Ca 2 + libre solución 2 (4 ml / min). </li><li> Corazón perfundir con solución de colagenasa 3 de 8 min (4 ml / min). </li></ol>le &quot;&gt; 3. Microsurgical disociación de Cardiac Cámaras <ol><li> Transferencia de corazón en una pre-calentado 100-mm placa de Petri que contiene bajo Ca 2 + solución 4. </li><li> Retire con cuidado la aorta y otros no-tejido cardíaco con unas tijeras y lo descarta. </li><li> Aurículas y los ventrículos separados y continuar con cada cámara por separado. Mantener las células sumergidas en solución 4. Utilizar volúmenes pequeños (menos de 5 ml). </li></ol> 4. Disociación Además de los cardiomiocitos <ol><li> Cardiomiocitos auriculares: <ol><li> Para individualizar miocitos auriculares transferir las aurículas en un aparte precalentado placa de cultivo de 100 mm y disociar el tejido a través de él con cuidado separando con unas pinzas finas. Asegurar una disociación casi completa del tejido. </li><li> Usar una pipeta de 1 ml con una vista ampliada pulida al fuego punta de pipeta de plástico para suspender las células en 1 ml de solución de 5 por 5 min. </li><li> Se separan las células de los desechos mediante el uso de un filtro celular (200 micras de malla). </li> &lt;li&gt; Añadir 5 ml de solución 5 a la suspensión de células y se centrifuga durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente. </li><li> Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Eliminar el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 5 ml de solución 6. </li><li> Después de la sedimentación por gravedad durante 10 min en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 1 min a 16 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante. Volver a suspender las células en función de su cantidad en 1-5 ml de solución 6. </li></ol></li><li> Cardiomiocitos ventriculares: <ol><li> Diseccionar la región ventricular izquierda de interés con unas pinzas finas en 5 ml de solución 4. </li><li> Suspender las células pipeteando suavemente hasta que la mayoría de las células se separan. Transferir la solución de células después de la filtración (200 micras de malla) en un tubo de 50 ml, añadir un volumen de 25 ml. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente. </li><li> Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Remover el sobrenadante, resuspender el precipitado en 25 ml desolución de 6 y permitir la sedimentación de las células durante 10 min. </li><li> Contar las células y eliminar el sobrenadante, añadir 25 a 50 ml de solución 6 en las células. </li></ol></li></ol> 5. Preparación de cardiomiocitos de Electrofisiología Celular, Bioquímica o si los estudios <ol><li> Para los estudios de electrofisiología, mantener los miocitos en solución en un tubo de 6 ml y 50 inhiben la sedimentación. </li><li> Para los estudios bioquímicos, formación de imágenes por ejemplo, calcio, miocitos placa sobre laminina plato recubierto cultivo de células (concentración final 20 mg / ml de laminina en PBS). </li><li> Para la tinción de inmunofluorescencia preparar un cultivo de células placa plato con cubreobjetos de vidrio y recubierto con una solución de laminina (concentración final 50 mg / ml de laminina en PBS). <ol><li> Retire la solución antes de miocitos galvanoplastia. Placa de las células y controlar la densidad de las células utilizando un microscopio. </li><li> Deje que los miocitos se adhieren a cubreobjetos durante 1 hora a 37 ° C en 2% de CO 2, eliminar la solucióny comenzar inmediatamente con un protocolo de tinción procedimiento estándar. </li><li> Incubar con fijador, por ejemplo, 4% de PFA en PBS (pH 7,5) durante 10 min a temperatura ambiente y sigue con tres pasos de lavado con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Para permeabilizar las células y de inhibir la unión de anticuerpos inespecíficos incubar los miocitos con 10% de suero, 0,3% de Triton, 0,2% de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar con el anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C y se lavan como se ha descrito antes. </li><li> Se incuba con el anticuerpo secundario durante 1 hr a temperatura ambiente. Para contrateñir los núcleos y α-actinina uso DAPI y phalloidin fluorocromo conjugado (Alexa Fluor 488, Invitrogen). </li><li> Después del lavado, transferir la cubierta de cristal se desliza con cuidado en silano portaobjetos tratados y las células incrustar en medio de fluorescencia de montaje. </li></ol></li></ol> 6. Electrofisiología Celular <ol><li> Realizar Plenario de células patch-clamp grabaciones en frecuenciashly aislado cardiomiocitos auriculares y ventriculares a temperatura ambiente. </li><li> Transferir sanos cardiomiocitos que aparecen en la cámara de perfusión llena con un volumen definido de la solución de baño extracelular. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM de MgCl 2, 3 mM CoCl 2, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM, y 0,02 mM de tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilice NaOH para ajustar el pH de valor. </li><li> Utilice el equipo de patch clamp (es decir IX71 microscopio invertido, un amplificador 700B MultiClamp, un sistema Digidata 1440A adquisición y PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)). </li><li> Usar pipetas de patch con resistencias de 3-5 mW cuando se llena con una solución intracelular contenía 130 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP y 4,9 mM CaCl 2 (pH 7,2). Use KOH para el ajuste del valor de pH. </li><li> Evocar exterior K + corrientes duanillo 4,5-sec pasos de voltaje para probar potenciales entre -60 y +50 mV en incrementos de 10-mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV después de un 20-mseg prepulso a -40 mV. </li><li> Asegúrese de que las corrientes de fuga son siempre &lt;100 pA. </li><li> Para la disección de K + corrientes utilizar diferentes inhibidores específicos tales como 4-aminopiridina (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, EE.UU.), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o tetraetilamonio (TEA, Sigma). Las soluciones madre se preparan en solución extracelular baño, y se aplica directamente a la zona más cercana posible de la célula a través de una micropunta después de &quot;base&quot; grabaciones. El equilibrio se debe permitir durante 2-3 min antes de &quot;medicamentos&quot; grabaciones. </li><li> Para el análisis de normalizar las amplitudes de corriente en las células individuales a tamaño celular (células enteras capacitancia de la membrana). Analizar los datos sin conexión mediante pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software similar. </li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Con el desarrollo creciente de cepas de ratón genéticamente modificados para el estudio de la función cardiaca y la patología cardíaca relacionada con una deleción del gen también hay un creciente interés en métodos especializados para estudiar los efectos de la deleción del gen específico in vitro. En nuestro laboratorio se estudia el papel de una familia de canales Kv subunidades accesorias sobre la repolarización cardiaca. Los genes KCNE comprenden una familia de 5 genes (KCNE1-5) que desem...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> La tetrodotoxina </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-aminopiridina </td><td> ICN Biomedicals </td></tr><tr><td> Heteropodatoxin 2 </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraetilamonio </td><td> Sigma Chemicals </td></tr><tr><td> Colagenasa de tipo 2 </td><td> Worthington </td></tr></tbody></table>

aislamiento y grabaciones kv canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes codifican para una pequeña familia de canales Kv subunidades auxiliares que forman complejos con heteroméricos Kv canal subunidades alfa para modificar sus propiedades funcionales. Las mutaciones en los genes de KCNE se han encontrado en pacientes con arritmias cardiacas tales como el síndrome de QT largo y / o la fibrilación auricular. Sin embargo, la fisiopatología precisa molecular que conduce a estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. En estudios previos de las propiedades electrofisiológicas de la enfermedad que causa mutaciones en estos genes han sido estudiados principalmente en sistemas de expresión heterólogos y no podemos estar seguros de si los efectos reportados directamente se puede traducir en cardiomiocitos nativos. En nuestro laboratorio, por lo tanto, utilizar un enfoque diferente. Nuestros estudiar los efectos de la supresión de genes KCNE en cardiomiocitos aislados de los ratones knockout de electrofisiología celular - una técnica única que se describe en este número de la Revista de experimentos visualizados. Los corazones de la geneticaLLY diseñaron ratones KCNE se extirparon rápidamente y se montaron en un aparato Langendorff por canulación aórtica. Gratis Ca 2 + en el miocardio está obligado por EGTA, y la disociación de los miocitos cardíacos se consigue después de una perfusión retrógrada de las arterias coronarias con un especializado bajo Ca 2 + que contiene tampón de colagenasa. Atria, la pared libre del ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo se puede separar por técnicas de microcirugía. El calcio se añade entonces lentamente de nuevo a cardiomiocitos aislados en un paso múltiple que comprende procedimiento de lavado. Cardiomiocitos auriculares y ventriculares de apariencia sana sin contracciones espontáneas son entonces inmediatamente se sometió a análisis electrofisiológicos mediante la técnica de patch clamp o otros análisis bioquímicos dentro de las primeras 6 horas después del aislamiento.

Aislamiento de cardiomiocitos adultos murinos procedentes de ratones modificados genéticamente para estudiar la función de genes específicos de interés in vitro se ha convertido en una herramienta poderosa para entender mejor la fisiopatología cardíaca. Este método es utilizado actualmente por sólo un número pequeño pero creciente de laboratorios de ciencias básicas en todo el mundo. Sin embargo, el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares adultos murinos puede ser complicado y necesita ser hecho a fondo y r...

Kv canal disfunción se asocia con arritmias cardíacas. Con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a tales arritmias que utilizan un protocolo sistemático para el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y ventriculares de Kv de canal ratones knockout auxiliares de subunidades. Cardiomiocitos aislados a continuación, puede ser utilizado inmediatamente para estudios electrofisiológicos celulares, bioquímicos o inmunofluorescencia (IF) ensayos.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer cardiomiocitos vivos de las aurículas y los ventrículos de ratones modificados genéticamente para su uso en registros de voltaje y corriente mediante la técnica de "patch clamp" en células completas y otros experimentos. Esto se logra primero mediante la extirpación cuidadosa, pero rápida, del corazón de un animal anestesiado. El segundo paso consiste en conectar el corazón extirpado y canulado al aparato LOR.A continuación, se realiza una perfusión retrograda del corazón con solución de colagenasa para aflojar el tejido conectivo; el último paso consiste en disociar el tejido tirando suavemente de él con pinzas finas y suspender las células con una punta de pipeta de plástico ensanchada y pulida al fuego. Después de esto, las células se resuspenden progresivamente con una solución rica en calcio. Finalmente, se utiliza la técnica de registro de parche en célula completa para mostrar las diferencias en las corrientes de los canales de potasio activados por voltaje.La principal ventaja de este método es que se obtendrá una buena cantidad de cardiomiocitos ventriculares y de HL con buenas características para experimentos posteriores. Por lo general, los científicos nuevos en este método tendrán dificultades porque se necesita mucha práctica para realizar con precisión este procedimiento y obtener resultados realmente buenos. Yo, tras inyectar los anestésicos y 250 UI de heparina, me aseguro de que el ratón esté profundamente anestesiado pellizcando la cola para comprobar el reflejo de retirada.A continuación, traslade el ratón a la mesa de operaciones en posición supina. Luego realice una incisión en la piel y en la pared abdominal por debajo del apéndice xifoides. Para realizar la toracotomía en concha de almeja.Extienda el corte hacia ambos lados a lo largo del arco costal. Posteriormente, corte las costillas en la línea axilar media y levante la caja torácica hacia arriba. A continuación, abra el pericardio y localice los grandes vasos.Presione suavemente el corazón para mostrar mejor la aorta. Luego sujete la aorta utilizando un par de pinzas. Levante el corazón con cuidado y coloque un par de tijeras debajo del corazón para disecar todos los vasos conectores con un solo corte.Asegúrese de conservar una parte suficientemente grande de la aorta ascendente para la canulación con el dispositivo Lor. A continuación, transfiera inmediatamente el corazón extraído a una placa de Petri llena con solución fría y pre enfriada con hielo. En este procedimiento, canule la aorta con una cánula de acero de 1,8 French y asegúrese de evitar el embolismo aéreo.A continuación, fije la aorta a la cánula con un hilo quirúrgico. Después, lave las coronarias con un mililitro de solución Uno. Conecte la cánula a un aparato de Langendorff para evitar lesiones por isquemia-reperfusión prolongada en el miocardio.Asegúrese de realizar los procedimientos desde la toracotomía hasta la canulación L endorf en menos de 120 segundos. Luego, después de llenar previamente la bobina de calentamiento del sistema L endorf con solución libre de calcio, dos. Perfunda el corazón con 10 mililitros de esta solución a cuatro mililitros por minuto.Posteriormente, perfunda el corazón con solución de colagenasa. Tres veces durante ocho minutos a cuatro mililitros por minuto. Ahora transfiera el corazón a una placa de Petri de 100 milímetros precalentada que contenga solución con bajo contenido de calcio. Cuatro.Retire cuidadosamente el tejido aórtico y otros tejidos no cardíacos con tijeras. Luego separe las aurículas y los ventrículos, y mantenga los tejidos auricular y ventricular sumergidos en una pequeña cantidad de solución. Cuatro. Para aislar los cardiomiocitos auriculares, transfiera las aurículas a una placa de cultivo separada de 100 milímetros previamente calentada.Disocie el tejido separándolo suavemente con pinzas finas y asegúrese de que el tejido esté casi completamente disociado. A continuación, use una pipeta de un mililitro con una punta de pipeta de plástico ampliada y pulida con llama para suspender las células en un mililitro de solución. Cuatro para células auriculares y cinco mililitros de solución.Cuatro durante cinco minutos para las células ventriculares. Después de eso, separe las células de los restos utilizando un filtro celular de 200 micrones de tamaño de malla. Centrifugue las células en solución cuatro durante un minuto para las células auriculares y durante dos minutos para las células ventriculares a temperatura ambiente a 16 × g en una cabina de cultivo celular, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en cinco mililitros de solución.Cinco para las células atriales y aproximadamente entre 20 y 25 mililitros. Para las células ventriculares, agite suavemente el tubo para resuspender el pellet celular y centrifugue nuevamente durante un minuto a temperatura ambiente a 16 × g. Tras la segunda centrifugación, deseche el sobrenadante nuevamente y resuspenda el pellet en cinco mililitros de solución. Seis para las células atriales y alrededor de 20 a 25 mililitros para las células ventriculares.Luego, permita la sedimentación de las células durante 10 minutos. En una cabina de cultivo celular, retire el sobrenadante y posteriormente cuente las células. Para estudios de electrofisiología, agregue de 25 a 50 mililitros de la solución seis a las células para estudios de electrofisiología.Mantenga los miocitos en la solución seis en un tubo de 50 mililitros e inhiba la sedimentación. Para la tinción inmunofluorescente. Prepare un recipiente de cultivo celular con cubreobjetos de vidrio recubiertos con solución de laminina a una concentración final de 50 microgramos por mililitro.Incube el recipiente de cultivo celular con laminina en PBS durante dos horas a 37 grados Celsius. A continuación, retire la solución de laminina. Antes de sembrar los miocitos bajo un microscopio, siembre las células y controle la densidad celular.Deje que los miocitos se adhieran al cubreobjetos durante una hora a 37 grados Celsius en 2% CO₂. Después de una hora, retire la solución e inicie inmediatamente con el protocolo estándar de tinción. Luego incube los miocitos con el fijador.Por ejemplo, 4%PFA en PBS a pH 7.5 durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice tres pasos de lavado con PBS de cinco minutos cada uno para permeabilizar las células y evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Incube los miocitos con suero al 10%, Triton al 0.3% y BSA al 0.2% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de eso, incubarlos con el anticuerpo primario durante una hora a 37 grados Celsius y lavarlos como se describió anteriormente. Posteriormente, incubar con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente para contratiñir los núcleos y la alfa actinina. Incubar el anticuerpo secundario con DPI y fenilfluorocromo conjugado durante una hora a temperatura ambiente.Después del lavado, transfiera con cuidado las laminillas de vidrio a las portaobjetos tratadas con solución salina. Luego, incruste las células en el medio de montaje para fluorescencia para realizar grabaciones mediante el método de "patch clamp" en células completas. Transfiera los cardiomiocitos con aspecto saludable a la cámara de perfusión llenada con un volumen definido de solución extracelular para baño.Utilice el equipo adecuado para el registro de "patch clamp" y pipetas de registro con resistencias de tres a cinco megaohmios cuando se llenan con solución intracelular. Para registros estándar de "patch clamp", después de haber realizado el sellado celular y establecido un sello en gigaohmios, utilice un protocolo estándar para medir las corrientes de potasio induciendo corrientes salientes de potasio mediante un voltaje de 4,5 segundos. Pasos desde menos 60 milivoltios hasta 50 milivoltios en incrementos de 10 milivoltios. Asegúrese de que las corrientes de fuga sean siempre menores a 100 picoamperios.Para diferenciar las diferentes corrientes de potasio, utilice inhibidores específicos como la tetraaminopiridina, la heteropodina, la toxina o el tetraetilamonio. Las soluciones stock deben prepararse en solución extracelular para baño y aplicarse directamente en la proximidad más cercana posible a la célula mediante una micropunta. Después de las grabaciones de línea base.Debe permitirse un periodo de equilibración de dos a tres minutos antes de comenzar las grabaciones tras la aplicación del fármaco. Al final, analice los datos fuera de línea utilizando el software P clamp 10.3 o un software comparable. Esta figura muestra un cardiomiocito ventricular ejemplar teñido con DPI y LOR 4 88 Phin. Y aquí se presentan los trazos ejemplares del registro de parche de célula entera.Esta figura muestra un cardiomiocito auricular ejemplar teñido con DPI y fihina conjugada con fluorocromo. Y aquí se presentan los trazos ejemplares del registro de parche de célula completa. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora y media si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar cardiomiocitos auriculares y ventriculares de ratones modificados genéticamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca...

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.

Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (&lt;50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.

Modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos

Aprenda a aislar miocitos auriculares y ventriculares de ratones modificados genéticamente para estudios de electrofisiología cardíaca mediante la técnica de patch clamp. Este protocolo permite analizar corrientes de canales de potasio.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

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