Name: El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprende a utilizar quimiostatos para cultivos celulares continuos con control preciso del crecimiento microbiano. Este método permite investigar la regulación del crecimiento y la evolución adaptativa en biología de sistemas.

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Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos forman la Universidad de Nueva York. Agradecemos a Maitreya Dunham y Matt Brauer que inicialmente desarrolló el uso de biorreactores Sixfors como quimiostatos.

El principio de cultivo continuo utilizando un quimiostato se puede realizar en una variedad de implementaciones. En todos quimiostatos que es esencial contar con 1) los métodos para mantener la esterilidad de todos los componentes, 2) una cultura bien mezclado, 3) la aireación adecuada del recipiente de cultivo y 4) un medio fiable de adición de los medios y la cultura de eliminación. Aquí, se describe el uso de un biorreactor Sixfors (Infors Inc) como un quimiostato usando métodos que se pueden adaptar fácilmente a configuraciones alternativas. 1. Montaje de los buques Chemostat <ol><li> Encienda los Sixfors utilizando el interruptor principal. </li><li> Enjuague bien el recipiente quimiostato, montaje agitador y tubo conectado con agua desionizada (DI). Compruebe todos los tubos y las juntas tóricas y reemplace cualquier pieza desgastada buscando. </li><li> Asegúrese de que la base de soporte del eje de accionamiento está mirando hacia arriba en el recipiente de vidrio y que la parte superior del eje de accionamiento se encaja a presión en su alojamiento en el montaje de agitador. Ajuste el stirreconjunto de r en el recipiente de vidrio asegurar la parte inferior del árbol de accionamiento se asienta en el soporte del eje de accionamiento. Utilice la abrazadera para asegurar el conjunto agitador al recipiente de cristal. </li><li> Llenar el depósito con alrededor de 300 ml de agua DI. </li><li> Retire las tapas de un oxígeno disuelto (OD 2) sonda y controlar el nivel del electrolito desenroscando la carcasa inferior y asegurándose de que la carcasa inferior se llena hasta la mitad con la solución electrolítica. Atornillar la carcasa inferior y se insertan en el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo. </li><li> Tome una sonda de pH y de sacarlo de su tampón de almacenamiento (3 M KCl). Retire la tapa de la sonda de pH y adjuntar a fermentador 1. El uso de la pantalla de control Sixfors, navegue hasta el menú de parámetros fermentador y seleccione &quot;Calibrar pH&quot;. Coloque la sonda de pH en un tampón estándar de pH 7 y registrar la lectura como Sumo Read. Repita con el tampón de pH 4 y registrar la lectura tan bajo Leer. Desconecte la sonda de pH del fermentador, lavar con agua DI e inserte la sonda into el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo. </li><li> Colocar el recipiente quimiostato en el bastidor. Nota sobre el buque que fermentador (1-6) la sonda de pH fue conectado y calibrado. Coloque la tapa de la sonda de pH en la sonda de pH. El uso de papel de aluminio herméticamente cubre la parte superior del sensor de oxígeno 2. </li><li> Doble lámina sobre los extremos de la tubería conectada al recipiente de quimiostato. </li><li> Repita los pasos 1.2 a 1.8 para todos los buques. </li><li> Esterilizar los recipientes en autoclave durante 15 min en un ciclo de líquido. </li></ol> 2. Preparación de los Medios de Comunicación <ol><li> Establecer el rango límite de las concentraciones de nutrientes por el crecimiento de cultivos de lotes en diferentes concentraciones de nutrientes. El nutriente es limitante en el rango donde la densidad celular final es una función lineal de la concentración inicial de nutrientes (Figura 4). Seleccionar una concentración de nutrientes dentro del rango limitante. Ejemplos de composición de medios estándar para los estudios con Saccharomycess cerevisiae están disponibles en 7-11. </li><li> Autoclave una bombona vacía que se tapó con un tapón de goma que contiene una entrada de aire y la salida de los medios de comunicación después de asegurarse primero de que el extremo del tubo de los medios de comunicación está cubierta en papel de aluminio. </li><li> En un recipiente separado preparar 10 l de medio. </li><li> Coloque una taza de filtro 500 ml de una botella 100 ml de medio. Quite el filtro de algodón con pinzas esterilizadas en etanol y adjuntar inmediatamente al puerto de filtración en la bombona de medios. </li><li> Coloque la bombona medios a una fuente de vacío y filtro de esterilización de los medios de comunicación mediante la adición a la copa del filtro. </li><li> Cuando la filtración de los medios de comunicación se ha completado, cierre la terminal portuaria de filtración con una abrazadera de metal. </li></ol> 3. Calibración de haces 2 Sondas y configuración quimiostato <ol><li> Después de los vasos chemostat se han sometido a autoclave y se dejó enfriar lugar el buque en su chaqueta de calor correspondiente. Conecte la sonda de temperatura, sonda de pH y DO 2 de la sonda. Deje que elbuque se sientan con el poder durante al menos 6 horas para permitir que la DO 2 sondas para polarizar. </li><li> Coloque el extremo de cada tubo de efluente en un recipiente de recolección separada. Conecte el suministro de aire a través de un filtro esterilizado en autoclave y encienda el flujo de aire. El agua en cada recipiente debe fluir fuera de los tubos de efluentes, lo que indica que todas las juntas se forman correctamente. </li><li> Ajuste la altura del tubo de efluente de acuerdo con el volumen de trabajo deseada (por ejemplo 300 ml). Nosotros usamos una regla que está marcado con la colocación de tubos calibrados para diferentes volúmenes de trabajo. </li><li> Conecte la bombona media de la embarcación quimiostato. Utilice el etanol con el fin de mantener el tubo termina tan estéril como sea posible. Pase el tubo de la bomba a través de la bomba y la pinza abierta. Presione manualmente la bomba hasta que los medios de comunicación comienza a fluir dentro del recipiente de quimiostato. Soltar la tubería de la bomba, los medios de comunicación deben fluir libremente en el recipiente quimiostato. Cuando los medios de comunicación llega al tubo de efluente, vuelva a conectar la tubería a la bomba y la abrazadera. </li><li> Comience running el programa básico con el conjunto impulsor de 400 rpm y la temperatura ajustada a 30 ° C. </li><li> Para calibrar hacer 2 sondas, corte el suministro de aire y cambiar a gas nitrógeno. Espere al menos una hora y registro de valor medida como &quot;bajo de lectura&quot;. Cambie de nuevo al suministro de aire (es decir, que contiene la concentración de oxígeno del ambiente), espere por lo menos una hora adicional y medición expediente como &quot;de lectura es alto&quot;. </li><li> Iniciar el registro de datos utilizando el software Iris. </li></ol> 4. Inoculación <ol><li> Utilice etanol al 70% para esterilizar la parte superior del recipiente de cultivo. </li><li> Retire el tornillo en la parte superior del vaso y de la pipeta 1 ml de un cultivo de una noche en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo. </li><li> Indique el momento de la inoculación en Iris. </li><li> Espere aproximadamente 24 horas para que las culturas alcanzan la fase estacionaria temprana. A medida que la cultura crece, el oxígeno disuelto y pH disminuirá. En el caso de los medios de comunicación limitantes de glucosa, oxígeno disuelto volverá a ~ 100% en PHA estacionariaSE. Para otras limitaciones de nutrientes de oxígeno disuelto se mantendrá &lt;100% en la fase estacionaria. </li></ol> 5. Iniciando Bombas y alcance del estado continuo <ol><li> La velocidad de dilución se calcula dividiendo la velocidad de flujo (la cantidad de medios de comunicación fluye en el recipiente por hora) por el volumen de cultivo. Por ejemplo, con un volumen de 300 ml de una tasa de dilución de 0,1 significa que se añaden 30 ml de medio de cultivo cada hora. Debido a que el sistema está bajo presión positiva el mismo volumen se retira del recipiente asegurando que el cultivo se diluye continuamente. Una gama de tasas de dilución (D) se puede utilizar que no excedan la tasa máxima de crecimiento (μ max) de las células, por encima del cual las células se lavan fuera de la quimiostato. </li><li> Elija la configuración de la bomba, que especifican el número de segundos que la bomba esté encendido y apagado, para establecer el caudal deseado. La bomba suministra los medios de comunicación a una velocidad de ~ 0,11 ml / seg. </li><li> Definir un programa utilizando la int Sixforserface que especifica la sincronización de la bomba, la temperatura y la velocidad del impulsor. Inicie el programa. </li><li> Vacíe los recipientes de recolección de líquidos y registrar el tiempo. </li><li> Después de por lo menos dos horas, utilice un cilindro graduado para medir la cantidad de medios de comunicación ha sido retirado de la embarcación. Esta será igual el volumen que ha sido añadido al recipiente de quimiostato. Calcular la tasa de dilución (D = V efluentes / V cultura / tiempo). Ajuste la configuración de la bomba si la tasa de dilución calculada no coincide con la tasa de dilución deseado. </li><li> En el estado estacionario, la densidad celular en el quimiostato no cambia con el tiempo. Esto se puede medir sin perturbar la cultura mediante el muestreo de la salida. Nos operacionalmente definimos consecución de estado estacionario como mediciones de la densidad de células idénticas que están separadas por al menos una duplicación de la población. Alcanzar el estado de equilibrio tendrá una duración aproximada de ocho generaciones de cultivo después de la iniciación de la dilución de la cultura. En el estado estacionario, las células crecen de manera exponencial (es decire. tasa de crecimiento constante en el tiempo) en condiciones de nutrientes limitados. El tiempo de duplicación de la población (tiempo de generación) es ln (2) / D. </li><li> Continuar para medir periódicamente los volúmenes de efluentes durante la duración del experimento para asegurar que se mantiene una tasa de dilución constante. </li></ol> 6. Aplicación 1: El estudio de las células que crecen a ritmos diferentes en condiciones de estado estacionario <ol><li> En el estado estacionario en el quimiostato, la tasa de crecimiento de la población de células es igual a la tasa de dilución. Al alterar sistemáticamente la tasa de dilución que es posible cultivar células a diferentes velocidades. Esto permite que el estudio sistemático de los parámetros fisiológicos que varían con la tasa de crecimiento como el volumen celular, la fase del ciclo celular y la resistencia al estrés. Además, los perfiles en estado estacionario de ARNm global, la proteína y los niveles de metabolitos se pueden ensayar en células que crecen a tasas diferentes. Hay dos maneras de adquirir muestras: </li><li> Muestras pequeñas pueden ser pasivamente obcontenida colocando el extremo del tubo de efluente en un tubo de 1,5 ml o 15 ml. Una muestra de 1-5 ml se puede conseguir en unos pocos minutos (dependiendo de la tasa de flujo). Muchos de los parámetros fisiológicos pueden ser medidos de estas muestras. </li><li> La expresión de genes, o metabolitos análisis requieren muestras más grandes que se deben obtener lo más rápidamente posible. Coloque el extremo del tubo de efluente en un tubo cónico de 15 ml. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo. A ~ 10 ml de muestra será rápidamente llenar el tubo. Tenga en cuenta que el volumen en el recipiente quimiostato ha cambiado. Si se toman muchas muestras consecutivas puede ser necesario para reducir el flujo para mantener una tasa de dilución constante. </li></ol> 7. Aplicación 2: Medición precisa de diferencias en desarrollo las tasas entre los genotipos en ambientes controlados utilizando los ensayos de la competencia basada en Citometría de Flujo <ol><li> Quimiostatos se pueden utilizar para cuantificar con precisión el efecto de la concentración de nutrientessobre las diferencias en las tasas de crecimiento (es decir, la aptitud) entre los distintos fondos genéticos. Por cepas co-cultivo de la etiqueta con diferentes proteínas fluorescentes se determina la tasa de cambio en la abundancia relativa durante el crecimiento exponencial. La ejecución de este ensayo a diferentes tasas de dilución (D) permite el estudio de los efectos de la concentración de nutrientes (s) sobre las diferencias de condición física. </li><li> Establecer cultivos de estado estacionario de las dos cepas en los vasos chemostat separadas con tasas de dilución idénticas y un volumen de 300 ml. </li><li> Pasivamente muestra de 1 ml de cada buque. Decantar células, volver a suspender en tampón fosfato salino (PBS) y se pone a 4 ° C. Estas muestras contienen muestras de células homogéneas, que son controles para el análisis de citometría de flujo subsiguiente. </li><li> Colocar el tubo de efluente de un recipiente en un cilindro graduado en autoclave. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo para expulsar a las células del quimiostato. ¿Cuándoel volumen llega a 150 ml, de regreso el extremo metálico del tubo de efluente a su posición original (300 ml). Repita con el segundo recipiente, usando un cilindro graduado diferente. </li><li> Utilice etanol al 70% para mantener la esterilidad mientras se quita el tornillo en la parte superior del recipiente quimiostato. Coloque el embudo en la abertura y verter 150 ml de la otra cultura en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo. Repita con el segundo recipiente, usando el segundo embudo. Cada buque quimiostato ahora contiene una mezcla de las dos cepas. </li><li> Obtener una muestra de 1 ml de cada buque que utilice muestreo pasivo cada 2-6 horas. Centrifugar las células, resuspender en PBS y se almacena a 4 ° C. Siga tomando muestras para el registro de 2-3 días cuidadosamente el tiempo de cada muestra fue tomada. </li><li> Al final del experimento, se somete a ultrasonidos y diluir las muestras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Usando citometría de flujo, medir la proporción de las dos cepas en cada muestra. Como ambas cepas están creciendo de manera exponencial, la diferencia de la tasa de crecimiento relativo esdeterminado por regresión lineal de ln (strain1/strain2) frente al tiempo (medido en generaciones). La pendiente de la regresión es la diferencia proporcional en la tasa de crecimiento (es decir, la ventaja de la aptitud) de una cepa con respecto al otro. </li><li> A medida que el cultivo mixto puede tomar algún tiempo para alcanzar un nuevo estado de equilibrio, los momentos oportunos pueden adaptarse mal a la regresión. Este problema se resuelve mejor permitiendo 2-3 generaciones que transcurran antes de comenzar el muestreo o eliminar puntos tempranos que son los valores extremos claros. Por el contrario, una vez que una cepa ha outcompeted la otra los datos ya no son útiles y estos puntos deben ser excluidos. </li></ol> 8. Aplicación 3: Evolución Experimental <ol><li> Evolución Experimental realizado en quimiostatos selecciona para los mutantes que se incrementan en la aptitud en el entorno limitado de nutrientes. La selección se realiza generalmente a través de cientos de generaciones. </li><li> Establecer una cultura quimiostato en estado estacionario utilizando una cepagenotipo conocido (y secuencia del genoma de preferencia se conocen) y un nutriente limitación definida. </li><li> Para mantener un &quot;registro fósil&quot; de la población que se adapta pasivamente muestrear quimiostato cada 2-3 días y almacenar la muestra en 15% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Supervisar el depósito de medio y reponer con medio fresco como sea necesario. </li><li> Mantener la cultura de crecimiento exponencial para varios cientos de generaciones. </li><li> Después de la terminación de la placa de selección de una muestra de células en placas de agar sólido. Después las células se han convertido en colonias, recoger una muestra no sesgada de las colonias utilizando palillos de dientes e inocular clones en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos que contiene 100 l de los medios de comunicación. Permita que las muestras clonales crezcan durante la noche, añadir 100 ml de glicerol al 30% y guárdelo en -80 ° C. </li><li> Caracterizar los clones mediante secuenciación de todo el genoma y la realización de ensayos fenotípicos, incluyendo la evaluación de la aptitud, utilizando una cepa de referencia marcado con fluorescencia común, tal como se describe en la Solicitud de 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Quimiostatos permiten el cultivo de microbios en condiciones de estado estacionario de crecimiento controlado. Las células crecen continuamente a una velocidad constante que resulta en un ambiente externo invariante. Esto es en contraste con los métodos de cultivo por lotes en el que el entorno externo está cambiando continuamente y la tasa de crecimiento de las células se determina por la interacción compleja de medio ambiente y genotipo. Por lo tanto, una ventaja importante de cultivo de microbios en quimiostatos más ...

El crecimiento de las células está regulada por complejas redes de interacción de factores genéticos y ambientales 1,2. La regulación multifactorial del crecimiento celular requiere un enfoque a nivel de sistema para su estudio. Sin embargo, el estudio riguroso de crecimiento celular regulada se ve desafiada por la dificultad de controlar experimentalmente la velocidad a la que crecen las células. Por otra parte, incluso en los experimentos simples condiciones extracelulares son con frecuencia dinámico y complejo como células alteran continuamente su entorno ya que proliferan. Una solución a estos problemas es proporcionada por el quimiostato: un método de cultivo de células que permite el control experimental de las tasas de crecimiento de células en entornos definidos, invariantes y controlados. El método de cultivo continuo utilizando un quimiostato fue descrita independientemente por Monod 3 y Novick y Szilard 4 en 1950. Tal como se concibió originalmente, las células se cultivan en un volumen fijo de los medios de comunicación que es CONcontinuamente se diluye mediante la adición de los nuevos medios y la eliminación simultánea de los viejos medios de comunicación y las células (Figura 1). Acoplados ecuaciones diferenciales ordinarias (Figura 2) describen la tasa de cambio en la densidad de células (x) y la concentración de un nutriente (s) que limita el crecimiento en el recipiente de quimiostato. Es importante destacar que este sistema de ecuaciones predice un único (distinto de cero) estable en estado estacionario (Figura 3) con la notable implicación de que en el estado estacionario, la tasa de crecimiento específico de las células (es decir, la constante de velocidad de crecimiento exponencial) es igual a la tasa en el que el cultivo se diluye (D). Mediante la variación de la tasa de dilución es posible establecer poblaciones en estado estacionario de las células a diferentes tasas de crecimiento y en diferentes condiciones de limitación de nutrientes. El control experimental de la tasa de crecimiento utilizando quimiostatos fue fundamental para el desarrollo de una comprensión de cómo los cambios de la fisiología celularcon tasas de crecimiento de 5,6. Sin embargo, este antiguo pilar de métodos microbiológicos hizo cada vez más oscura durante la explosión en la investigación de la biología molecular a finales del siglo XX. Hoy en día, el renovado interés en el control de crecimiento en ambos microbios y organismos multicelulares y el advenimiento de los métodos a escala del genoma de análisis a nivel de sistemas, ha renovado la motivación para el uso de quimiostatos. A continuación, describimos tres aplicaciones que aprovechan el control preciso de las tasas de crecimiento de células y el medio externo que son únicamente posibles con quimiostatos. En primer lugar, se describe el uso de quimiostatos para investigar cómo la abundancia de miles de biomoléculas - tales como transcripciones y metabolitos - están regulados coordinadamente con la tasa de crecimiento. En segundo lugar, se describe la forma quimiostatos pueden utilizarse para obtener estimaciones precisas de las diferencias de tasas de crecimiento entre los diferentes genotipos en ambientes con nutrientes limitados utilizando experimentos de competición. En tercer lugar, se describe cómo se puede quimiostatosser utilizado para estudiar la evolución adaptativa de las células que crecen en entornos pobres en nutrientes constantes. Estos ejemplos ilustran la forma en que quimiostatos están permitiendo a las investigaciones a nivel de los sistemas de regulación del crecimiento celular, génica mediante interacciones ambientales y la evolución adaptativa.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Recursos Técnicos Apropiados, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Botella de vidrio 9.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>para recipiente de medios y</td></tr><tr><td>tapón de manguera, tamaño 12, neopreno verde</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr> conector <tr><td>recto</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>general Propósito Lazos 4 en</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>Para recipiente de medios y tubos de manguera</td></tr><tr><td>, piezas pequeñas de caucho de silicona</td><td></td><td></td><td>B000FMWTDE para recipientes de medios y tubos de manguera</td></tr>, <tr><td>silicona, 3/8 pulgadas de diámetro</td><td>exterior Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>para recipientes de medios y</td></tr><tr><td>mangueras Tubería, silicona, 7/32 pulgadas de diámetro exterior</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>para recipientes de medios y mangueras</td></tr><tr><td>Tubería, acero inoxidable, 3/16 pulgadas de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>Tubos, acero inoxidable, 3/8 pulgadas de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>para recipiente de medios y</td></tr><tr><td>conectores de gancho de</td> manguera <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>para recipiente de medios y</td></tr><tr><td>manguera abrazadera de trinquete</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>Luer,</td><td>Cole-Palmer</td> hembra <td>EW-45512-34</td><td>para recipiente de medios y luer de manguera</td></tr><tr><td>, Cole-Palmer macho</td><td></td><td>EW-45513-04</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>Millipore Aervent MTGR05010 filtro de 62 mm, 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>para recipientes de medios y mangueras</td></tr><tr><td>de PTFE Acrodisc CR 13 mm filtros, 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>para recipiente de medios y manguera</td></tr><tr><td>Tubo de flujo de lectura directa para aire</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>para configuración de gas nitrógeno</td></tr><tr><td>Tubo de flujo de lectura directa para nitrógeno</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>para configuración de gas</td></tr><tr><td>nitrógeno Dosificador de gas Marcos multitubo</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>para configuración</td></tr> <tr><td>de gas nitrógenoregulador, analítica de dos etapas Airgas</td><td></td><td>Y12-N145D580</td><td>para configuración de gas nitrógeno</td></tr><tr><td>Adaptador de manguera, acero inoxidable Airgas</td><td></td><td>Y99-26450</td><td>para gas</td></tr> nitrógeno <tr><td>Adaptador macho de manguera</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>para configuración de gas nitrógeno</td></tr><tr><td>Tubería Norprene</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>para configuración de gas nitrógeno</td></tr><tr><td>Base de trípode</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Para Gas Nitrógeno</td></tr><tr><td>Montaje Cartuchos de Válvula</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Para Montaje de Gas Nitrógeno Garra</td></tr><tr><td>10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Para Preparación</td>de</tr><tr><td>Medios Steritop Filtros estériles de tapa de botella de vacío, 1.000 ml, membrana de PES; para tamaño de cuello de 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Para</td></tr><tr><td>Preparación de Medios Botella de Medios 100 ml, tamaño</td> <td>de cuello de 45 mmFisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>para la preparación de medios</td></tr><tr><td>cloruro de calcio y middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Media Reactivos</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Media Reactivos</td></tr><tr><td>sulfato de magnesio&middot; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>230391 Reactivos</td></tr><tr><td>de medios fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Media Reactivos</td></tr><tr><td>sulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Media Reactivos</td></tr><tr><td>de</td> potasio <td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Reactivos de medios</td></tr> ácido <tr><td>bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>sulfato de cobre y middot; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>de medios yoduro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>de medios cloruro férrico&middot; 6H2O</td><td>Reactivos de medios</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td></tr><tr><td>sulfato de manganeso&middot; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>reactivos de</td></tr><tr><td>medios molibdato de sodio&middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>de medios sulfato de zinc&middot; 7H2O</td><td>Reactivos</td> de <td>medios</td><td>Fisher Scientific Z68-500</td></tr><tr><td>biotina</td><td>Reactivos</td> de medios <td>Fisher Scientific BP232-1</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>de medios pantotenato de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Reactivos de medios</td></tr> ácido <tr><td>fólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>inositol (también conocido como mioinositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>niacina (también conocido como ácido nicotínico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Reactivos de medios</td></tr> ácido <tr><td>p-aminobenzoico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>piridoxina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>riboflavina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>tiamina HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>Reactivos de medios</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Reactivos de medios</td></tr></tbody></table>

el uso de quimiostatos en microbiana biología de sistemas

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Las células regulan su tasa de crecimiento en respuesta a señales desde el mundo exterior. A medida que la célula crece, diversos procesos celulares deben estar coordinados incluyendo la síntesis macromolecular, metabolismo y en última instancia, el compromiso con el ciclo de división celular. El quimiostato, un método de controlar experimentalmente tasa de crecimiento celular, proporciona un medio poderoso para estudiar sistemáticamente cómo afecta la tasa de crecimiento de los procesos celulares - incluyendo la expresión génica y el metabolismo - y las redes reguladoras que controlan la tasa de crecimiento de las células. Cuando mantenido por cientos de generaciones quimiostatos se puede utilizar para estudiar la evolución de adaptación de microbios en las condiciones ambientales que limitan el crecimiento celular. Se describe el principio de las culturas chemostat, demostrar su funcionamiento y ofrecer ejemplos de sus diversas aplicaciones. Tras un período de inactividad después de su introducción en el medio del siglo XX, la convergencia de las metodologías a escala del genoma con un renovado enterés en la regulación del crecimiento celular y la base molecular de la evolución adaptativa es estimular un renacimiento en el uso de quimiostatos en la investigación biológica.

Una ventaja importante de quimiostatos es la capacidad de controlar la tasa de crecimiento de las células experimentalmente mediante la variación de la tasa de dilución. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la morfología de una célula es informativo de su fase en el ciclo de división celular. Las poblaciones con tasas de crecimiento más altas contienen una mayor proporción de división activa las células según se determina mediante la medición de la fracción de células unbudded (Figura 5A).</stron...

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Los objetivos generales de la siguiente presentación son describir el principio del quimiostato, demostrar su funcionamiento y proporcionar ejemplos de aplicaciones que utilizan quimiostatos. Esto se logra primero ensamblando el recipiente del quimiostato, inoculándolo y luego agregando continuamente medio fresco mientras se elimina medio y células viejos a una velocidad constante. Un modelo matemático describe el cambio en la densidad celular y el cambio en la concentración de un nutriente limitante del crecimiento dentro de cada quimiostato.El uso de estas ecuaciones permite predecir un único estado estacionario estable distinto de cero en el que las concentraciones de células y nutrientes son constantes, y la velocidad específica de crecimiento de las células es igual a la velocidad a la que se eliminan las células. Al combinar el control preciso del crecimiento celular y del entorno dentro de los quimiostatos con otras tecnologías, es posible obtener resultados que permiten investigaciones a nivel de sistemas sobre la regulación del crecimiento celular, cambios genéticos y evolución adaptativa. La principal ventaja de este método de cultivo celular frente a otras técnicas es que la velocidad de crecimiento está controlada y el entorno externo de las células permanece constante.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y la evolución, como cuál es la base molecular de la regulación del crecimiento celular y de la evolución adaptativa en entornos definidos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que configurar y mantener cultivos en quimiostato es difícil debido al gran número de pasos y componentes involucrados. Comience este procedimiento encendiendo primero el sistema seis cuatro mediante el interruptor principal.A continuación, enjuague cuidadosamente el recipiente del hemostato, el conjunto de agitación y los tubos conectados con agua desionizada. Revise todos los tubos y las juntas tóricas y reemplace las piezas desgastadas. Una vez que se haya ensamblado el conjunto de agitación y el eje de transmisión, llene el recipiente con 300 mililitros de agua DI.Verifique el nivel de electrolito del sensor de oxígeno disuelto, asegurándose de que la carcasa inferior esté llena hasta la mitad con solución de electrolito. A continuación, calibre el sensor de pH. Una vez calibrado, desacople el sensor del biorreactor.Lave con agua desionizada e insértelo en el puerto del vaso del hemostato. Ajuste con los dedos hasta que quede firme. Con las sondas conectadas, coloque el vaso del hemostato en el soporte, asegurándose de anotar en el vaso con qué fermentador se calibró la sonda de pH. Finalmente, prepare las sondas y los tubos para la autoclave colocando la tapa en la sonda de pH y cubriendo la sonda de oxígeno disuelto y todos los extremos libres de los tubos con papel de aluminio apto para autoclave.Un coche vacío que está tapado con un tapón de goma que contiene una entrada de aire y una salida de medio. Asegúrese de que el extremo del tubo de medio esté cubierto con papel de aluminio. Sujete un vaso de filtro de 500 mililitros a una botella de medio de 100 mililitros.Retire el filtro de algodón del filtro con pinzas, esterilizado y con etanol, y conéctelo inmediatamente al puerto de filtración del carro de medio. Conecte el carro de medio a una fuente de vacío y filtre. Esterilice 10 litros de medio recién preparado añadiéndolo al vaso del filtro.Cuando la filtración del medio esté completa, cierre el puerto de filtración con una abrazadera metálica. Después de que los vasos del hemostato hayan sido autoclavados y se hayan dejado enfriar, coloque el vaso en su chaqueta térmica correspondiente. Conecte el sensor de temperatura, el sensor de pH y el sensor de oxígeno disuelto.Deje el recipiente con la energía encendida durante al menos seis horas para permitir que las sondas de oxígeno disuelto se polaricen completamente. Luego conecte el medio carbo al recipiente hemostático. Utilice etanol para mantener los extremos de los tubos lo más estériles posible.Luego pase el tubo de la bomba a través de la bomba y abra la pinza. A continuación, coloque el extremo de cada tubo de efluente en un recipiente colector separado. Conecte el suministro de aire a través de un filtro para autoclave y encienda el flujo de aire.El agua de cada músculo debe salir por los tubos de efluente, lo que indica que todos los sellos se han formado correctamente. Ajuste la altura del tubo de efluente al volumen de trabajo deseado de 300 mililitros. Presione manualmente la bomba hasta que el medio comience a fluir hacia el recipiente del hemostato.Luego, suelte el tubo de la bomba. Cuando el medio alcance el tubo de efluente, vuelva a conectar el tubo a la bomba y sujételo con el medio cebado. Comience a ejecutar el programa básico con el impulsor ajustado a 400 rpm y la temperatura establecida a 30 grados Celsius.A continuación, calibre las sondas de oxígeno disuelto apagando el suministro de aire y cambiando al gas nitrógeno. Espere al menos una hora y registre el valor medido como lectura baja. Cambie nuevamente al suministro de aire que contiene una concentración ambiental de oxígeno y espere al menos una hora adicional.Registre esta medición como el valor alto de lectura. En este momento, inicie el registro de datos utilizando el software iris antes de la inoculación. Esterilice la parte superior del recipiente de cultivo con etanol al 70 %.Luego, abra el puerto del recipiente con un destornillador y pipetee un mililitro de un cultivo de crecimiento nocturno dentro del recipiente, volviendo a colocar el tornillo una vez finalizado. Cuando los cultivos alcancen su fase estacionaria temprana, active las bombas y establezca un caudal deseado. Especificando el número de segundos que la bomba permanece encendida y apagada, el caudal y el volumen del cultivo.Determine la velocidad de dilución. Mediante la interfaz de los seis cuatros, defina un programa que especifique el tiempo de la bomba, la temperatura y la velocidad del impulsor. Luego inicie el programa después de al menos dos horas.Registre el tiempo y utilice un cilindro graduado para medir cuánto medio ha sido retirado del recipiente. La cantidad retirada será igual al volumen que se ha agregado al recipiente con hemostato y puede utilizarse para calcular la tasa de dilución, extraer el flujo de salida y emplearlo para medir la densidad celular. Se alcanza el crecimiento en estado estacionario cuando la densidad celular no cambia con el tiempo.Una vez alcanzado el estado estacionario, obtenga muestras pequeñas tomando muestras del tubo de efluente durante unos minutos, dejando que fluya pasivamente hacia un tubo de recolección. El análisis de expresión génica y de metabolitos requiere muestras más grandes. Estas pueden obtenerse rápidamente soltando el tornillo, sosteniendo el extremo metálico del tubo de efluente y bajando lentamente el tubo.Cuando se elimina un volumen grande, la velocidad de flujo debe reducirse para mantener la misma tasa de dilución. Primero, establezca cultivos en estado estacionario de dos cepas de levadura con tasas de dilución idénticas y volúmenes muestreados pasivamente. Tome una muestra de un mililitro de cada recipiente para utilizarla como control en el análisis posterior por citometría de flujo. Centrifugue las células durante un minuto a 6.000 RPM, resuspenda en un mililitro de PBS y almacene el tubo a cuatro grados Celsius.A continuación, coloque el tubo de efluente de un recipiente a la vez en un cilindro graduado para autoclave. Suelte el tornillo que sostiene el tubo de efluente y presione suavemente hacia abajo para expulsar 150 mililitros de células del quimiostato, volviendo a colocar el extremo metálico del tubo de efluente en su posición original. Una vez finalizado, después de esterilizar el área, abra el puerto del recipiente en la parte superior del recipiente del quimiostato.Coloque un embudo estéril en la abertura y añada 150 mililitros de la otra cultura. Luego cierre el puerto y repita con el segundo recipiente. Cada recipiente ahora contiene una mezcla 50-50 de las dos cepas; posiblemente tome muestras cada dos a seis horas durante dos a tres días.Almacene las muestras en PBS y analice las proporciones de cepas en cada muestra mediante citometría de flujo. Después de establecer un cultivo de quimiostato en estado estacionario utilizando una cepa de genotipo conocido con una limitación nutricional definida, mantenga el cultivo sin perturbar durante varias cientos de generaciones, reponiendo el reservorio de medio con medio fresco según sea necesario. Mantenga un registro fósil de la población en adaptación mediante muestreo pasivo del efluente cada dos o tres días.Almacene la muestra en glicerol al 15 % a menos 80 grados Celsius. Después de completar la selección, siembre una muestra de células en placas de agar sólido. Una vez que las células hayan crecido formando colonias, seleccione una muestra imparcial de colonias utilizando palillos y siembre clones en pozos individuales de una placa de 96 pozos que contenga 100 microlitros de medio. Deje crecer las muestras clonales durante la noche.Luego, agregue 100 microlitros de glicerol al 30 % en cada pocillo y almacene a menos 80 grados Celsius hasta su uso en análisis genómicos. Una ventaja importante de las chemostats es la capacidad de controlar la tasa de crecimiento celular. El porcentaje de células de levadura, que están brotando, mostrado aquí en el eje Y, es una buena representación de su tasa de crecimiento.Como se observa aquí. Este porcentaje aumenta de manera casi lineal con la elevación de la tasa de dilución. Tasas de dilución más rápidas producen tasas de crecimiento más rápidas, lo que puede provocar aumentos sistemáticos en la expresión génica, representados aquí por un incremento en la abundancia de ARNm del UTR dos.Sin embargo, las disminuciones sistemáticas en la expresión génica también pueden ocurrir con un aumento en la velocidad de crecimiento, como en el caso del ASM uno. La aptitud relativa de diferentes genotipos puede determinarse mediante ensayos de competencia en quimiostatos utilizando células marcadas con fluorescencia y análisis de citometría de flujo; aquí se muestra un resultado representativo en el que un mutante compitió contra una cepa silvestre marcada con fluorescencia. En este ejemplo, la cepa mutante tiene una ventaja del 40 % en la velocidad de crecimiento por generación.El análisis de la secuencia del genoma completo puede utilizarse para identificar mutaciones adquiridas en células con mayor aptitud, tras una selección a largo plazo en quimioestatos. Por ejemplo, el análisis de experimentos independientes de evolución adaptativa en condiciones de limitación de nitrógeno identificó diferentes alelos de variante en el número de copias en el locus gap, que codifica la permeasa general de aminoácidos. Tras este procedimiento, otros métodos como la espectrometría de masas, la citometría de flujo y la secuenciación de nueva generación pueden utilizarse para responder preguntas similares sobre la regulación a nivel de sistemas del crecimiento celular y la evolución adaptativa.Después de que el desarrollo de esta técnica allanara el camino para que los investigadores en campos que van desde la microbiología hasta la biología celular estudien cómo la fisiología celular y los procesos moleculares se ven afectados por la variación en la tasa de crecimiento celular. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo establecer y mantener cultivos quimiostatos, así como de las diferentes formas en que se requieren muestras para distintas aplicaciones.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Describimos un morbidostat configurable de bajo coste que permite la caracterización de la resistencia a los antibióticos mediante el ajuste dinámico de la concentración del fármaco. El dispositivo puede integrarse con una plataforma microfluídica multiplexada. El enfoque puede ampliarse para estudios de resistencia a antibióticos en laboratorio.

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Aquí se describe un protocolo para la extracción de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus y su posterior análisis por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas.

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Se presenta un protocolo detallado para la operación concurrente de culturas de célula paralelo 48 bajo variadas condiciones en un sistema de microbioreactor. Proceso de cultivo celular, la cosecha y el análisis del título de anticuerpos posterior se describen.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

El marco eVOLVER permite un cultivo microbiano continuo de alto rendimiento con alta resolución y control dinámico sobre parámetros experimentales. Este protocolo demuestra cómo aplicar el sistema para llevar a cabo un experimento de fitness complejo, guiar a los usuarios en la programación de control automatizado sobre muchas culturas individuales, midiendo, recopilando e interactuando con datos experimentales en tiempo real.

Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.

Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.

Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Presentamos un protocolo para el dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD), que permite el cultivo de poblaciones bacterianas bajo condiciones constantes de bajas concentraciones de nutrientes (hasta cientos de concentraciones nanomolares) o fluctuaciones temporales de nutrientes en una escala temporal de tiempo.

Un dispositivo milifluido de cultivo continuo para el estudio de Escherichia coli bajo condiciones de nutrientes bajos y fluctuantes

Aprende a utilizar quimiostatos para cultivos celulares continuos con control preciso del crecimiento microbiano. Este método permite investigar la regulación del crecimiento y la evolución adaptativa en biología de sistemas.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

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