Name: Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a generar líneas celulares humanas estables con expresión inducible de cDNA o shRNA mediante el sistema Tet-on. Este método permite el control reversible de la expresión génica para estudiar funciones celulares.

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Damos las gracias a todos los miembros de nuestro laboratorio útil para los debates. Damos las gracias a Joanna Lisztwan y Gewinner Christina para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el BBSRC BB/I021248/1 subvención y el Wellcome Trust subvención 090090/Z/09/ZAH es un Wellcome Research Trust Carrera compañero de Desarrollo en el Instituto UCL Cancer.

1. Clonación de pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Como se ilustra en la Figura 3, realizar una digestión parcial del plásmido pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) con las enzimas de restricción Xba I y Nco I para eliminar el gen TetR y el promotor de la resistencia a blasticidina (BlastR) de genes. Aislar el fragmento de 4,6 kb del vector. </li><li> Para eliminar la secuencia de poliadenilación del gen TetR, introducir por PCR un sitio Xho I inmediatamente después del codón de parada de la TetR cDNA mientras se conserva el sitio Xba I en el extremo 5 &#39;del ADNc. Subclonar el fragmento resultante en pMigR1 17 usando las enzimas de restricción Xba I y Xho I para generar el plásmido pMigR1_TetR. </li><li> Se digiere el vector pMigR1_TetR con las enzimas de restricción Xba I y Nco I para liberar el fragmento TetR_IRES. Aislar el fragmento de 1,25 kb de inserción. </li><li> Se liga el 4,6 kb pcDNA6/TR y los fragmentos de 1,25 kb TetR_IRES. Transform el producto de ligamiento en E. coli competente e identificar el constructo pcDNA6_TetR_IRES_blast deseada utilizando técnicas estándar de biología molecular. </li></ol> 2. Generación de líneas celulares que expresan establemente TetR <ol><li> En el día 1, Semillas 1x10 6 células por 10-cm placa de cultivo de tejidos utilizando el medio de crecimiento estándar (por ejemplo, DMEM suplementado con 10% FCS). Semilla dos placas, una para la transfección con pcDNA6_TetR_IRES_blast, y el otro como control negativo para la selección blasticidina. Asegúrese de utilizar la menor posible paso y el medio de crecimiento recomendada. </li><li> En el día 2, transfectar una placa con 2 g de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilizando Fugene 6 (E2691, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. No transfectar la segunda placa. </li><li> El día 3, se añade medio de crecimiento estándar que contiene 5 mg / ml blasticidin a ambas placas. Tenga en cuenta que la concentración óptima selección puede variar de una línea celular determinada y podría need a ser determinado de antemano. </li><li> El día 4, dividir las células en 1/5, 1/25, 1/50 y 1/100 utilizando placas de 10 cm y el medio de cultivo estándar que contiene 5 mg / ml de blasticidina. Asegúrese de etiquetar correctamente las placas que contienen las células no transfectadas o transfectadas. Prepare dos planchas por el paso de dilución. </li><li> Compruebe diariamente las células, lo que garantiza que todas las células en las placas no transfectadas murieron en la primera semana. Cambie medio de selección cada 2-3 días. </li><li> Después de 1-2 semanas, las colonias resistentes a blasticidina deben comenzar a aparecer. Seleccione placas que contienen 5 a 50 colonias para asegurar que las colonias individuales se pueden recoger. </li><li> Cuando las colonias han alcanzado un diámetro de aproximadamente 5 mm (o mayor), aislar al menos 12 clones independientes usando cilindros de clonación para recoger colonias individuales. Transferir cada clon en un pocillo separado de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Cuando confluente, dividir las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. </li><li> Siga cl culturaen los medios de selección. Cuando las células confluentes, se separó de cada pocillo en dos pocillos individuales de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. </li><li> Para cada clon a analizar, congelar un pocillo de células confluentes y las células de la cosecha en el bien, para un control posterior por inmunotransferencia. </li><li> Detectar TetR por transferencia Western utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-TET02 anticuerpo (MoBiTec GmbH). Recuerde incluir un lisado de la línea celular parental como un control negativo. </li><li> Seleccione 3 clones con la más alta expresión TetR y ampliar cada cultivo clonal. Congelar las existencias de cada clon prometedor tan pronto como sea posible. Finalmente, examine los parámetros de biología molecular y celular de interés mediante la comparación de las líneas celulares de sus padres con los clones que expresan TetR. Seleccione el &quot;mejor&quot; clon con la más alta expresión TetR que no muestra alteraciones en los parámetros de biología molecular y celular de interés. </li></ol> 3. Prueba piloto de PTER y pT-Rex Vectores DEST30 ExpreseING shRNA o ADNc, Respectivamente <ol><li> Generar PTER plásmido con insertos shRNA como se ha descrito 12. Construir pT-Rex DEST30 vector (12,301-016, Invitrogen) que contiene el cDNA de interés utilizando la tecnología de Gateway (Invitrogen). En caso de expresión de ADNc, la adición de una etiqueta con el ADNc más adelante facilita la detección de la proteína exógena expresada. </li><li> Transitoriamente transfectar la línea de blanco celular de sus padres o con PTER pT Rex-DEST30 plásmidos (que manifieste shRNAs o ADNc de interés) utilizando el reactivo de transfección de elección. Para el ensayo de plásmidos de expresión de shRNA, garantizar una alta eficiencia de transfección se puede lograr. </li><li> Cosecha de las células transfectadas y el proceso para la inmunotransferencia utilizando los anticuerpos apropiados, esperando para detectar un agotamiento o sobreexpresión de su gen de interés. </li></ol> 4. Generación de líneas celulares estables con inducible por tetraciclina (Tet-on) Expresión de shRNAs o cDNAs usando PTER o pT-Rex Vectores DEST30 </p&gt; <ol><li> El día 1, semillas 1x10 6 células de la &quot;mejor&quot; TetR que expresan clon por 10 cm de la placa utilizando el medio estándar de crecimiento suplementado con tetraciclina certificado libre de suero (FBS por ejemplo de Invitrogen; 16,000-014). Seed una placa para la transfección con PTER (o pT-Rex DEST30), y una placa como control negativo para selección doble. Asegúrese de utilizar el pase más bajo posible. </li><li> En el día 2, transfectar una placa con 2 g de PTER (o Pt-Rex DEST30) usando Fugene 6. No transfectar la segunda placa. </li><li> El día 3, se añade medio de crecimiento estándar que contiene 5 mg / ml blasticidin y 500 ug / ml de zeocina (o 1 mg / ml de G418). </li><li> El día 4, dividir las células en 1/5, 1/25, 1/50 y 1/100 utilizando placas de 10 cm y el medio de cultivo estándar que contiene 5 mg / ml y blasticidin 500 mg / ml de zeocina (o 1 mg / ml G418). Prepare dos planchas por el paso de dilución. </li><li> Ver las células diariamente, asegurándose de que dentro de la primera semana todas las células en las placas no transfectadas han muerto.Cambiar el medio de crecimiento estándar que contiene blasticidina y zeocina (o G418) cada 3-4 días. </li><li> Después de 2-3 semanas, blasticidin / zeocina (o blasticidin/G418) doble colonias resistentes deberían comenzar a aparecer. Seleccione placas que contienen 5 a 50 colonias a recoger colonias individuales. </li><li> Cuando las colonias han alcanzado un diámetro de aproximadamente 5 mm (o mayor), utilizar cilindros de clonación para recoger colonias individuales. Aislar al menos 24 clones individuales. Transferir cada clon en un pocillo separado de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. </li><li> Clones de cultivo en medio de mantenimiento que contienen concentraciones de blasticidina (5 mg / ml) y zeocina (250 ug / ml) [o G418 (0,5 mg / ml)]. Cuando confluente, dividir las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. </li><li> Para cada clon a analizar, dividir un confluente pocillo de una placa de 6-así en tres pocillos individuales de una placa de 6-así. Cuando confluente, congelar las células de un pozo. Utilice los restantes dos pozos para probar la tetraciclinae-inducible de expresión. Añadir tetraciclina a una concentración de 1 mg / ml a un pocillo, mientras que deja el segundo tetraciclina bien libre. </li><li> Después de 24 a 96 horas de incubación con células de tetraciclina cosecha, y el proceso para inmunotransferencia utilizando anticuerpos apropiados. Reducción de los tiempos de incubación de tetraciclina se recomiendan cuando la detección de la inducción de la expresión de cDNA, mientras que los tratamientos más prolongados tetraciclina será necesario determinar shRNA mediada por el agotamiento de las proteínas endógenas. </li><li> Seleccione al menos dos clones con el agotamiento deseado / sobreexpresión y expandir cada cultura. Congelar las existencias de cada clon prometedor tan pronto como sea posible. Al crecer Tet-on clones para experimentos asegúrese siempre de utilizar medios de comunicación complementado con tetraciclina libre de suero y los antibióticos de selección correspondientes a las concentraciones de mantenimiento. </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Creemos que Tet-On sistemas facilitan en gran medida el análisis de la función génica, particularmente en sistemas de células que son difíciles de manipular y / o cuando el gen manipulado es esencial para la supervivencia celular. Además, la capacidad de controlar la expresión de genes altamente específicos por Tet-On sistemas ofrece la oportunidad de estudiar las funciones de genes en diferentes etapas (por ejemplo durante la progresión del ciclo celular o bien definidos los procesos de diferenciación). El método prese...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Probado Tet-libre </td></tr><tr><td> Blasticidina </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocina </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA laboratorios </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml en los medios de comunicación </td></tr><tr><td> anti-TET02 </td><td> MoBiTec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Use a 1/1000 a 1/2000 para WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> La tetraciclina </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml en etanol </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml en agua </td></tr><tr><td> Cilindros de clonación </td><td> Bellco Glass Inc. </td><td> 2090-00808 </td><td> reutilizable </td></tr></tbody></table>

generación de líneas celulares estables humanos (tet-on) inducible por tetraciclina o shrna expresión cdna

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Un enfoque importante en el campo de la biología de células de mamíferos es la manipulación de la expresión de genes de interés en líneas celulares seleccionadas, con el fin de revelar una o varias de la función del gen (s) mediante la sobreexpresión transitoria / estable o caída del gen de interés. Desafortunadamente, para las investigaciones de células biológicas diferentes este enfoque no es adecuado cuando las manipulaciones del resultado de la expresión génica en células de crecimiento / proliferación de defectos o la diferenciación celular, no deseada. Por lo tanto, los investigadores han adaptado la proteína represora de tetraciclina (TetR), tomada de la E. coli resistencia a la tetraciclina operón 1, para generar sistemas de regulación eficientes y muy estrecho para expresar ADNc en células de mamífero 2,3. En resumen, TetR se ha modificado para cualquiera de iniciación bloque (1) de la transcripción mediante la unión al operador Tet-(A) en la región del promotor tras la adición de tetraciclina (Tet-off denomina sistema) o bind (2) a la A en tél ausencia de tetraciclina (Tet-on denomina sistema) (Figura 1). Teniendo en cuenta el inconveniente de que el sistema Tet-off requiere la presencia continua de tetraciclina (que tiene una vida media de aproximadamente 24 horas en medio de cultivo de tejido de células) el sistema Tet-on ha sido más ampliamente optimizada, lo que resulta en el desarrollo de muy apretado y sistemas eficientes de vector para la expresión de ADNc tal como se usa aquí. Poco después del establecimiento de la interferencia de ARN (RNAi) para knockdown gen en células de mamífero 4, vectores que expresan corto horquilla RNAs (shRNAs) se describe que la función muy similar a siRNAs 5-11. Sin embargo, estos enfoques shRNA mediada desmontables tienen la misma limitación como estrategias knockout convencionales, ya que el agotamiento estable no es factible cuando los objetivos de genes son esenciales para la supervivencia celular. Para superar esta limitación, van de Wetering et al. 12 modificó la expresión shRNA vector pSUPER 5 </sup&gt; mediante la inserción de una A en la región promotora, lo que les permitió generar líneas celulares estables con depleción inducible por tetraciclina de sus genes diana de interés. Aquí se describe un método para generar eficientemente humano estable Tet-en líneas celulares que conducen fiable sobreexpresión inducible o el agotamiento del gen de interés. Usando este método, se han generado con éxito Tet-en líneas celulares que facilita considerablemente el análisis de la cascada de MST / hMOB / NDR en centrosoma 13,14 y 15,16 apoptosis de señalización. En este reporte se describe nuestros vectores de elección, además de describir los dos pasos consecutivos de manipulación que son necesarios para generar eficientemente humano Tet-en líneas celulares (Figura 2). Por otra parte, además de plantear un protocolo para la generación de recursos humanos Tet-en líneas celulares, vamos a discutir los aspectos críticos relacionados con los procedimientos técnicos y la caracterización de Tet-en las células.

Un ejemplo para la caracterización inicial de RPE-1 líneas celulares que expresan establemente TetR se muestra en la Figura 4. Tenga en cuenta que todos los clones de RPE-1 expresan niveles variables de TetR (compárense las calles 2 y 5), mientras que la línea celular parental (que sirve como control negativo) no expresa la proteína TetR exógeno (Figura 4, carril 1). Esta variación en la expresión entre TetR RPE-1 Tet-on clones de células que se espera, puesto que la expresión de plásmi...

Una manera rápida y sencilla para generar líneas celulares humanas con sobreexpresión inducible y reversible de ADNc o shRNA mediada derribar-del gen de interés. Este método permite a los investigadores a las líneas celulares altamente fiable y reproducible manipular que son difíciles de modificar por métodos de transfección transitoria o estrategias convencionales desmontables / knockout.

Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

El objetivo general de este procedimiento es generar líneas celulares humanas estables con expresión inducible por tetraciclina de ARN-H-S o ADNc. Primero, transfecte las células diana con el plásmido de expresión tatar y seleccione las resistentes al blaster por su resistencia. Luego, seleccione colonias individuales y analice las células que expresan establemente la proteína represora Tet.A continuación, transfecte el mejor clon que expresa teta con plásmidos diseñados para modular la expresión del gen diana bajo el control del elemento de respuesta Tet en cultivo. Las células transfectadas bajo selección doble permiten entonces seleccionar colonias individuales y cribar los clones Teton deseados mediante inmunotransferencia (western blotting). En última instancia, los clones Teton resultantes pueden utilizarse para examinar el impacto de dianas específicas sobre parámetros biológicos seleccionados.El procedimiento será demostrado por un postdoc en el laboratorio. Marty Gomez Martinez genere un vector que impulse la expresión del represor Tet y del gen de resistencia a Blain a partir del mismo promotor CMV en dos placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros, siembre una vez el centro, las seis células en medio de crecimiento estándar, una placa para la transfección con un plásmido de expresión tatar y la otra como control negativo para la selección con Blain. Al día siguiente, transfecte una placa con dos microgramos del plásmido de expresión TTA utilizando FU gene seis.Después de seguir las instrucciones del fabricante, incubar la cultura durante la noche junto a ambas placas. Añadir medio de crecimiento estándar que contenga la concentración óptima de blastina para la línea celular experimental que se esté utilizando después de 24 horas, cosechar las células y etiquetar placas de 10 centímetros para dilución seriada, y proceder a sembrar duplicados de la dilución seriada utilizando medio de crecimiento estándar que contenga cinco microgramos por mililitro de blástido. Asegurarse de etiquetar adecuadamente las placas que contienen células no resecadas o células transfectadas. Monitorear las células, observando específicamente que todas las células en las placas no resecadas hayan muerto dentro de la primera semana.Cambie el medio de selección cada dos o tres días tras una o dos semanas, cuando aparezcan las colonias resistentes al blástico. Seleccione placas que contengan entre cinco y 50 colonias para asegurar que se puedan aislar colonias individuales cuando estas hayan alcanzado un diámetro aproximado de cinco milímetros. Aísle al menos 12 clones independientes utilizando cilindros de clonación para seleccionar colonias individuales.Transfiera cada clon a un pocillo separado de una placa de 24 pocillos para cultivar las células hasta confluencia. Recoleccione y transfiera las células de cada colonia a pocillos individuales de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Continúe cultivando los clones en medio de selección cuando los cultivos alcancen confluencia.Divida las células de cada pocillo en dos pocillos individuales de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Para cada clon que se va a probar, congele un pocillo de células confluentes. Recoleccione las células del segundo pocillo para la evaluación de la expresión de la proteína diana.Realice un inmunotransferencia western en los clones utilizando un lisado de la línea celular parental como control negativo para detectar la proteína tatar. Utilice el anticuerpo monoclonal de ratón anti Tet zero two. Proceda a amplificar los tres clones con la mayor expresión de testar.Almacene gratuitamente los stocks de cada clon prometedor lo antes posible. Ahora las células clonales están listas para examinar sus parámetros moleculares y celulares de interés. Al comparar las líneas celulares parentales con los clones que expresan tatar, seleccione el mejor clon con la expresión más alta de tatar que no muestre alteraciones en los parámetros moleculares y biológicos celulares de interés.Genere plásmidos PTER con insertos de HRNA de interés. Asimismo, construya un vector PT REX desk 30 que contenga el ADNc de interés utilizando la tecnología Gateway. Transfecte transitoriamente la línea celular diana parental con plásmidos PTER o P T-Rex S 30.Utilizando los reactivos de transfección de elección. Luego, recoger las células transfectadas y evaluar la expresión del gen diana mediante inmunoensayos. En el día uno, sembrar dos placas del mejor clon que expresa tetraciclina utilizando medio de crecimiento estándar suplementado con suero certificado libre de tetraciclina y cultivar durante la noche.Al día siguiente, transfecte solo una placa con dos microgramos del plásmido de expresión A-S-H-R-N-A o ADNc utilizando FU gene seis. En el día tres, añada medio de crecimiento estándar que contenga cinco microgramos por mililitro de blastina y 500 microgramos por mililitro de eosina, o blastina y G cuatro 18. Luego, en el día cuatro, divida las células para crear placas duplicadas de diluciones utilizando medio de crecimiento estándar para selección doble.Revise diariamente las células para observar la respuesta de muerte celular al tratamiento con antibiótico y renueve el medio cada tres o cuatro días. Después de dos o tres semanas, cuando comiencen a aparecer colonias resistentes dobles en zeína o en G-418.Seleccione las placas que contengan entre cinco y 50 colonias para seleccionar colonias individuales y cultivarlas hasta que las colonias alcancen un diámetro de aproximadamente cinco milímetros o más. Con cilindros de clonación, seleccione y transfiera colonias individuales a pozos separados de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incube los clones en medio que contenga concentraciones de mantenimiento de cinco microgramos por mililitro de blaster, soin y 50 microgramos por mililitro.Eosina o blaster soin y G cuatro 18. Cuando estén confluentes, dividir las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Cuando estén confluentes, dividir las células en tres pocillos de una placa de seis pocillos para cultivar hasta una confluencia del 100 %.Congele las células de un pocillo para probar la expresión inducible, agregue un microgramo por mililitro de tetraciclina a un pocillo mientras deja el segundo pocillo de células sin tetraciclina. Incube de 24 a 96 horas, utilizando tiempos más cortos para la detección de la inducción de la expresión de ADNc y tiempos más largos para determinar el agotamiento mediado por ARNdh de proteínas endógenas. Luego, recolecte las células y procéselas para inmunodetección utilizando los anticuerpos apropiados.Seleccione al menos dos clones con el agotamiento o sobreexpresión deseados y amplíe cada cultivo. Recuerde congelar muestras de cada clon prometedor lo antes posible. Esta caracterización inicial de una línea celular de epitelio retiniano humano para la expresión estable de tatar muestra que todos los clones RPE uno expresan niveles variables de tatar.Como era de esperar, la línea celular parental RPE uno no expresa la proteína exógena tatar. La variación en la expresión de Tet R entre los clones celulares RPE uno Teton refleja los sitios de integración del plásmido. Este experimento caracteriza clones celulares estables RPE uno Teton que expresan ARN dirigidos contra la quinasa MST tres; se seleccionaron tres clones celulares para análisis posteriores.Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo generar líneas celulares humanas estables con la expresión desregulada de su ARN o ADNc de investigación de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

Este video muestra el sistema de expresión génica de tetraciclina, o Tet-On, en un modelo de ratón. En presencia de doxiciclina, un derivado de la tetraciclina, el sistema Tet-On que consiste en una proteína transactivadora controlada por tetraciclina inversa se activa y expresa el gen de interés.

Expresión génica inducible basada en el sistema regulable por Tet-On in vivo: un sistema de expresión génica inducido por tetraciclina para la activación de la transcripción de genes diana en un modelo de ratón

Este video describe el método de regulación de la expresión génica en células cultivadas mediante transfección con un plásmido que contiene un gen de interés y un plásmido regulador. La expresión de este plásmido puede ser controlada por tetraciclina o sus análogos sintéticos, lo que convierte a este sistema en un modelo útil para estudiar la expresión génica regulable.

Sistema regulable Tet-off inducible: un método in vitro para modular la expresión génica en células cultivadas mediante el sistema Tetraciclina-Off

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.

Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Aprende a generar líneas celulares humanas estables con expresión inducible de cDNA o shRNA mediante el sistema Tet-on. Este método permite el control reversible de la expresión génica para estudiar funciones celulares.

Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

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