Name: El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprende a establecer cultivos líquidos polarizados de células Calu-3 usando el sistema Transwell para estudiar la función epitelial respiratoria. Este método eficiente permite evaluar la polarización mediante TEER y fluoresceína sódica.

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Los autores desean agradecer a Elisabeth Blanchard por su asistencia técnica. Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

1. Cultivo de células Calu-3 para el uso en las culturas Transwell Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Para descongelar las células de almacenamiento de congelados: <ol><li> Preparar medio esencial mínimo de Eagle que contiene 20% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 0,1 mM no aminoácidos esenciales, 2 mM L-glutamina, y 10 mM de HEPES, pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtro estéril el medio preparado usando un 0,2 micras de tamaño de poro del filtro, y caliente en un baño de agua a 37 ° C. Para ser más reflexiva del entorno in situ en el epitelio de las vías respiratorias, medio no está suplementado con antibióticos o antimicóticos. </li><li> Descongelar un criovial congelado de Calu-3 células rápidamente (&lt;1 min) en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 ml estéril y añadir 30 ml de EMEM-20 calentado% + S. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sin refrigeración, y con la velocidad de frenado bajo. </li><li> Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de EMEM caliente-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. Semilla 2 a 5 x 10 6 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C, 7% de CO 2 en la atmósfera de aire hasta que las células son 75% - 80% confluente. Revise diariamente, hasta 7 días que sean necesarios. Cada 3-4 días aspirar el medio de las células y reemplazar con agua fresca EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Para las células subcultura: <ol><li> Tripsina 0,05% tibia - 0,02% de EDTA en un baño de agua a 37 ° C. Aspirar el medio de las células, y lavar las células una vez con tripsina calentada 0,05% - 0,02% de EDTA para eliminar el exceso de medio y suero. Eliminar el lavado y añadir 1 ml de tripsina calentado por pocillo a las células. </li><li> Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 y el monitor bajo un microscopio cada 5 minutos hasta al menos 75% de células se separen del pozo (s) de la placa de cultivo de tejidos. Esto puedetomar entre 5 y 30 min. </li><li> Lavar las células en EMEM-20% + S para eliminar el exceso de tripsina. Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo cónico de 50 ml estéril. Varios pocillos de las células de una placa de cultivo de 6 pocillos se pueden mezclar en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir 30 ml de EMEM-20% + S y sedimentar las células por centrifugación a 1,000-1,200 × g, sin necesidad de refrigeración, y con velocidad baja de freno. </li><li> Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en EMEM fresco-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. El uso de pasos a través de 1.2.1 1.2.3 arriba para Tripsinizar las células, las células continúan subcultivo en placas de cultivo de tejido como se describe en los pasos a través de 1.2.5 1.2.7 cuando están entre 75 - 80% confluente. </li><li> Subcultivo de un pocillo de una placa de 6-y hasta un T-25 cm 2 matraz en un volumen final de 5 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / matraz. </li><li> Uso de 5 ml de tripsina calentado por T-25 cm 2 matraz para separar las células, subcultivode un T-25 cm 2 matraz hasta un T-75 cm 2 matraz en un volumen final de 10 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 1 a 5 x 10 6 células / matraz. </li><li> Con 8 ml de tripsina calentado por T-75 cm 2 frasco para desprender las células, subcultura de un T-75 cm 2 frasco en 2 T-75 cm 2 frascos. Para el crecimiento celular óptimo, no células de subcultivo en matraces mayores de T-75 cm 2 o subcultivo en una proporción mayor que matraz de matriz 1: 3 frascos nuevos. </li></ol></li><li> Una vez que las células han sido subcultivadas, completamente quitar y reemplazar medio cada 2 a 3 días hasta que alcanzan 75-90% de confluencia. Las células pueden tomar hasta 3 semanas para llegar a 75-90% confluencia. Para la generación óptima de las culturas polarizadas, células subcultura antes de que crezcan más allá del 90% de confluencia en forma de monocapa. </li><li> Continuar con las células de subcultivo hasta que las células han crecido suficientes para sembrar el número deseado de inserciones Transwell. Cada inserto Transwell requiere 2 × 10 5 células. Para obtener un rendimiento óptimo de la generación de cultivos polarizados, utilizar células que han sufrido no más de 10 subcultivos. </li></ol> 2. Crecimiento polarizadas Calu-3 líquido cubiertas Culturas (LCC) Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Preparar EMEM que contenía FBS al 10% (EMEM-10%) y se calienta en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar una placa de 24 pocillos Transwell para la siembra. Utilizando pinzas estériles, inserciones Transwell de mover desde el interior de las filas exteriores de la placa sin tocar la membrana de inserción. Las células sólo se debe subcultivar en pocillos en las filas exteriores de la placa. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, añadir 600 l de EMEM-10% a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li><li> Separar las células de T-75 cm 2 de tejido. Subculture matraces usando tripsina calentado, y lavar con 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tratadas con tripsina, como se describe en el paso 1,2. </li><li> A fondo resuspender las células lavadas en 5 ml de EMEM-10% pipeteando suavemente arriba y abajo. </li><li> Determinar el recuento de células viables y totales por el método de exclusión con azul de tripano. Procede sólo si 80% - 90% son viables. </li><li> En un tubo cónico de 50 ml estéril, diluir las células a una concentración de 2 x 10 6 células viables / ml con EMEM-10%. </li><li> Añadir las células en el compartimiento apical de cada Transwell. A los pocillos A1 y D1, que será libres de células pocillos de control, es decir, espacios en blanco, añadir 100 ml de EMEM-10% sin células. Para cada uno de los pocillos restantes, añadir 100 ml de resuspensión de Calu-3 células, inclinando suavemente la pipeta contra el canal de guía interior de la pared del inserto y liberando lentamente las células. No toque la pipeta a la membrana de inserción. Para mantener una suspensión homogénea de Calu-3 células, agitar suavemente la suspensión celulardurante esta etapa de siembra. </li><li> Incubar la placa Transwell a 37 º C y 7% de CO 2 en atmósfera de aire. Colocar la placa en una incubadora donde perturbación física será mínimo. Para mejorar la eficiencia de la polarización, no se apilan las placas en la parte superior de la otra. </li><li> Para mantener los cultivos hasta polarizada y listo para usar en los experimentos, reemplazar completamente medio en transwells, como se describe en los pasos a través de 2,10 2,13 continuación. Medio debe ser reemplazado por completo tres días después de que se subcultivan en transwells, y luego en un ciclo de alternancia entre el día cuarto y tercero continuación, después de la alimentación anterior, hasta que las células son completamente polarizada. </li><li> Warm EMEM-10% en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Suavemente aspirar medio de inserciones Transwell. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero la eliminación de medio apical de todos los pocillos, y tla eliminación de gallina medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. </li><li> Añadir 200 l de EMEM-10% para el compartimento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a los pocillos sembrados, dirigir el medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. </li><li> Añadir 600 l de EMEM-10% de los compartimentos basolaterales. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, se añade medio a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li></ol> 3. Evaluación del Desarrollo de la Resistencia de Calu-3 LCC Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Evaluar trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min después decambios de medio; la evaluación se puede realizar después de cada cambio de medio, si se desea. Realizar mediciones bajo condiciones estériles. Comenzar las mediciones con pozos el control libre de células A1 y D1 (los espacios en blanco) para obtener mediciones de referencia, y continuar con las mediciones para cada pocillo. <ol><li> En condiciones estériles, transferir el electrodo stx2 a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 70% de etanol en agua estéril, y esterilizar 15 min. </li><li> Calibrar y probar el voltohmmeter para uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Retire el electrodo del etanol, el aire seco 5-10 segundos, y enjuague el electrodo con agua estéril EMEM-10%. </li><li> Ajuste el selector de modo de la voltohmmeter al ajuste de resistencia y encender el equipo. </li><li> Suavemente coloque el electrodo en uno de los 3 puertos que permiten el acceso al compartimiento basolateral de una cultura Transwell. Coloque el electrodo para que la iniciativa es sólo toque ligeramente el fondo del pozo externo y se mantiene vertical,y el cable más corto es en el medio de cultivo tisular del compartimiento apical, sin tocar la membrana de inserción. </li><li> Empuje &quot;Medida R&quot; botón, y esperar a que la lectura se estabilice. Repetir para los otros 2 puertos para cada pocillo y registrar las mediciones de los tres puertos, para un total de tres mediciones por pocillo. Continuar para medir la resistencia de todos los pocillos de células. </li><li> Limpiar el electrodo por remojo 5-10 min en 70% de etanol, lavado en dH 2 O estéril, y secado a fondo. Conservar en el envase original. </li><li> Calcular la resistencia de cada pocillo, utilizando la Ecuación 1. Ω = Ω real de la muestra - Ω en blanco, la ecuación 1 donde la muestra Ω es la medida media de un pozo sin semillas y en blanco Ω es la medida promedio de los 2 pozos, A1 y ​​D1, que contiene las inserciones y medianas, pero las células no. </li><li> Calcular la resistencia unidad de área, utilizando Equación 2. Ω real x = área efectiva de la membrana × Ω cm 2, la ecuación 2 donde el área efectiva de la membrana es 0,33 cm 2 para 24-así inserciones Transwell. </li></ol></li><li> Compruebe que la polarización se completa mediante la realización de un ensayo secundario, la medición de la difusión pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral, de una a tres cultivos Transwell. Los pozos utilizados para el ensayo de fluoresceína sódica deben ser desechados inmediatamente después de la finalización del ensayo. <ol><li> Prepare no fluorescente tampón (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril; filtro estéril con 0,45 micras dispositivo de filtración ). Preparar fluoresceína de sodio a 1 mg / ml en tampón no fluorescente, filtro estéril, envolver en papel de aluminio, y se almacenan a 4 ° C, protegido de la luz. Calentar a habitación temvolver antes de su uso. </li><li> Después de completar las mediciones de resistencia, retirar cuidadosamente medio de los compartimentos apical y basolateral de uno a tres cultivos individuales Transwell. </li><li> Enjuague culturas Transwell. Suavemente añadir 600 l a temperatura ambiente estéril PBS de Dulbecco (D-PBS) a los compartimentos basolaterales y 100 l a temperatura ambiente estériles D-PBS a los compartimentos apical. </li><li> Retire con cuidado D-PBS de los pozos. Añadir 600 l estéril no fluorescente tampón a los compartimentos basolaterales. Añadir 100 l estéril de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio a los compartimentos apical. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hr. CO 2 no es necesario durante esta incubación. </li><li> Durante la incubación, preparar una curva estándar de fluoresceína sódica que oscila entre 20 mg / ml y 0 g / ml, utilizando no fluorescente tampón para diluir la fluoresceína sódica. Preparar al menos 8 diferentes concentraciones de fluoresceína de sodio, cada uno en un volumen final de al menos 600 l. Mantenerdiluciones de la curva estándar protegido de la luz hasta el momento de medir la absorbancia. </li><li> Transferir la muestra tampón no fluorescente desde el compartimento basolateral de cada Transwell de prueba a un tubo limpio separado para el análisis. Eliminar la prueba transwells utilizado para examinar la difusión pasiva de fluoresceína de sodio de la placa y desechar. Devolver la placa con transwells restantes a la incubadora. </li><li> Coloque 100 l de cada solución estándar por triplicado en un 96-pocillos de fondo plano placa. </li><li> Preparar tres diluciones de cada muestra basolateral (1:2, 1:20, y 1:50) en tampón no fluorescente, y añadir 100 ml de cada muestra no diluida y de cada dilución, en duplicado, en un 96-bien plana placa de fondo. </li><li> Medir la absorbancia de la muestra en un lector de placas de ELISA a 486 nm o 490 nm. </li><li> Determinar la concentración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral mediante la comparación de la absorbancia de las muestras en contra de los valores de absorbancia de la fluoresceína sódica stAndard curva. </li></ol></li></ol> 4. Infección Polarized Calu-3 LCC con virus respiratorio Medidas de seguridad: Realizar todos los procedimientos en un gabinete de seguridad biológica usando técnica de cultivo estéril, a un nivel de bioseguridad adecuado para el virus que se utiliza. <ol><li> Diluir virus en EMEM libre de suero de modo que los inóculos deseado sería en 100 l. </li><li> Lavar las células en EMEM libre de suero. Suavemente aspirar medio de todos los pocillos, eliminando el medio apical luego el medio basolateral. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero eliminando el medio apical de todos los pocillos, y después eliminando el medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. <ol><li> Añadir 100 l de EMEM libre de suero para el compartimiento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, y después a tél sin semillas pocillos, dirigiendo medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. </li><li> Añadir 600 l de EMEM libre de suero a los compartimentos basolaterales. Añadir medio a cada Transwell inclinando la pipeta contra la pared del compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li><li> Suavemente aspire el suero libre de medio de pozos. </li></ol></li><li> Empezando con los pozos no infectados o infectados mock-, añadir las diluciones adecuadas de virus para el compartimento apical de transwells. Para los pozos no infectados, añadir 100 ml de EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells apropiados, por infección simulada pocillos, añadir 100 l de virus libre de la preparación diluida en EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells adecuadas, y por infección por virus, virus diluir en EMEM libre de suero y añadir 100 ml de los compartimentos apical de transwells apropiadas. </li><li>Añadir 600 l de EMEM libre de suero para todos los compartimentos basolaterales. </li><li> Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 2 horas. </li><li> Aspirar el medio de pozos, en primer lugar de los pozos infectados y no infectados por el simulacro, luego de los pozos infectados. Eliminar los sobrenadantes apicales primero, seguidos por los sobrenadantes basolateral. </li><li> Reemplazar medio con 200 l de EMEM-10% en los compartimentos apical y 600 l de EMEM-10% en los compartimentos basolaterales. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Al establecer Calu-3 LCC en inserciones Transwell, las células no pueden polarizar en absoluto, o no puede polarizar completamente, tal como se define por una TEER ≥ 1000 Ω × 2 cm y ≤ sodio 1% de fluoresceína de equilibrado colorante entre los compartimentos apical y basolateral. Además, Calu-3 células en LCC puede polarizar completamente, pero TEER pueden ser incompatibles entre mediciones. A pesar de las fluctuaciones en las mediciones TEER de Calu-3 LCC son normales en el día a día, una vez completamente polarizados, cambios dramáticos en TEER no se espera hasta que el cultivo disminuye naturalmente con la edad, que puede ser tan poco como 5 semanas o hasta semanas 12 después de la siembra. La capacidad de Calu-3 LCC para polarizar depende en parte de cómo las células se mantienen y se subcultivaron antes de su uso en el sistema Transwell. Las células que han crecido más allá de 90% de confluencia como una monocapa durante el subcultivo, que han sido subcultivadas más de 10 veces de stock congelado, o que no han seren suministrada con medio fresco en un horario regular son menos propensos a polarizar completamente, y cualquier polarización es probable que disminuya rápidamente. Incompleta o falta total de polarización también se puede atribuir a la variación en el material y el tamaño de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, y de lote a lote variación en transwells de composición similar y tamaño del poro puede afectar también a la polarización. Aumentar tamaños de poro puede permitir Calu-3 a crecer a través de la membrana Transwell en el compartimento basolateral, la prevención de la cultura de polarización. Una ausencia de polarización también puede ser debido al crecimiento bacteriano, se indica por medio de cultivo turbio, que conduce a la posterior ruptura de las uniones estrechas entre las células Calu-3. Medidas variables TEER de Calu-3 LCC puede ser causada por alteraciones mecánicas de las monocapas de células Calu-3 LCC, inserciones, o las propias placas. Cambios en el medio y las mediciones TEER deberán realizarse sin puntas de pipeta o electroconduce de tocar las células. Durante la realización de estas operaciones, se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos apical y basolateral, que interrumpen la capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia. La capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia en una cultura que es en realidad polarizada puede también limitada por la acumulación de proteínas en los conductores de los electrodos. Esta acumulación puede ser retirado con lijado suave, o puede ser corregida mediante la sustitución del electrodo. Una vez Calu-3 LCC completamente polarizar y la TEER está aumentando ya no, Calu-3 LCC están listos para su uso como un modelo in vitro para la caracterización de las respuestas del huésped epiteliales de pulmón de células a la infección respiratoria. Este sistema permite una mejor caracterización de las respuestas de dirección a los patógenos en comparación con monocapa de cultivo de pulmón de células líneas tradicionalmente utilizados para estudiar patógenos respiratorios, tales como A549 y células HEp-2, con las ventajas adicionales de Calu-3 bei LCCng más rápida a desarrollar, se obtiene más fácilmente, y menos costoso para generar a primaria, y NHBE polarizado y diferenciado. Al igual que NHBE, polarizado Calu-3 demuestran la formación de uniones estrechas, y producen mucinas. Sin embargo, a diferencia de NHBE, polarizadas Calu-3 células no se diferencian en capas de células basales y de células epiteliales columnares ciliadas, y pocos polarizadas 3 Calu-células se desarrollan como cilios-proyecciones 19. Así, aunque útil para examinar las respuestas polarizadas de las vías respiratorias células epiteliales respiratorias insulto, polarizado Calu-3 LCC no son un modelo ideal para estudiar el desarrollo de las vías respiratorias o remodelación en respuesta al insulto respiratorias o lesiones. Producción de moco por las células cultivadas in vitro pueden afectar la infectividad celular, así como la liberación de virus infeccioso y la propagación del virus en un modelo polarizado, y una comparación directa de la producción de moco entre polarizada Calu-3 LCC y NHBE polarizado y diferenciado no ha sido reportado . A549 y células HEp-2 avolver más fáciles de cultivar que Calu-3 células, sin embargo, a diferencia de Calu-3 LCC, no formar cultivos polarizados cuando se cultivan en insertos Transwell, y por lo tanto no son modelos ideales para el examen in vitro de las respuestas de las células epiteliales polarizadas a la infección por virus respiratorio .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina - EDTA al 0,02% </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Inactivan por calor, 56 º C, 30 minutos </td></tr><tr><td> No esenciales aminoácidos 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Almacenar a 4 ° C en la oscuridad </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS EMEM-10% (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM con FBS inactivado por calor al 10% de suero, esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> EMEM-20% de FBS + suplementos (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM a concentraciones finales: FBS inactivado por calor, 20%; 1X aminoácidos; 2 mM L-glutamina; 10 mM de HEPES; estéril-filtro </td></tr><tr><td> 24-así placas Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 micras de tamaño de poro, poliéster </td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Prepare un 70% utilizando estéril dH 2 O </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> No fluorescente tampón </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril, estéril filtro </td></tr><tr><td> Fluoresceína sódica </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml en agua estéril no fluorescente tampón; estéril-filtro, proteger de la luz; almacenar a 4 º C hasta 6 meses </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stx2 electrodo </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lector de placas ELISA </td><td></td><td></td><td> Capaz de medir un 486 o 490 A </td></tr></tbody></table>

el establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; in vitro</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Las superficies apical y basolateral de las células epiteliales de las vías respiratorias demostrar respuestas direccionales de la exposición patógeno in vivo. Por lo tanto, ideal en modelos in vitro para el examen de las respuestas celulares a patógenos respiratorios polarizan, formando superficies apical y basolateral. Uno de estos modelos se diferencian normales células epiteliales bronquiales humanas (NHBE). Sin embargo, este sistema requiere muestras de tejido pulmonar, la experiencia aislar y cultivar células epiteliales de tejido, y el tiempo para generar una cultura interfase aire-líquido. Calu-3 células, derivadas de un adenocarcinoma bronquial humano, son un modelo alternativo para el examen de la respuesta de las células epiteliales de vías respiratorias proximales al insulto respiratoria 1, los compuestos farmacológicos 2-6, 7-9 y bacterianas y patógenos virales, incluyendo el virus de la influenza, rinovirus y el síndrome respiratorio agudo severo - coronavirus asociado al 10-14. Recientemente, we demostrado que Calu-3 células son susceptibles a virus sincitial respiratorio (RSV) en una manera consistente con NHBE 15,16. Aquí, detalles de la creación de un polarizada, líquido cubierto de cultivo (LCC) de Calu-3 células, centrándose en los detalles técnicos de crecimiento y cultivo de células Calu-3, el mantenimiento de las células que han sido cultivadas en LCC, y se presenta el método para realizar la infección de virus respiratorio polarizadas Calu-3 células. Para obtener de forma polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células deben ser cuidadosamente subcultivaron antes de cultivar en inserciones Transwell. Calu-3 cultivos en monocapa debe permanecer por debajo de 90% de confluencia, se debe subcultivar menos de 10 veces de stock congelado, y regularmente debe ser suministrado con medio fresco. Una vez cultivadas en transwells, Calu-3 LCC debe ser manejado con cuidado. Los cambios de medios irregulares y la interrupción mecánica o física de las capas de células o placas de polarización para impactar negativamentevarias horas o días. La polarización se controla mediante la evaluación de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y se verificó mediante la evaluación de la equilibración pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral 17,18. Una vez mesetas TEER igual o superior a 1000 Ω x cm 2, Calu-3 LCC está listo para usar para examinar la respuesta celular a los patógenos respiratorios.

Cuando se cultiva como líquido cubiertas de cultivos (LCC) en sistemas de cultivo Transwell, como se ilustra en la Figura 1, Calu-3 células en desarrollo, se polarizan las distintas superficies apical y basolateral. Siguiendo el método descrito aquí, la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de Calu-3 LCC alcanza una meseta en o por encima de 1.000 Ω cm × 2 a 3 semanas después de la siembra, un ejemplo del cual se muestra en la Figura 2. Las uniones estrechas formadas entre células polarizadas prevenir equilibrado pasiva de pequeñas moléculas entre los compartimentos apical y basolateral. Así, un ensayo de fluoresceína sódica modificada de equilibración se utiliza para confirmar la polarización de Calu-3 LCC 15,17,18. Como la TEER de monocapas de células Calu-3 en incrementos de LCC, la cantidad de fluoresceína que pasivamente se equilibra en el compartimento basolateral disminuye. Una vez que la TEER es 1.000 Ω cm × 2, la cantidad de fluoresceína que se equilibra enpara el compartimento basolateral está ≤ 1%, como se muestra en la Figura 3, por lo tanto, Calu-3 LCC se considera que son completamente polarizada cuando la TEER es ≥ 1.000 Ω × 2 cm. La medición TEER pico de Calu-3 LCC puede variar de experimento a experimento. Sin embargo, una vez TEER meseta valores para cualquier experimento dado, totalmente polarizado, sin infectar Calu-3 LCC puede ser estable durante 5 hasta las 12 semanas post-siembra. La ausencia de desarrollo de resistencia en Transwell-cultivadas Calu-3 puede ser causado por varios factores, tal como se indica en la Tabla 1. Una vez que la TEER de Calu-3 mesetas LCC en o por encima de 1.000 Ω cm × 2, el modelo está listo para ser utilizado para examinar las vías respiratorias respuestas de las células epiteliales de los patógenos respiratorios, incluyendo el virus sincitial respiratorio (RSV). La exposición a los resultados de RSV en una disminución más rápida de la integridad de la cultura polarizada en comparación con una maqueta de la infección de células (Figura 4). Figura 1. Células sección transversal de representación de Transwell-cultivos de células. Se cultivan en la superficie apical de la membrana de inserción. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figura 2. Desarrollo de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y la polarización de Calu-3 células después de la siembra en insertos Transwell. En cada punto de tiempo, TEER se presentan como mediana Ω cm x 2 ± SEM de 32 pocillos independientes de un experimento representativo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figura 3. Pasivo equili<html> calibración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral de las monocapas de células Calu-3 es inhibida como células polarizado. Los datos acumulados de cuatro experimentos independientes se presenta. Cada punto de datos representa una medición individual. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figura 4. Infección por el RSV de polarizado Calu-3 LCC acelera la disminución de integridad de la monocapa. Polarized Calu-3 células fueron infectadas con RSV-A2 a una MOI = 1 en el día 0, y la polaridad se monitorizó durante 8 semanas después de la infección. Un experimento representativo se muestra. Los datos se presentan como mediana resistencia de 8 pocillos independientes por infección ± SEM por punto de tiempo. * P &lt;0,05 entre culturas maqueta y RSV-A2-infectados, según se determina mediante el t-test. formas &quot;&gt; <tbody><tr><td> Cuestión </td><td> Resolución (s) </td></tr><tr><td> La resistencia no es mensurable </td><td><ul><li> Eliminar las burbujas de aire en los pozos </li><li> Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces </li><li> No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa </li><li> Comprobar que las células no están creciendo en el plástico muy por debajo de la pieza de inserción (lo que indica que las células pueden haber crecido a través de los poros de la pieza de inserción) </li><li> Permita 2-3 semanas después de la siembra para el desarrollo de resistencia completa </li><li> Comprobar la composición y tamaño de poro de insertos utilizados, si es necesario cambiar (inserto de poliéster recomendada, 0,3 micras de tamaño de poro, no revestimientos, materiales para ver detalles) </li><li> Comprobación de la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas desde la punta, y si es necesario sustituir </li><li> Ver medio para el crecimiento bacteriano </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> La resistencia se desarrolla, pero la polarización total (≥ 1000 Ω x cm 2) no se alcanza </td><td><ul><li> Permitir tiempo adicional para la polarización de desarrollar (en ocasiones puede tardar hasta 4 semanas) </li><li> Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces </li><li> No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa </li><li> Consistentemente sustituir medio en cultivos Transwell, alternando entre el cuarto día de la tercera y luego después de la alimentación anterior </li><li> Sólo las células de cultivo en insertos que se colocan en las filas exteriores de las placas </li><li> Usar un lote diferente de inserciones Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Las células completamente polarizar, pero la resistencia no es consistente entre una lectura y la siguiente </td><td><ul><li> No interrumpir ni apile las placas en la incubadora </li><li> No provocan vibraciones en la cabina de bioseguridad mientras Transwell platES se están manejando </li><li> Eliminar las burbujas de aire en los pozos </li><li> No moleste a la capa de células con puntas de pipeta al cambiar los medios de comunicación o la realización de lecturas TEER </li><li> Usar medio 200 l en el compartimento apical; menor volumen puede producir lecturas inestables TEER </li><li> Compruebe la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas en la punta, y reemplazar si es necesario </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Localización de Averías problemas que pueden surgir cuando se cultiva Calu-3 células en transwells. Múltiples factores contribuyen a la polarización completa de Calu-3 células en el líquido cubiertas de cultivos, los más probables de los cuales se destacan en esta tabla.

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un cultivo de líquido polarizado cubierto de células Calú tres utilizando un sistema de cultivo Transwell para establecer el sistema de cultivo Transwell. Primero, prepare una placa de transpocillos moviendo los insertos en las filas exteriores de la placa y agregando medio a las cámaras basolaterales de cada pocillo. El segundo paso es preparar células de cultivo monocapa en suspensiones de una sola célula.A continuación, las células suspendidas se colocan en los compartimentos apicales de los insertos transwell. El paso final es reemplazar completamente los medios laterales apicales y basales. En cultivo, se inserta en un ciclo de tres y luego cuatro días durante dos o tres semanas hasta que las células estén completamente polarizadas.En última instancia, se utiliza la resistencia eléctrica transepitelial y un ensayo de equilibrio pasivo de fluoresceína de sodio para demostrar la polarización de tres cultivos de calu cubiertos de líquido. La principal ventaja de usar esta técnica sobre el uso de células epiteliales bronquiales humanas normales es que Calor tres son más accesibles y se desarrollan más rápidamente en cultivos polarizados Listo para usar Todos los procedimientos para el cultivo de calú polarizado. Se realizan tres cultivos cubiertos de líquido o LCC en una cabina de bioseguridad utilizando técnicas de cultivo estéril.Comience preparando una placa de 24 pocillos. Para la siembra con pinzas estériles, mueva los insertos transwell desde el interior hasta las filas exteriores de la placa sin tocar el inserto. Las células de membrana solo deben subcultivarse en pocillos en las filas exteriores de la placa.A 600 microlitros de EMEM que contengan un 10 % de FBS, denominado en lo sucesivo EMEM 10 % en cada compartimento basolateral. Para evitar la introducción de burbujas de aire, incline la pipeta contra la pared de cada compartimento y libere lentamente el medio en el pocillo. A continuación, separe tres células de Colu de los matraces de cultivo de tejidos y las células de subcultivo como se describe en el texto del protocolo, vuelva a suspender completamente las células lavadas en cinco mililitros de EMEM al 10% pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, determine los recuentos de células viables y totales por el método de exclusión de azul de trian y proceda solo si entre el 80% y el 90% son viables.Luego, en un tubo cónico estéril de 50 mililitros, diluya las células a una concentración de dos veces 10 a las seis células viables por mililitro. Con EMEM 10%añadir 100 microlitros de calú resuspendido tres células al compartimento apical de cada pocillo trans, excepto los pocillos A uno y D uno. Incline suavemente la pipeta contra el canal guía interior de la pared del inserto y libere lentamente las células.No toque la pipeta con la membrana del inserto. Agite suavemente la suspensión de tres celdas CALU durante este paso de asiento para mantener una suspensión homogénea de celdas a los pocillos A uno y D uno, que serán pocillos de control libres de celdas o espacios en blanco a 100 microlitros de EMEM 10% sin celdas. Incubar la placa de pocillos trans a 37 grados Celsius y 7% de dióxido de carbono en la atmósfera de aire en una incubadora donde la perturbación física sea mínima para mejorar la eficiencia de la polarización.No apile placas una encima de la otra tres días después del subcultivo y coloque tres células en los pocillos trans, reemplace el medio completamente aspirado suavemente de los insertos transpocillos utilizando una pipeta capilar conectada a una trampa de vacío con un vacío suave. Primero retire el medio apical de todos los pocillos y luego elimine el medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas del inserto mientras aspira el medio.Añadir 200 microlitros de EMEM 10% al compartimento apical de los pocillos libres de células A uno y D uno. A continuación, a los pocillos asentados, dirigiendo el medio hacia el compartimento apical utilizando el lado del inserto para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente sobre las células y no toque la membrana del inserto.A continuación, añada 600 microlitros de EMEM 10% a los compartimentos laterales basales para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos laterales basales. Añada medio a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberando lentamente el medio en el pocillo. Regrese la placa transwell a la incubadora después de este primer medio. Reemplazo.El medio debe reemplazarse en un ciclo que alterne entre el cuarto y el tercer día después de la alimentación anterior hasta que las células estén completamente polarizadas. La polarización se monitorea evaluando la resistencia eléctrica transepitelial o desgarro del CALU tres LCC utilizando un volter que ha sido calibrado y probado. Para comenzar este procedimiento, retire el electrodo del etanol y séquelo al aire durante cinco a 10 segundos y enjuague el electrodo con EMEM estéril al 10%Coloque el interruptor de modo del volter en la configuración de resistencia y encienda la alimentación.Comience las mediciones con los pozos de control sin celdas para obtener mediciones de referencia y, a continuación, continúe con las mediciones para cada uno. Coloque suavemente el electrodo en uno de los tres puertos que permiten el acceso al compartimento basolateral del cultivo transwell. Coloque el electrodo de modo que el cable más largo toque ligeramente el fondo del pocillo exterior y permanezca vertical.Y el cable más corto está en el medio de cultivo de tejidos del compartimento apical sin tocar la membrana del inserto, presione el botón de medición R y espere a que la lectura se estabilice. Repita para los otros dos puertos de cada pocillo y registre las mediciones de los tres puertos para un total de tres mediciones por pocillo para verificar que la polarización esté completa. Se realiza un ensayo secundario que mide la difusión pasiva de fluoresceína sódica entre los compartimentos apical y basolateral en uno a tres cultivos transpaños.Retire cuidadosamente el medio de los compartimentos basales, laterales y apicales de los cultivos transpocillos que se van a analizar. Enjuague los cultivos transpocillos añadiendo suavemente 600 microlitros de DPBS estériles a temperatura ambiente a los compartimentos basolaterales y 100 microlitros de DPBS estériles a temperatura ambiente a los compartimentos apicales. Retire suavemente los DPBS de los pocillos.Añadir 600 microlitros de tampón estéril no fluorescente a los compartimentos basolaterales, seguidos de 100 microlitros de fluoresceína sódica estéril a los compartimentos apicales. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Después de una hora.Transfiera la muestra tampón no fluorescente desde el compartimento basolateral de cada transpocillo de prueba a un tubo limpio separado. Para el análisis, retire los pocillos de prueba utilizados para examinar la difusión pasiva de fluoresceína de sodio de la placa y deséchelos. Regrese la placa con los transpocillos restantes a la incubadora.Coloque 100 microlitros de cada solución estándar de fluoresceína de sodio previamente preparada por triplicado en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Prepare tres diluciones de cada muestra lateral basal en tampón no fluorescente. Para cada muestra, agregue 100 microlitros de una muestra sin diluir y 100 microlitros de cada dilución por duplicado en una placa de fondo plano de 96 pocillos.Medió la absorbancia de la muestra en un lector de placas EISA a 486 nanómetros o 490 nanómetros. Para comenzar este procedimiento, primero lave las células y el EMEM libre de suero con una pipeta capilar conectada a una trampa de vacío con un medio de aspiración suave de todos los pocillos, eliminando el medio apical seguido del medio basolateral, el medio aspirado de los pocillos libres de células A uno y D, y luego de los pocillos sembrados. No toque las membranas del inserto mientras aspira el medio.Añadir 100 microlitros de EMEM libre de suero al compartimento apical de los pocillos libres de células A uno y D uno, y luego a los pocillos asentados dirigiendo el medio hacia el compartimento apical. Uso del lateral del inserto para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente sobre las células y no toque la membrana del inserto.A continuación, a los 600 microlitros de EMEM libre de suero a los compartimentos basolaterales. Añada medio a cada pocillo trans inclinando la pipeta contra la pared del compartimento y soltando lentamente el medio en el pocillo. Aspire suavemente el medio libre de suero de los pocillos. Comenzando con pocillos no infectados o infectados simulados, agregue las siguientes diluciones de virus al compartimento apical de los pocillos trans apropiados.100 microlitros de EMEM sin suero para pocillos no infectados, 100 microlitros de preparado libre de virus diluidos en EMEM sin suero para pocillos infectados simulados y 100 microlitros de virus diluidos en EMEM libre de suero para virus. Después de eso, a 600 microlitros de EMEM libre de suero en todos los compartimentos basolaterales, incubar a 37 grados centígrados y 7% de dióxido de carbono durante dos horas.Después de dos horas, aspire el medio de los pocillos primero de los pocillos no infectados y simulados, y luego de los pocillos infectados. Eliminar primero los sobrenadantes apicales seguidos de los sobrenadantes laterales basales. Por último, sustituya el medio por 200 microlitros de EMEM, el 10% en los compartimentos apicales y 600 microlitros de EMEM el 10% en los compartimentos basolaterales siguiendo el método demostrado en este vídeo.La resistencia eléctrica transepitelial o desgarro de los cultivos cubiertos de líquido calú tres alcanza una meseta de 1000 m por centímetro cuadrado o más dentro de las tres semanas posteriores a la siembra. Un ejemplo de ello se muestra en esta figura, ya que las uniones estrechas que se forman entre las células polarizadas impiden el equilibrio pasivo de pequeñas moléculas entre los compartimentos apical y basolateral. Se utiliza un ensayo de equilibrio de fluorescencia de sodio modificado para confirmar la polarización de tres cultivos cubiertos de líquido calu.A medida que aumenta el nivel de monocapas de tres células y cultivos líquidos, la cantidad de fluoresceína que se equilibra pasivamente en el compartimento basolateral disminuye, los datos acumulativos de cuatro experimentos independientes se presentan aquí, y cada punto de datos representa una medición individual. Una vez que la lágrima es 1000 propiedad de centímetro cuadrado, la cantidad de fluoresceína que se equilibra en el compartimento basolateral BA es menor o igual al 1%Por lo tanto, se considera que los cultivos cubiertos de líquido calu tres están completamente polarizados cuando el nivel es mayor o igual a 1000 propiedad de centímetro cuadrado. Una vez que el nivel de tres cultivos cubiertos de líquido se estabiliza en o por encima de 1000 por centímetro cuadrado, el modelo está listo para ser utilizado para examinar las respuestas de las células epiteliales de las vías respiratorias a los patógenos respiratorios, incluido el virus respiratorio sincitial o RSV, como se muestra.En este ejemplo, la exposición al VRS representada en rojo da como resultado una disminución más rápida de la cultura polarizada. La integridad comparada con una infección simulada de células representada en los datos azules se presenta como una resistencia media de ocho pocillos independientes por infección, más o menos SEM por punto de tiempo. El asterisco indica que P es inferior a 0,05 entre el simulacro y el RSVA, dos cultivos infectados, según lo determinado por la prueba T del estudiante.No olvide que cuando trabaje con agentes infecciosos, puede ser peligroso y debe usar el EPP adecuado y usar buenas prácticas de laboratorio al realizar estos procedimientos.

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

El presente protocolo describe células alveoidales alveoidales pluripotentes derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iAT2). Estas células pueden cultivarse como esferas autorrenovadoras en cultivo 3D o adaptarse al cultivo de interfaz aire-líquido (ALI).

Generación de esferas 3D y cultivos de interfaz aire-líquido 2D de células epiteliales alveolares pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células madre pluripotentes de tipo 2

Los avances recientes en los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos permiten la derivación gradual de tipos de células específicas de órganos. Aquí, proporcionamos pasos detallados para el mantenimiento y la expansión de las células basales de las vías respiratorias derivadas de iPSC y su diferenciación en un epitelio mucociliar en cultivos de interfaz aire-líquido.

Generación de cultivos de interfaz aire-líquido de células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas

El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

El cultivo de la interfaz aire-líquido se usa comúnmente para desarrollar epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias mediante la diferenciación de células epiteliales bronquiales humanas normales primarias que imitan el lado apical de las vías respiratorias pulmonares. Aquí, describimos un protocolo sencillo para determinar su calidad mediante el monitoreo de sus propiedades biofísicas, como la función ciliar y la integridad de la membrana.

Determinación de la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana del epitelio pseudoestratificado de la vía aérea pulmonar

Este artículo describe la generación de un modelo complejo de barrera multicelular de la vía aérea compuesto por epitelio pulmonar derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), mesénquima, células endoteliales y macrófagos en un cultivo de interfaz aire-líquido.

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

Aprende a establecer cultivos líquidos polarizados de células Calu-3 usando el sistema Transwell para estudiar la función epitelial respiratoria. Este método eficiente permite evaluar la polarización mediante TEER y fluoresceína sódica.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios In vitro (Video) | JoVE Journal

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios

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