El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

El objetivo general de este procedimiento es producir complejos proteicos mediante el uso del sistema de células de insectos del virus baula múltiple. Esto se logra generando primero la construcción multigénica, que codifica el complejo proteico de elección. El segundo paso es crear un virus de baula compuesto que contenga la construcción multigénica mediante la transformación de las células bacterianas y la detección de los medios posteriores correctos.

A continuación, aísle el genoma viral de la baula y utilícelo para infectar células de insectos a pequeña escala en una placa de seis pocillos después de probar la producción de proteínas. El complejo proteico elegido se expresa a mayor escala y se purifica. En última instancia, el complejo proteico purificado se utiliza para descubrir su estructura y función y, potencialmente, para el descubrimiento de fármacos.

Las principales ventajas de esta técnica sobre los sistemas de echovirus existentes son dos. Los complejos MultiPro se pueden producir con inéditos. Además, el material producido es de mucha mayor calidad porque diseñamos el echovirus para una producción óptima de proteínas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden mucho más allá de las cuestiones biológicas básicas. Nuestra plataforma de bolsas múltiples se ha utilizado con éxito para producir proteínas que son nuevas vacunas candidatas prometedoras para una variedad de enfermedades y catalizar la investigación del cáncer mediante la producción de ensamblajes de proteínas clave que causan el crecimiento tumoral. Por lo general, las personas nuevas en este método lucharán un poco con los procesos y la necesidad de esterilidad.

Por lo tanto, hemos trabajado muy duro para establecer procedimientos operativos estándar para que la aplicación de multibanco sea lo más fácil posible para los usuarios no especializados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos robóticos se entienden mucho más fácilmente cuando el proceso se muestra en movimiento. Esto no se puede extraer simplemente mirando los protocolos que están escritos, sin importar cuán detallados sean.

Antes de iniciar este procedimiento, es importante planificar cuidadosamente la estrategia de co-expresión. Se recomienda simular primero el experimento. In silico.

Los genes deben distribuirse en los plásmidos aceptor y donante. Lo que funciona mejor es agrupar subunidades que pueden formar submódulos fisiológicos. Dado que los grandes complejos tienen muchas subunidades de proteínas, muchos genes deben expresarse simultáneamente.

El sistema multi espalda simplifica en gran medida la clonación de genes mediante el uso de rutinas automatizadas para colocar genes en pequeñas moléculas progenitoras de ADN que contienen una secuencia corta de ADN llamada bloqueos P que es reconocida por la enzima recombinasa Cree. Estos progenitores se combinan en una reacción de un solo paso mediante la adición de pre recombinasa, que concatena todo lo que tiene un sitio P lox en un gran plásmido de ADN. Esta construcción multigénica se inserta posteriormente en el genoma del virus de la bula múltiple.

Si se va a generar un gran número de construcciones, se recomienda el uso de scripts robóticos y una estación de trabajo de manejo de líquidos. La estación de trabajo está equipada con un vacío para mini preparaciones y limpieza de PCR, un EEL para la carga automática de muestras de PCR. Un termociclador para PCR y pasos de incubación, un agitador para células de suspensión de resus y bloques fríos.

En el caso de las enzimas, los genes de interés se insertan en donantes y aceptadores seleccionados mediante el uso de enzimas de restricción y ligasa o, alternativamente, mediante el uso de métodos independientes de ligadura que validan todas las construcciones de donantes y aceptores, clonados mediante mapeo de restricción y secuenciación. Proceda a las combinaciones difusas de aceptores donantes mediante la recombinación de CRE LAX P para generar los constructos de expresión multigénica de elección. Las construcciones multigénicas ensambladas se validan mediante reacciones analíticas de PCR con conjuntos de cebadores específicamente diseñados.

Aquí se muestran instantáneas del proceso de TR asistido por robot. Incluyen la preparación de reacciones de PCR en placas de pocillos múltiples, el suministro de ADN molde y cebadores, la amplificación de ADN por PCR y la preparación de construcciones multigénicas cultivadas en cultivo bacteriano por lisis alcalina en placas de pocillos múltiples. Para comenzar este procedimiento, integre vectores de transferencia multigénica en el genoma viral multi bula transformándolo en células DH 10, que albergan el genoma viral y las funcionalidades requeridas para la transposición de TN seven.

Después de TN, se seleccionan siete células de transposición con el virus compuesto de baula que contiene los genes de interés mediante un cribado azul blanco, la transposición exitosa de TN siete da como resultado una pérdida de la complementación alfa del beta galacto. Por lo tanto, las colonias con la transposición correcta de TN siete permanecen blancas en APLs selectivos que contienen xal. Preparar cultivos bacterianos a partir de las colonias blancas y aislar el dorso por lisis alcalina y precipitación de isopropanol de etanol.

A continuación, transfecte células de insectos con el genoma viral bao purificado que trabaja en una campana estéril con alícuotas de semillas de células de insecto SF 21 en fase logarítmica en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. A cada uno, se le agrega el genoma viral bao purificado y un reactivo de transfección mezclado en medios de cultivo. Incubar las células transfectadas a 27 grados centígrados sin movimiento durante 48 a 60 horas.

Después de 48 a 60 horas, coseche el virus inicial o V cero retirando el medio, reponga con medios nuevos y devuelva la placa a la incubadora dos o tres días después, pruebe la producción de proteínas. Y si hay un marcador YFP presente, pruebe la fluorescencia para la amplificación del virus. Utilice V cero, el virus inicial, para infectar de 25 a 50 mililitros de células en fase logarítmica en pequeños matraces agitadores Erlenmeyer agitados en una plataforma orbital.

El agitador cuenta las células y divide las células cada 24 horas hasta que dejen de duplicarse. Siguiendo un régimen de baja multiplicidad de infección o MOI, las células deben duplicarse al menos una vez, de lo contrario, repita el experimento con un volumen menor de V cero agregado. La imagen de la izquierda muestra células de insectos no infectadas después de la infección con el virus baula de espalda múltiple.

Las células de insectos infectadas han dejado de proliferar y han aumentado de tamaño, como se ilustra en la imagen de la derecha. Después de 48 a 60 horas, coseche V un virus mediante la granulación de células. Retire y almacene los medios que contengan el virus.

Resus suspende las células con medios frescos y las transfiere de nuevo al matraz Erlenmeyer. Retire una vez de 10 a las seis células cada 12 o 24 horas mediante peletización y pruebe la producción de proteínas y la señal de proteínas marcadoras si se desean volúmenes de expresión más grandes. Amplifica aún más el virus infectando hasta 400 mililitros de células en matraces agitadores de dos litros con el virus V one.

Siguiendo el régimen de MOI bajo, recomendamos encarecidamente que el virus V one se almacene como virus de producción mediante el uso de células de insectos infectadas con virus ulares o métodos VIC para prevenir modificaciones del virus recombinante y preservar altos niveles de expresión. 24 horas después de la proliferación se observa la detención de las células infectadas con pellets. En esta etapa, las células contienen partículas virales completas justo antes de que se liberen en los medios.

Retire los medios, vuelva a suspender el pellet de la célula en una solución de congelación y realice la congelación de BIIC en tubos criogénicos para los ciclos de producción de proteínas. Utilice alícuotas V uno, V dos o BIC congeladas para infectar cultivos celulares más grandes. Por lo general, 400 mililitros en matraces de dos litros se adhieren al régimen de MOI bajo.

Ajustar el volumen del virus utilizado para la infección de modo que el cultivo infectado se duplique al menos una vez. Si una proteína marcadora de YFP está presente, extraiga una vez 10 a las seis celdas a intervalos definidos, sonique y centrifugue las celdas y transfiéralas a una placa de 96 pocillos, mida los niveles de YFP en un lector de placa estándar de 96 pocillos capaz de registrar señales fluorescentes, monitorear la evolución de la señal YFP hasta que se alcance una meseta, indicando la máxima producción de proteína recombinante. Recoja las células en esta etapa, almacene los gránulos celulares a menos 20 grados Celsius a corto plazo o a menos 80 grados Celsius a largo plazo, las células deben mentirse mediante un método adaptado a los requisitos de la proteína y luego al citosol y los núcleos.

Las proteínas nucleares fraccionadas se encuentran típicamente en la peleta nuclear. Mientras que las proteínas citosólicas permanecen en el citosol. La purificación de proteínas se simplifica enormemente mediante el fraccionamiento.

Dado que se pueden eliminar muchos contaminantes en un solo paso de centrifugación. Los complejos de proteínas se pueden purificar convenientemente a partir de cultivos celulares iniciales a pequeña escala mediante el uso de métodos de purificación miniaturizados, como la purificación basada en pocillos múltiples o micropuntas. Junto con los sistemas de cromatografía de pequeño volumen, como el ACTA micro, un paso futuro será miniaturizar e integrar toda la configuración experimental en una pequeña aplicación de mesa que esté interconectada con la estación de trabajo de clonación.

Aquí se muestra el robot por lotes a microescala actualmente en desarrollo, que se utilizará para este propósito. La fuerte coexpresión de proteínas heterólogas se logra mediante el sistema multi espalda, como se muestra aquí. Las prohibiciones de proteínas sobreexpresadas son claramente discernibles en el extracto de célula entera, WCE y el lisado aclarado.

La calidad y cantidad del material proteico producido suele ser suficiente. Permite la determinación estructurada de complejos de proteínas, como el complejo de punto de control mitótico MCC que se muestra en este diagrama. A menudo, el rendimiento de estas series de purificación analítica es suficiente para analizar la estructura y la función del complejo purificado por una variedad de medios, incluida la microscopía electrónica.

Los procedimientos operativos estándar que desarrollamos permiten a los usuarios no especializados aplicar nuestro enfoque con facilidad y nuestra tecnología se puede utilizar en muchos laboratorios interesados en grandes complejos de proteínas, de forma muy similar a como es el caso hoy en día de las proteínas pequeñas en Nikola. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar multi bag para producir sus complejos de proteínas de interés en cantidad y calidad inigualables para sus ambiciosos objetivos de investigación. Trabajar con nuestros sistemas no requiere condiciones especiales de seguridad.

Sin embargo, ten en cuenta que el virus te infectará si eres descuidado, aunque no se replique en tus células. Por lo tanto, es imprescindible manejar con cuidado las condiciones de los esteroides al realizar este procedimiento. Nuestro método se ha vuelto bastante popular en más de 600 laboratorios en todo el mundo.

Usa nuestra técnica. Creemos que en el futuro, nuestro método se convertirá en una parte integral de los esfuerzos de genómica estructural a gran escala que abordan la zona compleja humana. Esto puede ayudar a revelar las bases de las enfermedades y, a largo plazo, conducir a nuevos y mejores medicamentos y terapias.