Name: El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a marcar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila melanogaster usando colorante lipofílico y microscopía confocal. Esta técnica permite visualizar la morfología neuronal en contextos de expresión GFP.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la DFG en GMT

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Una ventaja importante de Drosophila como sistema modelo es que permite el análisis del desarrollo y la función en el nivel de células individuales. Esto es especialmente útil en relación con el sistema nervioso, donde la diversidad de tipos de células es excepcionalmente alta y la función y la morfología de las células vecinas pueden ser totalmente diferentes. El método que aquí presentamos permite el etiquetado de las neuronas individuales con un colorante que puede ser transforma...

El conocimiento de la morfología neuronal a nivel de células individuales es una condición previa esencial para la comprensión de la conectividad neuronal y la función del SNC. Así, desde los primeros días de la neurociencia, los investigadores han tratado de desarrollar técnicas de marcaje de células individuales (véase 7 para un tratamiento histórico de este número). Los métodos clásicos, tales como la tinción de Golgi proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal, pero no son adecuados si se busca una etiqueta en un tipo particular de neurona en forma dirigida, como la tinción se produce de una manera aleatoria. El desarrollo de métodos para la tinción de las células individuales por inyección intracelular o juxtacellular de colorantes de un microelectrodo se dirigió a la exigencia de un etiquetado específico. La aplicación de una sola neurona de inyección de tinte para Drosophila presentó un desafío importante, debido al tamaño pequeño de tanto el organismo y sus neuronas. Sin embargo, la tinción única neurona de embriones de Drosophila </em&gt; Neuronas se logró a mediados de la década de 1980 en el laboratorio de Corey Goodman 15. Mientras que el método ha sido eminentemente útil y ha dado algunas ideas clave sobre los mecanismos para el desarrollo neuronal en Drosophila en los últimos 20-30 años (por ejemplo, 2, 10), muchos trabajadores se han negado a ello, en gran parte debido a sus exigencias técnicas. La disponibilidad en los años más recientes de técnicas genéticas para el etiquetado neuronal en Drosophila también ha contribuido a la impopularidad de la inyección de un solo tinte neurona. GAL4 expresión dirigida de los constructos de GFP específicos de membrana puede proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal 1, 20. Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones: la expresión a menudo inevitable de GFP en las células múltiples puede oscurecer la estructura de las neuronas individuales, y una línea GAL4 conductor puede no estar disponible para conducir la expresión en una neurona particular de interés. El MARCM (Análisis Mosaico con un representantemarcador de células ressible) 8 método puede proporcionar un etiquetado de esencialmente cualquier neurona en el nivel de células individuales, pero no puede ser utilizado con éxito en el embrión y larva temprana debido a la lenta rotación de la proteína GAL80. Dadas estas limitaciones de etiquetado genética, creemos que la inyección neurona solo tinte en el embrión de Drosophila sigue siendo una técnica valiosa y merece una aplicación más amplia. Para promover este objetivo, ofrecemos aquí una descripción detallada del método. Una ilustración de su potencia es proporcionada por nuestra cuenta reciente de la morfología de la serie completa de interneuronas en neuromeres abdominales de finales de los años 14 embrión de Drosophila. Este estudio, que reveló tanto la variabilidad morfológica de los distintos tipos de células neuronales y los principios de organización neuromere en el SNC del embrión, no habría sido posible con cualquier otro método de etiquetado disponibles en la actualidad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml en 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml en etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehído</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% en PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% en PBS </td></tr><tr><td> Heptano Glue </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluir ca. 1 a 1 con n-heptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> para ver y documentar etiquetados de la fluorescencia </td></tr><tr><td> DC - unamplifier </td><td> Dragan Corporación </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> para preparar y diseccionar embriones </td></tr><tr><td> Piso Capilares </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diámetro exterior 1 mm, grosor de 0,1 mm glas </td></tr><tr><td> Inyección Capilares </td><td> Science Products </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador R </td><td> Leica </td><td></td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Modelo P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> para tirar de los capilares </td></tr><tr><td> Diapositivas Objetos </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Científico </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 MOT </td><td> para ver etiquetados después fotoconversión </td></tr><tr><td> Microscopio Científico </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Sony MC3255 cámara de vídeo </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> para grabar etiquetados después de fotoconversión </td></tr></tbody></table> Tabla 1.

el marcaje de células individuales en el sistema nervioso central de<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

En este artículo se describe cómo etiquetar individualmente las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila melanogaster por inyección juxtacellular del lipofílico fluorescente Dil marcador de membrana. Este método permite la visualización de la morfología de las células neuronales en gran detalle. Es posible marcar cualquier célula en el SNC: cuerpos celulares de las neuronas diana son visualizadas bajo óptica DIC o por expresión de un marcador genético fluorescente tal como GFP. Después del marcaje, el Dil se puede transformar en una permanente mancha marrón por fotoconversión para permitir la visualización de la morfología celular con luz transmitida y la óptica DIC. Alternativamente, las células marcadas con Dil se puede observar directamente con la microscopía confocal, permite genéticamente introducidos proteínas indicadoras fluorescentes que se colocalizaban. La técnica se puede utilizar en cualquier animal, independientemente del genotipo, haciendo posible el análisis de fenotipos mutantes con una resolución de célula individual.

La Figura 4 ilustra los resultados típicos de la técnica, como se describe aquí. Figura 4A muestra un ejemplo de un Dil llena interneuron único que se photoconverted limpiamente. Es muy bien demuestra la cantidad de detalle que ofrecen estas preparaciones. Cuando se observa bajo la óptica DIC el contexto espacial de la celda marcada dentro del tejido circundante no marcado se hace visible, por ejemplo, la posición del cuerpo de la celda dentro de la corteza y de la proyección d...

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones, lo que permite el análisis de la morfología neuronal ya sea por la luz transmitida o microscopía confocal.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila en etapa temprana 17. Esto se logra recolectando huevos y permitiendo que se desarrollen hasta la etapa correcta. El segundo paso del procedimiento es clorar y alinear manualmente los huevos.Después de esta diva, la colonización y filetación de los embriones hace que el cordón nervioso sea accesible. El paso final es etiquetar las células individuales mediante la aplicación de Iono retic del ojo de matriz lipofílica. En última instancia, los resultados permiten la visualización de la morfología de una sola neurona si se desea en el contexto de patrones de expresión de GFP conocidos y/o en un fondo mutante.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de marcaje de células individuales existentes como markum es que funciona en el embrión y permite visualizar las células identificadas de forma intencionada. La demostración visual de este método es extremadamente útil ya que muchos pasos son delicados y, por lo tanto, difíciles de aprender. Permita que las moscas sanas pongan embriones en placas de agar.Volver a colocar la placa cada hora y media a 25 grados centígrados y retener los embriones. Incubar los embriones en sus placas a 25 o 18 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de desarrollo requerida. Cuando esté listo, transfiera los embriones a un portaobjetos cubierto con cinta adhesiva de doble cara.Evite transferir agar con los embriones, ya que interferirá con su adhesión a la cinta. En la cinta. Deje que los embriones se sequen durante cinco a 10 minutos mientras espera.Cubra un cubreobjetos de 24 milímetros por 60 milímetros con pegamento de heptano. Coloque una pequeña gota de pegamento en el centro del portaobjetos y extiéndala en una película muy delgada usando un cubreobjetos cuadrado de 18 milímetros. Una vez que los embriones se hayan secado, tóquelos suavemente con una aguja.El corion se abrirá y el embrión se pegará a la aguja. Transfiera inmediatamente los embriones declorados a un bloque de agar para evitar que se sequen. Alinéalos allí 10 en fila, con los lados ventrales hacia arriba.Corta el exceso de agar del bloque con un bisturí. A continuación, toque suavemente los embriones con el cubreobjetos recubierto de pegamento heptano. Deben adherirse al cubreobjetos con los lados ventrales hacia abajo.Aplique un marco de cinta adhesiva alrededor del cubreobjetos y fíjelo a un portaobjetos de microscopio. Mantener los embriones en la parte superior de la cubreobjetos. Cubra los embriones con cantidades generosas de PBS en el lado dorsal de cada embrión cerca de su extremo posterior.Penetra en la membrana vitel con una aguja de vidrio, rompe la membrana a lo largo de la línea media dorsal y arrastra al embrión fuera de la membrana. Ahora reoriente el embrión con el lado ventral hacia abajo en otra parte del sustrato de pegamento de heptano. Lime el embrión con una aguja de vidrio perforando suavemente la pared del cuerpo y rasgando a lo largo de la línea media dorsal.Con la aguja, empuje hacia abajo la pared del cuerpo para que se pegue a la corredera. Desgarra el intestino en sus extremos anterior y posterior, y levanta el intestino. Dado que varios embriones se archivarán en la misma diapositiva, es útil ser muy preciso con su orientación o hacer un dibujo de su orientación.A continuación, los embriones pueden fijarse ligeramente durante 10 a 15 minutos en formaldehído al 7,4% en PBS, seguido de cuatro lavados en PBS, con extremo cuidado para evitar tocar los embriones con la superficie de la solución. Las fuerzas de tensión superficial los destruirán bajo un objetivo de 10 x. Centre el campo de visión en un embrión preparado, aumente el aumento y ubique la célula de interés bajo óptica DIC o bajo fluorescencia.Si la célula objetivo expresa GFP, asegúrese de que el diafragma de campo del microscopio esté abierto justo hasta el borde del campo de visión, no más allá de una iluminación estrecha. El haz ayudará a colocar la micropipeta, cambiar de nuevo al objetivo 10 x y colocar el electrodo de baño para el amplificador de CC en la solución, lejos del embrión y de la trayectoria de la micropipeta. Monte la micropipeta de inyección llena de solución de cloruro de litio en el soporte y conéctela al micromanipulador.Usando los controles de curso, coloque la micropipeta debajo del objetivo y muy por encima del embrión. Si el ángulo del micro peppe es demasiado pronunciado, la punta no se enfocará. Si es demasiado poco profundo, el eje se ensuciará contra el centro de la pared del baño y la punta en el campo de visión.Ahora baje la micropipeta y enfoque alternativamente hasta que la pipeta esté en el PBS y no demasiado por encima del embrión. Ahora cambie a un objetivo de alta potencia y centre la pipeta dentro del campo de visión. Cuando el eje esté enfocado, mueva la micropipeta en el eje X hasta que su punta se encuentre en el centro del campo de visión.La punta de la micropipeta debe estar muy por encima del nivel del embrión. Cambie a la iluminación de fluorescencia y examine la punta. Verifique si hay fugas de tinte en el ojo.Ajuste la corriente continua para que el cristal del ojo del tinte no se acumule en la punta. Ahora baje la micropipeta en el eje Z hacia el embrión. Ajustar progresivamente el enfoque a medida que el embrión entra en foco.Cambie a usar el control fino. Enfoque la célula que se va a inyectar en el centro del campo y, a continuación, vuelva a enfocar la punta de la micropipeta. A partir de este punto, podría ser más conveniente utilizar el control de etapa del microscopio para mover el embrión en relación con la micropipeta.Ponga la punta de la micropipeta en contacto con la célula y haga una depresión en su superficie. Pase varios nano amperios de corriente despolarizante durante unos segundos. Se formará un pequeño cristal de tinte en la célula para confirmar que la célula ha sido marcada.Abra brevemente el obturador para iluminar el campo con luz fluorescente. Si el cuerpo de la celda muestra signos de etiquetado, aplique corriente durante varios segundos más. A continuación, apague la corriente y separe rápidamente el embrión de la micropipeta con los controles de etapa.Si no se evidenció el etiquetado del ojo D, es posible que la micropipeta se haya bloqueado y necesite ser reemplazada. Si la punta de la pipeta engancha otros tejidos de la raíz de la célula y mancha ese tejido, intente retirar ligeramente la micropipeta y vuelva a acercarse a la célula antes de recurrir a la sustitución de la micropipeta según sea necesario. Continúe marcando otras células en el mismo embrión o en otros embriones en el mismo portaobjetos.Mueva la punta hasta el borde del campo de visión y repita el procedimiento. Retire la mayor parte de la solución en la cámara de inyección. A continuación, fije los embriones añadiendo un 7,4% de formaldehído PBS durante 10 minutos, seguido de cuatro lavados con PBS.La preparación ahora se puede convertir en una foto o montarla para microscopía confocal utilizando el protocolo descrito. Una interneurona llena de dai se convirtió sin problemas bajo óptica DIC. El contexto espacial de la célula marcada dentro del tejido circundante no marcado se resolvió bien.Por ejemplo, las posiciones del cuerpo celular dentro de la corteza y de la proyección de la fibra dentro de la píldora neuro se pudieron ver en esta preparación. La gota de tinte era un poco demasiado grande. Varias células vecinas se marcaron simultáneamente, lo que dificulta la relación de las proyecciones individuales con cuerpos celulares distintos.También observe que bajo el microscopio fluorescente, la resolución del fondo es mucho menor sin conversión de fotos. También se pueden inyectar múltiples células en segmentos vecinos en esta preparación, un anticuerpo contra dos tinciones rápidas de fales en la píldora neuro. A pesar de los cuerpos celulares claros, la preparación muestra un posible efecto secundario de períodos prolongados de fotoconversión.Las células marcadas más intensamente tienden a mancharse y comenzar a hincharse en comparación con el etiquetado de una sola célula con óptica confocal. El marcaje ocular con tinte en embriones portadores de constructos reporteros de GFP puede proporcionar el contexto espacial y la identidad de la célula llena de D dentro de poblaciones específicas de tipos de células neuronales o gliales GFP positivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y realizar marcamientos de neuronas individuales en el SNC embrionario después de la oph.Pero mientras intenta este procedimiento, tenga en cuenta que cada paso es exigente, así que espere un par de repeticiones hasta que todo el procedimiento se desarrolle sin problemas.

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Investigación

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Fuente: Inal, M. A. et. al., Trazado retrógrado de Drosophila neuronas motoras embrionarias utilizando tintes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el método de etiquetado retrógrado de las neuronas motoras Drosophila utilizando tintes lipofílicos. El tinte entra en el axón, viaja retrógradamente y etiqueta las neuronas de color verde, lo que permite una visualización detallada de su morfología y proyecciones bajo un microscopio confocal.

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Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

Aprende a marcar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila melanogaster usando colorante lipofílico y microscopía confocal. Esta técnica permite visualizar la morfología neuronal en contextos de expresión GFP.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de

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