Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

El objetivo general de este procedimiento es generar líneas celulares humanas estables con expresión inducible por tetraciclina, S-H-R-N-A o CDNA. En primer lugar, transfecte las células objetivo con el plásmido de expresión tártaro y seleccione el lado del blaster en resistencia. A continuación, elige colonias individuales y pide a gritos células que expresen de forma estable la proteína represora Tet.

A continuación, transfecte el mejor clon que expresa teta con plásmidos diseñados para modular la expresión génica diana bajo el control del cultivo del elemento de respuesta Tet. Las células transfectadas bajo doble selección luego seleccionan colonias individuales y seleccionan los clones de Teton deseados mediante Western blot. En última instancia, los clones de Teton resultantes se pueden utilizar para examinar el impacto de objetivos específicos en parámetros biológicos seleccionados.

La demostración del procedimiento será una postoc en el laboratorio. Marty Gomez Martinez Genere un vector que impulse la expresión del Represor de Tet y el gen de resistencia de Blain del mismo promotor de CMV en dos placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros sembradas en un centro de tiempo, las seis células en medio de crecimiento estándar, una placa para la transfección con un plásmido de expresión tártara y la otra como control negativo para la selección de Blain. Al día siguiente, transfecte una placa con dos microgramos de plásmido de expresión de TTA utilizando el gen FU seis.

Siguiendo las instrucciones del fabricante, incube el cultivo durante la noche junto a ambas placas. Agregue un medio de crecimiento estándar que contenga la concentración óptima de blastina para la línea celular experimental que se está utilizando después de 24 horas, coseche las células, luego etiquete placas de 10 centímetros para la dilución en serie y proceda a duplicar la dilución en placa utilizando un medio de crecimiento estándar que contenga cinco microgramos por mililitro en el lado del blaster en asegúrese de etiquetar correctamente las placas que contienen las células no resecadas o transfectadas. Monitoree las células, teniendo en cuenta específicamente que todas las células de las placas no resecadas hayan muerto dentro de la primera semana.

Cambie el medio de selección cada dos o tres días después de una o dos semanas cuando aparezcan las colonias resistentes al blaster soin. Seleccione placas que contengan entre cinco y 50 colonias para asegurarse de que se puedan recoger colonias individuales cuando las colonias hayan alcanzado un diámetro de aproximadamente cinco milímetros. Aísla al menos 12 clones independientes usando cilindros de clonación para elegir colonias individuales.

Transfiera cada clon a un pocillo separado de una placa de 24 pocillos de celdas de cultivo para la confluencia. Coseche y transfiera las células de cada colonia a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. Continúe cultivando los clones en medios de selección cuando los cultivos sean cofluentes.

Divida las células de cada pocillo en dos pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. Para cada clon que se vaya a analizar, congele un pocillo de las células de confluencia. Cosecha las células del segundo pozo. Para la evaluación de la expresión de la proteína tártara.

Realizar un western blot en los clones utilizando un lisado de la línea celular parental como control negativo para detectar la proteína tártara. Utilice el anticuerpo monoclonal de ratón anti Tet zero two. Proceda a expandir los tres clones de la expresión de estrella más alta.

Libera existencias de cada clon prometedor tan pronto como sea posible. Ahora las células clonales están listas para el examen de los parámetros moleculares y celulares de interés. Comparando las líneas celulares parentales con los clones que expresan tártaro, seleccione el mejor clon con la mayor expresión de tártaro que no muestre ninguna alteración en los parámetros biológicos moleculares y celulares de interés.

Genere plásmidos PTER con insertos HRNA de interés. Construya también un vector de escritorio PT REX 30 que contenga el CDNA de interés utilizando la tecnología de puerta de enlace. Transfectar transitoriamente la línea celular diana parental con plásmidos PTER o P T-Rex S 30.

Utilizando los reactivos de transfección de elección. A continuación, se cosechan las células transfectadas y se evalúa la expresión génica diana mediante inmunoflores. El primer día, vea dos placas del mejor clon expresivo de tártaro utilizando un medio de crecimiento estándar complementado con un cultivo de suero certificado sin tetraciclina durante la noche.

Al día siguiente, transfecte solo una placa con dos microgramos de plásmido de expresión A-S-H-R-N-A o CDNA usando el gen FU seis. En el tercer día, agregue un medio de crecimiento estándar que contenga cinco microgramos por mililitro, blastina y 500 microgramos por mililitro, eosina o blastina y G cuatro 18. Luego, en el cuarto día, divida las células para crear placas duplicadas de diluciones utilizando medio de crecimiento estándar para la doble selección.

Revise las células diariamente para ver la respuesta de muerte celular al tratamiento con antibióticos y reponga el medio cada tres o cuatro días. Después de dos o tres semanas. Cuando el blaster se hace a un lado en zein o el blaster se hace a un lado en G 4 comienzan a aparecer 18 colonias de doble resistencia.

Seleccione las placas que contengan de cinco a 50 colonias para recoger colonias individuales hasta que las colonias hayan alcanzado un diámetro de aproximadamente cinco milímetros o más. Con los cilindros de clonación, elija y transfiera colonias individuales a pocillos separados de un cultivo en placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Los clones en medio que contienen concentraciones de mantenimiento de cinco microgramos por mililitro, blaster, soína y 50 microgramos por mililitro.

Eosina o blaster soin y G cuatro 18. Cuando confluyen, dividen las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. Cuando confluente divide las células en tres pocillos de una placa de seis pocillos para cultivar hasta el 100% de confluencia.

Congele las células de un pocillo para probar la expresión inducible por la prueba, agregue un microgramo por mililitro de tetraciclina a un pocillo mientras deja el segundo pocillo de células. La tetraciclina libre incuba durante 24 a 96 horas, utilizando los tiempos más cortos para el cribado de la inducción de la expresión de CD NA y los tiempos más largos para determinar la depleción de proteínas endógenas mediada por S-H-R-N-A. A continuación, cosecha las células y procesa el inmunoflorecimiento utilizando los anticuerpos adecuados.

Seleccione al menos dos clones con el agotamiento o la sobreexpresión deseados y expanda cada referencia cultural. Recuerde liberar existencias de cada clon prometedor lo antes posible. Esta caracterización inicial de una línea celular epitelial de la retina humana para la expresión estable de tártaro muestra que todos los clones de EPR uno expresan diferentes niveles de tártaro.

Como era de esperar, la línea celular parental RPE one no expresa la proteína tártara exógena. La variación en la expresión de Tet R entre los clones de células RPE one Teton refleja los sitios de integración de plásmidos. Este experimento caracteriza clones estables de células RPE one Teton que expresan ARN dirigidos contra la MST, se eligieron tres clones de células quinasas para su posterior análisis.

Después de ver este video, tiene una buena comprensión de cómo generar líneas celulares humanas estables con esa expresión no regulada de su ARN de investigación o CDNA de interés.