El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar neuronas individuales en el sistema nervioso central de embriones de Drosophila en etapa temprana 17. Esto se logra recolectando huevos y permitiendo que se desarrollen hasta la etapa correcta. El segundo paso del procedimiento es clorar y alinear manualmente los huevos.

Después de esta diva, la colonización y filetación de los embriones hace que el cordón nervioso sea accesible. El paso final es etiquetar las células individuales mediante la aplicación de Iono retic del ojo de matriz lipofílica. En última instancia, los resultados permiten la visualización de la morfología de una sola neurona si se desea en el contexto de patrones de expresión de GFP conocidos y/o en un fondo mutante.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de marcaje de células individuales existentes como markum es que funciona en el embrión y permite visualizar las células identificadas de forma intencionada. La demostración visual de este método es extremadamente útil ya que muchos pasos son delicados y, por lo tanto, difíciles de aprender. Permita que las moscas sanas pongan embriones en placas de agar.

Volver a colocar la placa cada hora y media a 25 grados centígrados y retener los embriones. Incubar los embriones en sus placas a 25 o 18 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de desarrollo requerida. Cuando esté listo, transfiera los embriones a un portaobjetos cubierto con cinta adhesiva de doble cara.

Evite transferir agar con los embriones, ya que interferirá con su adhesión a la cinta. En la cinta. Deje que los embriones se sequen durante cinco a 10 minutos mientras espera.

Cubra un cubreobjetos de 24 milímetros por 60 milímetros con pegamento de heptano. Coloque una pequeña gota de pegamento en el centro del portaobjetos y extiéndala en una película muy delgada usando un cubreobjetos cuadrado de 18 milímetros. Una vez que los embriones se hayan secado, tóquelos suavemente con una aguja.

El corion se abrirá y el embrión se pegará a la aguja. Transfiera inmediatamente los embriones declorados a un bloque de agar para evitar que se sequen. Alinéalos allí 10 en fila, con los lados ventrales hacia arriba.

Corta el exceso de agar del bloque con un bisturí. A continuación, toque suavemente los embriones con el cubreobjetos recubierto de pegamento heptano. Deben adherirse al cubreobjetos con los lados ventrales hacia abajo.

Aplique un marco de cinta adhesiva alrededor del cubreobjetos y fíjelo a un portaobjetos de microscopio. Mantener los embriones en la parte superior de la cubreobjetos. Cubra los embriones con cantidades generosas de PBS en el lado dorsal de cada embrión cerca de su extremo posterior.

Penetra en la membrana vitel con una aguja de vidrio, rompe la membrana a lo largo de la línea media dorsal y arrastra al embrión fuera de la membrana. Ahora reoriente el embrión con el lado ventral hacia abajo en otra parte del sustrato de pegamento de heptano. Lime el embrión con una aguja de vidrio perforando suavemente la pared del cuerpo y rasgando a lo largo de la línea media dorsal.

Con la aguja, empuje hacia abajo la pared del cuerpo para que se pegue a la corredera. Desgarra el intestino en sus extremos anterior y posterior, y levanta el intestino. Dado que varios embriones se archivarán en la misma diapositiva, es útil ser muy preciso con su orientación o hacer un dibujo de su orientación.

A continuación, los embriones pueden fijarse ligeramente durante 10 a 15 minutos en formaldehído al 7,4% en PBS, seguido de cuatro lavados en PBS, con extremo cuidado para evitar tocar los embriones con la superficie de la solución. Las fuerzas de tensión superficial los destruirán bajo un objetivo de 10 x. Centre el campo de visión en un embrión preparado, aumente el aumento y ubique la célula de interés bajo óptica DIC o bajo fluorescencia.

Si la célula objetivo expresa GFP, asegúrese de que el diafragma de campo del microscopio esté abierto justo hasta el borde del campo de visión, no más allá de una iluminación estrecha. El haz ayudará a colocar la micropipeta, cambiar de nuevo al objetivo 10 x y colocar el electrodo de baño para el amplificador de CC en la solución, lejos del embrión y de la trayectoria de la micropipeta. Monte la micropipeta de inyección llena de solución de cloruro de litio en el soporte y conéctela al micromanipulador.

Usando los controles de curso, coloque la micropipeta debajo del objetivo y muy por encima del embrión. Si el ángulo del micro peppe es demasiado pronunciado, la punta no se enfocará. Si es demasiado poco profundo, el eje se ensuciará contra el centro de la pared del baño y la punta en el campo de visión.

Ahora baje la micropipeta y enfoque alternativamente hasta que la pipeta esté en el PBS y no demasiado por encima del embrión. Ahora cambie a un objetivo de alta potencia y centre la pipeta dentro del campo de visión. Cuando el eje esté enfocado, mueva la micropipeta en el eje X hasta que su punta se encuentre en el centro del campo de visión.

La punta de la micropipeta debe estar muy por encima del nivel del embrión. Cambie a la iluminación de fluorescencia y examine la punta. Verifique si hay fugas de tinte en el ojo.

Ajuste la corriente continua para que el cristal del ojo del tinte no se acumule en la punta. Ahora baje la micropipeta en el eje Z hacia el embrión. Ajustar progresivamente el enfoque a medida que el embrión entra en foco.

Cambie a usar el control fino. Enfoque la célula que se va a inyectar en el centro del campo y, a continuación, vuelva a enfocar la punta de la micropipeta. A partir de este punto, podría ser más conveniente utilizar el control de etapa del microscopio para mover el embrión en relación con la micropipeta.

Ponga la punta de la micropipeta en contacto con la célula y haga una depresión en su superficie. Pase varios nano amperios de corriente despolarizante durante unos segundos. Se formará un pequeño cristal de tinte en la célula para confirmar que la célula ha sido marcada.

Abra brevemente el obturador para iluminar el campo con luz fluorescente. Si el cuerpo de la celda muestra signos de etiquetado, aplique corriente durante varios segundos más. A continuación, apague la corriente y separe rápidamente el embrión de la micropipeta con los controles de etapa.

Si no se evidenció el etiquetado del ojo D, es posible que la micropipeta se haya bloqueado y necesite ser reemplazada. Si la punta de la pipeta engancha otros tejidos de la raíz de la célula y mancha ese tejido, intente retirar ligeramente la micropipeta y vuelva a acercarse a la célula antes de recurrir a la sustitución de la micropipeta según sea necesario. Continúe marcando otras células en el mismo embrión o en otros embriones en el mismo portaobjetos.

Mueva la punta hasta el borde del campo de visión y repita el procedimiento. Retire la mayor parte de la solución en la cámara de inyección. A continuación, fije los embriones añadiendo un 7,4% de formaldehído PBS durante 10 minutos, seguido de cuatro lavados con PBS.

La preparación ahora se puede convertir en una foto o montarla para microscopía confocal utilizando el protocolo descrito. Una interneurona llena de dai se convirtió sin problemas bajo óptica DIC. El contexto espacial de la célula marcada dentro del tejido circundante no marcado se resolvió bien.

Por ejemplo, las posiciones del cuerpo celular dentro de la corteza y de la proyección de la fibra dentro de la píldora neuro se pudieron ver en esta preparación. La gota de tinte era un poco demasiado grande. Varias células vecinas se marcaron simultáneamente, lo que dificulta la relación de las proyecciones individuales con cuerpos celulares distintos.

También observe que bajo el microscopio fluorescente, la resolución del fondo es mucho menor sin conversión de fotos. También se pueden inyectar múltiples células en segmentos vecinos en esta preparación, un anticuerpo contra dos tinciones rápidas de fales en la píldora neuro. A pesar de los cuerpos celulares claros, la preparación muestra un posible efecto secundario de períodos prolongados de fotoconversión.

Las células marcadas más intensamente tienden a mancharse y comenzar a hincharse en comparación con el etiquetado de una sola célula con óptica confocal. El marcaje ocular con tinte en embriones portadores de constructos reporteros de GFP puede proporcionar el contexto espacial y la identidad de la célula llena de D dentro de poblaciones específicas de tipos de células neuronales o gliales GFP positivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y realizar marcamientos de neuronas individuales en el SNC embrionario después de la oph.

Pero mientras intenta este procedimiento, tenga en cuenta que cada paso es exigente, así que espere un par de repeticiones hasta que todo el procedimiento se desarrolle sin problemas.