Name: El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a marcar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila melanogaster usando colorante lipofílico y microscopía confocal. Esta técnica permite visualizar la morfología neuronal en contextos de expresión GFP.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la DFG en GMT

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<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
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<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Una ventaja importante de Drosophila como sistema modelo es que permite el análisis del desarrollo y la función en el nivel de células individuales. Esto es especialmente útil en relación con el sistema nervioso, donde la diversidad de tipos de células es excepcionalmente alta y la función y la morfología de las células vecinas pueden ser totalmente diferentes. El método que aquí presentamos permite el etiquetado de las neuronas individuales con un colorante que puede ser transforma...

El conocimiento de la morfología neuronal a nivel de células individuales es una condición previa esencial para la comprensión de la conectividad neuronal y la función del SNC. Así, desde los primeros días de la neurociencia, los investigadores han tratado de desarrollar técnicas de marcaje de células individuales (véase 7 para un tratamiento histórico de este número). Los métodos clásicos, tales como la tinción de Golgi proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal, pero no son adecuados si se busca una etiqueta en un tipo particular de neurona en forma dirigida, como la tinción se produce de una manera aleatoria. El desarrollo de métodos para la tinción de las células individuales por inyección intracelular o juxtacellular de colorantes de un microelectrodo se dirigió a la exigencia de un etiquetado específico. La aplicación de una sola neurona de inyección de tinte para Drosophila presentó un desafío importante, debido al tamaño pequeño de tanto el organismo y sus neuronas. Sin embargo, la tinción única neurona de embriones de Drosophila </em&gt; Neuronas se logró a mediados de la década de 1980 en el laboratorio de Corey Goodman 15. Mientras que el método ha sido eminentemente útil y ha dado algunas ideas clave sobre los mecanismos para el desarrollo neuronal en Drosophila en los últimos 20-30 años (por ejemplo, 2, 10), muchos trabajadores se han negado a ello, en gran parte debido a sus exigencias técnicas. La disponibilidad en los años más recientes de técnicas genéticas para el etiquetado neuronal en Drosophila también ha contribuido a la impopularidad de la inyección de un solo tinte neurona. GAL4 expresión dirigida de los constructos de GFP específicos de membrana puede proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal 1, 20. Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones: la expresión a menudo inevitable de GFP en las células múltiples puede oscurecer la estructura de las neuronas individuales, y una línea GAL4 conductor puede no estar disponible para conducir la expresión en una neurona particular de interés. El MARCM (Análisis Mosaico con un representantemarcador de células ressible) 8 método puede proporcionar un etiquetado de esencialmente cualquier neurona en el nivel de células individuales, pero no puede ser utilizado con éxito en el embrión y larva temprana debido a la lenta rotación de la proteína GAL80. Dadas estas limitaciones de etiquetado genética, creemos que la inyección neurona solo tinte en el embrión de Drosophila sigue siendo una técnica valiosa y merece una aplicación más amplia. Para promover este objetivo, ofrecemos aquí una descripción detallada del método. Una ilustración de su potencia es proporcionada por nuestra cuenta reciente de la morfología de la serie completa de interneuronas en neuromeres abdominales de finales de los años 14 embrión de Drosophila. Este estudio, que reveló tanto la variabilidad morfológica de los distintos tipos de células neuronales y los principios de organización neuromere en el SNC del embrión, no habría sido posible con cualquier otro método de etiquetado disponibles en la actualidad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml en 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml en etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehído</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% en PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% en PBS </td></tr><tr><td> Heptano Glue </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluir ca. 1 a 1 con n-heptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> para ver y documentar etiquetados de la fluorescencia </td></tr><tr><td> DC - unamplifier </td><td> Dragan Corporación </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> para preparar y diseccionar embriones </td></tr><tr><td> Piso Capilares </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diámetro exterior 1 mm, grosor de 0,1 mm glas </td></tr><tr><td> Inyección Capilares </td><td> Science Products </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador R </td><td> Leica </td><td></td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Modelo P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> para tirar de los capilares </td></tr><tr><td> Diapositivas Objetos </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Científico </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 MOT </td><td> para ver etiquetados después fotoconversión </td></tr><tr><td> Microscopio Científico </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> para llevar a cabo los etiquetados </td></tr><tr><td> Sony MC3255 cámara de vídeo </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> para grabar etiquetados después de fotoconversión </td></tr></tbody></table> Tabla 1.

el marcaje de células individuales en el sistema nervioso central de<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

En este artículo se describe cómo etiquetar individualmente las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila melanogaster por inyección juxtacellular del lipofílico fluorescente Dil marcador de membrana. Este método permite la visualización de la morfología de las células neuronales en gran detalle. Es posible marcar cualquier célula en el SNC: cuerpos celulares de las neuronas diana son visualizadas bajo óptica DIC o por expresión de un marcador genético fluorescente tal como GFP. Después del marcaje, el Dil se puede transformar en una permanente mancha marrón por fotoconversión para permitir la visualización de la morfología celular con luz transmitida y la óptica DIC. Alternativamente, las células marcadas con Dil se puede observar directamente con la microscopía confocal, permite genéticamente introducidos proteínas indicadoras fluorescentes que se colocalizaban. La técnica se puede utilizar en cualquier animal, independientemente del genotipo, haciendo posible el análisis de fenotipos mutantes con una resolución de célula individual.

La Figura 4 ilustra los resultados típicos de la técnica, como se describe aquí. Figura 4A muestra un ejemplo de un Dil llena interneuron único que se photoconverted limpiamente. Es muy bien demuestra la cantidad de detalle que ofrecen estas preparaciones. Cuando se observa bajo la óptica DIC el contexto espacial de la celda marcada dentro del tejido circundante no marcado se hace visible, por ejemplo, la posición del cuerpo de la celda dentro de la corteza y de la proyección d...

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones, lo que permite el análisis de la morfología neuronal ya sea por la luz transmitida o microscopía confocal.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila en etapa temprana 17. Esto se logra recolectando huevos y permitiendo que se desarrollen hasta la etapa correcta. El segundo paso del procedimiento es clorar y alinear manualmente los huevos.Después de esta diva, la colonización y filetación de los embriones hace que el cordón nervioso sea accesible. El paso final es etiquetar las células individuales mediante la aplicación de Iono retic del ojo de matriz lipofílica. En última instancia, los resultados permiten la visualización de la morfología de una sola neurona si se desea en el contexto de patrones de expresión de GFP conocidos y/o en un fondo mutante.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de marcaje de células individuales existentes como markum es que funciona en el embrión y permite visualizar las células identificadas de forma intencionada. La demostración visual de este método es extremadamente útil ya que muchos pasos son delicados y, por lo tanto, difíciles de aprender. Permita que las moscas sanas pongan embriones en placas de agar.Volver a colocar la placa cada hora y me

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En este artículo se muestra cómo disecar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

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Fuente: Inal, M. A. et. al., Trazado retrógrado de Drosophila neuronas motoras embrionarias utilizando tintes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el método de etiquetado retrógrado de las neuronas motoras Drosophila utilizando tintes lipofílicos. El tinte entra en el axón, viaja retrógradamente y etiqueta las neuronas de color verde, lo que permite una visualización detallada de su morfología y proyecciones bajo un microscopio confocal.

Marcaje retrógrado de neuronas motoras de Drosophila mediante colorantes lipofílicos fluorescentes

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