La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

El objetivo general del siguiente experimento es medir las propiedades mecánicas del glicocálix endotelial utilizando un microscopio de fuerza atómica o un FM. Esto se logra mediante un primer cultivo, una monocapa de células endoteliales bajo un flujo fisiológico en un biorreactor con el fin de construir la capa de glicocálix como segundo paso. Las perlas del tamaño de una micra se unen a un voladizo FM y se utilizan como sonda para medir la fuerza resistiva del cuerpo celular y el glicocálix durante la indentación. A continuación, se ajustan las curvas de indentación con un modelo de dos capas para determinar el módulo y el espesor del glicocáliz, se obtienen resultados que muestran que el glicocálix endotelial tiene un módulo de 0,7 kilopascales y un espesor de 380 nanómetros en base al análisis de dos capas.

Hola, soy Rick Wa.Soy catedrático de Ingeniería Biomédica en la Universidad de Rochester. En los últimos años se ha debatido mucho sobre el posible papel del glicocálix endotelial en la inflamación, en particular sobre si podría actuar como una barrera protectora para evitar la adhesión celular no deseada durante la inflamación. Una de las claves para resolver las cuestiones que rodean este tema es la capacidad de medir las propiedades físicas, es decir, el grosor y la rigidez de esta capa, tanto en condiciones normales como durante la respuesta inflamatoria.

Soy Graham Marsh. Soy estudiante de posgrado en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester. El gran problema para caracterizar el glicocálix endotelial es que es increíblemente blando.

El enfoque que se nos ocurrió es fijar un cordón grande a la punta del voladizo A an A A FM para que las fuerzas medidas se puedan resolver con el A FM.To comenzar este procedimiento, construya una cámara de flujo como la que se muestra aquí, capaz de hacer crecer células bajo un esfuerzo cortante de 1.0 Pascal. Prepare la cámara de flujo para el experimento limpiando primero los portaobjetos de vidrio en solución de piraña durante 15 minutos. Enjuagarlas tres veces con agua destilada y secarlas a 70 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, cubra los portaobjetos con amino propil trixi, cy lane o apte por deposición de vapor. Agregue un mililitro de apte a un matraz que está conectado a la cámara de vacío con la muestra. A continuación, tape el matraz y extraiga un vacío de 0,7 bar durante una hora.

Durante este tiempo, actualice la aspiradora tres veces. A continuación, corte una nueva junta de cámara de flujo a partir de una lámina de silicona de 0,4 milímetros de grosor utilizando una herramienta de corte silhouette SD. El canal mide 6,4 milímetros de ancho por 19 milímetros de largo, y el diámetro exterior se corta a 35 milímetros para que quepa en el plato de cultivo del asilo.

Usando estas dimensiones, calcule el caudal necesario para generar una tensión pura de un pascal con la ecuación que se muestra aquí. Q representa el caudal. Tau es el puro estrés.

Mu es la viscosidad del medio. H es la altura del canal y W es el ancho de la cámara de flujo. El siguiente paso es alinear la pieza superior de la cámara de flujo con la junta en el plato de cultivo celular y asegurarla con un anillo magnético.

Conecte los puertos de flujo en el plato de cultivo celular a tres válvulas de onda con líneas a las jeringas de 30 mililitros. A continuación, esterilice todo el conjunto enjuagándolo con alcohol isopropílico durante cinco minutos. A continuación, retira el alcohol y deja que se seque al aire en el pañuelo.

Capucha de cultivo Precaliente el suero de ternera fetal al 4% en el medio McCoy a 37 grados centígrados. Después de dejarlo secar durante cinco a 10 minutos, enjuague el alcohol que quede con 30 mililitros de suero fetal precalentado. A continuación, llene las jeringas con 20 mililitros de medio de crecimiento veek MCDB 1 31.

A continuación, tape las jeringas para evitar la contaminación. Al sacar el sistema de la campana estéril, coloque la tapa del depósito de captura con la aguja que llega al fluido para extraer el medio de regreso al depósito aguas arriba. Por último, coloque filtros estériles de 0,2 micras en las entradas de aire de las tapas de la vena umbilical humana de la próxima cosecha.

Células endoteliales cultivadas hasta la confluencia en un matraz T 25. Vuelva a suspender las células peletizadas a 100.000 células por mililitro en medio y extraiga la solución en una jeringa. A continuación, inyecte la suspensión en la cámara de flujo a través de la válvula de tres vías.

Deje que las células se asienten y se adhieran al sustrato de vidrio durante dos horas. Antes de comenzar el flujo, mueva el biorreactor y las células a una incubadora donde se permite que las células se asienten y se adhieran durante dos horas. La tubería que conecta los depósitos a una bomba peristáltica pasa a través de la parte posterior de la incubadora Una vez que las células se hayan adherido, ajuste la bomba peristáltica al caudal deseado.

Los medios se mueven entre los depósitos, creando una carga de presión y un flujo a través del biorreactor que produce un esfuerzo cortante de pared de un pascale. Deje que las células se incuben con flujo continuo a 37 grados centígrados durante uno a cinco días hasta que la cámara esté confluente. Para comenzar la preparación del voladizo, limpie una punta más un voladizo FM en ácido nítrico durante cinco minutos, seguido de un enjuague con agua destilada.

Una vez seco, funcionalice el voladizo con apdi en una cámara de deposición de vapor como se muestra anteriormente para los portaobjetos de vidrio. Luego prepare una solución de cinco miligramos por mililitro en peso de NHS Sulf O lc, biotina en la solución salina tamponada de Hank. Sumerge los voladizos en la solución durante 15 minutos.

Esta reacción conjuga el CY y el óxido hidroxilado final y presenta moléculas de biotina en la superficie de los voladizos. El día anterior, comience a preparar una solución de medio libre de biotina combinando 20 mililitros de medio de cultivo vexcel que contenga 20% de suero con 200 microlitros de perlas recubiertas de strept ENC, e incube durante 12 horas mientras gira. El día del experimento.

Tire de las perlas magnéticas hasta el fondo del tubo con un imán durante dos minutos y transfiera el sobrenadante que contiene biotina a un nuevo tubo. Esterilice el medio pasándolo a través de un filtro de 0,22 micrómetros y colóquelo en un tubo nuevo. El siguiente paso es quitar la cámara de flujo de la placa de cultivo celular y luego lavar las células tres veces con dos mililitros de 37 grados Celsius, medio libre de biotina.

A continuación, añada un microgramo de 2,4 micrómetros de diámetro, con cuentas recubiertas de Aden peladas. Agregue una concentración de 10 microgramos por mililitro en la placa de cultivo celular y mezcle suavemente. A continuación, calibre el tib A FM fijándolo a un cordón de pelar y presionándolo contra una superficie de vidrio liso.

Para lograr esto, coloque la punta en la superficie del vidrio junto a una cuenta, retraiga la punta, luego coloque el vértice del voladizo sobre la cuenta y presione hacia abajo durante varios segundos. Por último, utilice el voladizo calibrado para indentar las muestras. Las perlas de 2,4 micrómetros ofrecen un área de contacto más grande con la superficie de la celda para que las propiedades mecánicas de la capa blanda de glicocálix se puedan detectar más fácilmente.

Para lograr esta posición, el voladizo sobre una celda cerca del núcleo de la célula, utiliza un enfoque suave de la punta sobre la celda para establecer la altura del voladizo aproximadamente tres micrómetros por encima de la superficie de la célula. A continuación, indentar la superficie 20 veces a una velocidad de un micrómetro por segundo hasta una fuerza máxima de siete. Los nanonewtons permiten que transcurran seis segundos de tiempo entre contactos sucesivos.

Calcula el grosor de la capa de glicocálix utilizando ecuaciones relacionadas con la teoría de los hercios. La fuerza de indentación F se describe mediante esta ecuación, donde delta es la profundidad de indentación. R es el radio de la esfera y estar es el módulo combinado de los materiales sometidos a tensión.

Con el fin de separar el módulo elástico combinado en componentes celulares y glicocálicos, trate la capa de glicocálix como una película blanda uniforme y delgada en la superficie del cuerpo celular y use el modelo de dos capas de Clifford y C.In esta ecuación, PQ y N son constantes empíricamente determinadas a partir de ajustes de polímeros. M es una constante del modelo de polímero, y Z está relacionada con el espesor de la película delgada o capa de glicocálix mediante la ecuación que se muestra aquí. La fuerza medida por el A FM medido en nano Newtons comienza a aumentar después del contacto con la superficie e inicialmente está dominada por el componente de la capa de glicocálix.

Una vez que la capa de glicocálix se comprime, el cuerpo celular se convierte en el componente principal de la deformación. La línea de ajuste azul de dos capas se calculó ajustando cuatro parámetros libres para que coincidiera con los datos de indentación que se muestran en rojo de la ecuación utilizada Se pueden determinar el módulo de la celda, el glicocáliz, el módulo de capa y el grosor de la capa de glicocálix. Las propiedades de 25 celdas se compilaron en el histograma que se muestra aquí.

Se determinó que el módulo promedio de la capa de glicocálix era de 0,7 más o menos 0,5 kipa cals, y el espesor de la capa de glicocálix era de 380 más o menos 50 nanómetros. Este enfoque nos da la herramienta que necesitábamos para responder preguntas fundamentales sobre el papel del glicocálix en la regulación de la adhesión celular durante la inflamación. Ahora podemos abordar preguntas sobre cómo se alteran las propiedades del glicocálix durante la inflamación.

Por qué medios se logran esos cambios. Este enfoque puede ampliarse de varias maneras. Por ejemplo, se podría usar para probar descripciones teóricas novedosas y más sofisticadas de las propiedades del glicocálix.

O en un nivel más práctico, se podría utilizar esto para probar recubrimientos de superficie bioinspirados, diseñados para proteger los dispositivos implantables de la respuesta inmunitaria en el huésped. Muchas gracias por su interés en nuestro trabajo.