Name: Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprende a evaluar la mecánica respiratoria en ratones mediante la técnica de oscilación forzada con el sistema flexiVent. Este protocolo permite medir la hiperreactividad bronquial inducida por metacolina de forma precisa y controlada.

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TKMcG es apoyado por una beca de la Sociedad Torácica Canadiense. CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES Todos los autores participaron en la concepción del manuscrito. Además, TKMcG inició el proyecto, recoge los resultados experimentales, contribuyó a la redacción del manuscrito y su revisión crítica. AR recopiló y analizó los resultados experimentales, redactado el manuscrito y ha contribuido a su revisión crítica. LF recogen los resultados experimentales y contribuyó a la revisión crítica del manuscrito. TFS y JGM contribuyeron a la revisión crítica del manuscrito.

Los procedimientos que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales Institucional Universidad McGill, de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA). 1. Pasos preparatorios <ol><li> Soluciones: <ol><li> Metacolina: Preparar una solución madre a 50 mg / ml y diluciones en serie (1:01) basado en las concentraciones a ensayar 5. Permitir que las soluciones estén a temperatura ambiente antes de nebulización 5. </li><li> Agentes anestésicos: Diferentes regímenes han sido reportados en la literatura en varias cepas de ratones (Tabla 1) Nota:. Régimen 1 se utilizó en el marco del presente protocolo. </li></ol></li><li> Equipo: El presente protocolo se aplica a cualquiera de las dos generaciones flexiVent soportados por el software flexiWare 7. Las funciones del software se agrupan en tres módulos: el estudio de definición y planificación, experimentación Session y Revisión y Elaboración de Informes. <ol><li> Encienda el sistema (sólo flexiVent FX) y / o iniciar el software. </li><li> En la primera sesión de experimentación o en cualquier momento antes, abra el Estudio de definición del módulo de Planificación de predefinir la estructura del estudio. </li><li> Haga clic en el botón Crear un nuevo estudio y seguir el asistente para crear un estudio, delinear el protocolo y definir los grupos experimentales y los temas a estudiar. </li><li> Iniciar una sesión de experimentación mediante la apertura del módulo Sesión Experimentación y siguiendo la secuencia de puesta en marcha para el estudio y selección de plantillas. </li><li> Asigne un tema a la zona de medición y confirme su peso. </li><li> Proceder a la calibración del sistema siguiendo los pasos descritos en el programa operativo. Se le pedirá en un punto para fijar la cánula a utilizar (paso 1.3.3) a la Y-tubo para la calibración. </li><li> Paso crítico. REPEAt paso 1.2.6 si los valores de calibración obtenidos están fuera del rango aceptable. (Consulte la flexiVent FX o el folleto flexiWare 7 para los rangos aceptables de módulos específicos de valores de calibración). </li><li> Cancele los mensajes para iniciar la ventilación y el registro de datos a menos listo para iniciar el experimento. Estos pueden iniciarse en un momento posterior. </li></ol></li><li> Temas: <ol><li> Se anestesia el tema usando las dosis apropiadas de agentes anestésicos (Tabla 1). </li><li> Verifique que el tema ha llegado a un nivel quirúrgico de anestesia. El sujeto debe mostrar ninguna reacción a una pizca dedo del pie y su respiración debe ser regular y no trabajado. </li><li> Realizar una traqueotomía y canular la tráquea. <ol><li> Colocar el animal en la espalda y proporcionar una fuente de calor (por ejemplo, temperatura manta eléctrica controlada o una lámpara con una bombilla de 60 vatios encuentra a unos 45 cm del ratón para evitar un calentamiento excesivo). </li><li> Clean ªárea de la garganta e con alcohol y exponer la tráquea haciendo una incisión en la piel y separar suavemente la glándula submaxilar y la capa muscular que lo cubre. </li><li> Levante suavemente la tráquea utilizando un par de micro-forceps y pasar la sutura por debajo de ella. </li><li> Cortar entre dos anillos de cartílago de la laringe más cercana para hacer una pequeña incisión en la tráquea sin seccionar ella. </li><li> Insertar la cánula previamente calibrado en la incisión y avanzar suavemente en el interior de la tráquea de la longitud de aproximadamente 5 anillos Nota:. Los presentes experimentos se llevaron a cabo usando un 1,2 cm de largo de metal cánula de calibre 18. </li><li> Paso crítico. Fije la cánula en su lugar con la sutura. El accesorio debe formar un sello hermético alrededor de la cánula. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ventilación Mecánica <ol><li> Lleve al animal cerca del ventilador. </li><li> Iniciar la ventilación mecánica mediante la selección de uno predefinidoo un perfil personalizado de ventilación en la ventana acoplable ventilación. </li><li> Conectar el animal al ventilador a través de la Y-tubo. </li><li> Paso crítico. Alinear el animal al ventilador y asegúrese de que la cánula traqueal está en el mismo nivel que el ventilador para evitar una posible oclusión de la cánula traqueal o giro. </li><li> Paso crítico. Ejecutar una perturbación profunda inflación, haciendo doble clic sobre el nombre de perturbación para verificar la inserción de la cánula y el apego. En ausencia de una fuga, el sistema debe ser capaz de mantener una presión de 30 cm H 2 O durante un periodo de 3 segundos sin desplazamiento excesivo volumen (Figura 1). El volumen registrado y trazas de presión también deben ser lisas, sin signos de desplazamiento o deformación, ya que podrían indicar una obstrucción de la cánula o extravío. </li><li> Si es necesario, conectar transductores de signos vitales para la frecuencia cardiaca y control de la temperatura corporal. De grabación de datos se puede realizar either manualmente o automáticamente a través de un script. </li></ol> 3. Función pulmonar Mediciones Las mediciones o comandos (por ejemplo, la activación nebulizador, marcadores de eventos) se pueden automatizar mediante scripts predefinidos o personalizados para un proceso experimental altamente controlada y repetible (Figura 2). Seis familias de las perturbaciones que dan lugar a un número de parámetros pueden ser utilizados para describir el sistema respiratorio sujetos mecánica al inicio del estudio y tras una entrada dada (Tabla 2). <ol><li> Paso crítico. Cuando esté listo para empezar a tomar medidas, realizar una profunda inflación para reclutar áreas pulmonares cerrados y estandarizar la historia del volumen pulmonar. </li><li> Paso crítico. Verificar la ausencia de esfuerzos inspiratorios espontáneos ejecutando una medición de prueba (por ejemplo PVS-P o PV-V). Tenga en cuenta las trazas de la señal de presión en la vista de conjunto de datos seleccionados. Con curvas PV paso a paso,mesetas de presión debe estar bien definido, sin desviaciones hacia abajo. Una oscilación baja de la presión indicaría un esfuerzo inspiratorio del animal (Figura 3). </li><li> Inicie el script seleccionado haciendo doble clic en su título. Secuencias de comandos utilizados en el presente estudio generalmente incluidos para mediciones: <ul><li> Una secuencia de las mediciones de referencia por triplicado. </li><li> La activación del nebulizador para la evaluación de la capacidad de respuesta de las vías respiratorias a la metacolina inhalada Nota:. Cuando se le solicite por el sistema, cargar aproximadamente 100 l de solución salina o de una solución de metacolina en el nebulizador. La nebulización se iniciará y detendrá automáticamente. </li><li> Una secuencia de mediciones estrechamente espaciados (cada 10-15 segundos) para un período de aproximadamente 3 min después de la activación del nebulizador. </li><li> Un sistema para realizar otro reto y repetir una secuencia de mediciones Nota:. Secar el interior del monte nebulizador con un hisopo en bntre los desafíos pueden ayudar a prevenir las gotas o condensación de construcción-en la línea de inspiración. </li></ul></li><li> Al final del experimento, dejar de ventilación y separar la materia. </li><li> Cambie al siguiente tema en el software de funcionamiento y confirme su peso. </li><li> Paso crítico. Enjuague y seque nebulizador, adaptador, Y-tubo, y la cánula entre los sujetos. </li><li> Repita los pasos 1.2.6 a 3.6. </li><li> Al final del día, cerrar la sesión experimental. Recuerde enjuagar y secar nebulizador, adaptador, Y-tubo, y la cánula y para limpiar la válvula espiratoria del sistema antes de salir del laboratorio, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 4. Análisis de Datos El software calcula y muestra automáticamente los parámetros asociados con una perturbación. También proporciona un coeficiente de determinación (COD) que refleja el ajuste del modelo matemático de los datos. Cada conjunto de datos con una insuCOD ficiente está etiquetado como excluidos por el software. Revisión de las sesiones experimentales, los datos de reanálisis y la creación de escenarios de exportación se realizan en el módulo de revisión y elaboración de informes del software. <ol><li> Abra el módulo de revisión y elaboración de informes y crear un escenario de exportación, teniendo cuidado de incluir sólo los conjuntos de datos que tienen un COD suficiente. </li><li> Exportar como parámetros necesarios, curva de presión o de flujo-volumen, señales de conjuntos de datos en bruto o información sujeta a una hoja de cálculo (véase el cuadro 3). </li><li> Promedio de las mediciones de línea de base para cada parámetro y la trama todas las mediciones como una función del tiempo (véase la Figura 4). A continuación, puede elegir para calcular el área bajo la curva, analizar el perfil general de las curvas o realizar un análisis estadístico. </li><li> Para expresar los resultados vías respiratorias de respuesta como una función de la concentración de metacolina, determinar para cada sujeto, y el parámetro de condición experimental ya sea una específicapunto (por ejemplo, horas punta) o un tiempo específico después de cada prueba de metacolina. Calcular promedios del grupo y el informe de resultados o parcela para cada condición experimental (Tabla 4, Figura 5). </li><li> También puede considerar el cálculo de la concentración que produce una duplicación de un valor de referencia determinado parámetro (PC 200, Figura 5C), la aplicación de la normalización (por ejemplo,% inicial) o la realización de un análisis estadístico. </li></ol>

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AR, LF, TFS son empleados por SCIREQ científicos respiratoria Inc. TFS también tiene acciones. El libre acceso a este artículo es patrocinado por SCIREQ Equipo Respiratorio Scientific, Inc.

El estudio continuo de la disfunción vías respiratorias lo que se refiere al asma y otros trastornos pulmonares sigue siendo primordial para la comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad y el desarrollo de opciones de tratamiento. El uso de ratones para la enfermedad pulmonar modelo ha sido fundamental en la obtención de conocimiento en estos mecanismos de la enfermedad. Al considerar la evaluación de la disfunción vías respiratorias en un sujeto tan pequeño como un ratón, que tiene herramientas fiables y precisos por el cual para medir la función pulmonar es crítica. Por otra parte, tener herramientas capaces de proporcionar puntos de vista de la ubicación de las vías respiratorias o la disfunción efecto terapéutico es muy valiosa. La técnica FOT combina todos estos atributos y proporciona un enfoque poderoso, integrador y de la traducción para evaluar los cambios fisiológicos. Para tener éxito con este tipo de medida en ratones, se debe prestar especial atención a unos pocos pasos, a saber, la calibración del sistema, la resistencia de la ca endotraquealnnula, el tipo de nebulizador (así como su configuración de funcionamiento) el posicionamiento del animal y la normalización de la historia de volumen pulmonar. Además, es imperativo para obtener conjuntos de datos válidos que el sistema respiratorio del sujeto permanece pasiva durante las mediciones. Esto se puede lograr mediante la administración de un agente paralizante muscular, que trabaja en un plano profundo de anestesia o por hiperventilación el sujeto para inducir la apnea (véase la Tabla 1). Los investigadores pueden comenzar a dominar el sistema y su software operativo, si se desea, con cargas de ensayo, mientras que la adquisición de las habilidades necesarias para las mediciones en ratones. Entonces sería lógico para generar resultados reproducibles en los animales no tratados previamente antes de pasar a modelos de enfermedad o ratones tratados. Dado que una proporción importante de modelos de enfermedades respiratorias en la investigación implican la exposición de los animales a los agentes como los alérgenos, toxinas, contaminantes, humo de cigarrillos o gases, la variabilidad en los resultados obtenidos con las MEDIDASpor lo tanto, t técnica descrita en este artículo puede estar influenciado por el procedimiento de exposición utilizada. Normalización de los procesos experimentales clave (por ejemplo, utilizando la exposición controlada por ordenador y sistemas de medición 6, 13, 14) podría tener un impacto significativo en la reducción de la variabilidad. Los ejemplos presentados en este artículo representan una selección de los resultados típicos de ingenuos y cloro-ratones expuestos experimentos además de destacar los puntos fuertes y las limitaciones de la técnica. Como puede verse por ejemplo en la Figura 6, la técnica es capaz de generar mediciones reproducibles de función pulmonar. Si bien se informó de los valores de resistencia de referencia similares entre las cepas de ratón, sin embargo, se observaron diferencias en la elastancia 15. Los cambios sustanciales también son de esperar entre el bebé y ratones adultos 16. En cuanto a los otros en la evaluación fisiológica in vivo, los resultados de alta precisión, como THose generado por la FOT, vienen con una concesión que el estado natural de los sujetos. Este principio, que se conoce como el principio de incertidumbre fenotipificación 1, se aplica a la presente protocolo en el sentido de que las mediciones deben hacerse en anestesiados, tracheotomised (o intubados por vía oral) y mecánicamente ventilado sujetos. Otra limitación de la técnica se puede observar en la Figura 5D-5F donde los datos no están disponibles en las concentraciones más altas para el grupo cloro-expuesta debido a que el ajuste del modelo de fase constante a los datos es pobre por encima de niveles moderados de broncoconstricción. Sin embargo, los animales gravemente broncoconstricción podrían evaluarse mediante el análisis de Zrs directamente 15, o mediante el uso de software de terceros análisis posterior para adaptarse a modelos matemáticos más complejos, por ejemplo, teniendo en cuenta la heterogeneidad de la función mecánica 17. Conjuntos de datos excluidos también se puede observar si las vías respiratorias del animal no son suficientemente passive o si la resistencia de la cánula es demasiado alto. Como regla general, la resistencia de la cánula no debe superar la resistencia del animal al inicio del estudio. Trabajar con una cánula de diámetro interior más grande y / o más corta longitud ayudará a reducir la resistencia a la cánula. Por último, la presente demostración de mediciones FOT en ratones puede ser percibido como una metodología que consume tiempo y por lo tanto menos eficaz o menos aplicables a los estudios longitudinales en comparación con técnicas menos invasivas. Sin embargo este último se asocia con un alto grado de incertidumbre en cuanto a la base de sus resultados y son vistos por muchos como defectuosa 1. Medidas invasivas repetidas son posibles en animales intubados por vía oral, aunque técnicamente más difícil 17. A partir de los ejemplos proporcionados, los resultados demostraron la equivalencia de las dos generaciones del sistema flexiVent en la producción de mediciones de la mecánica respiratoria, así como las vías respiratorias hyperreacdad y la hipersensibilidad a la metacolina inhalada tras la exposición al cloro en ratones. Cuando se usa para caracterizar o comprender los cambios fisiológicos o modelos de la enfermedad, el aspecto detallada de la medida relacionada con la técnica puede contribuir a extender el estado actual del conocimiento.

Caracterización adecuada de las propiedades mecánicas de los pulmones en los animales pequeños se ha convertido en esencial, ya que la creciente de los modelos murinos en la ciencia respiratoria. Cuando se lleva a cabo utilizando la técnica de oscilación forzada (FOT), una técnica también se utiliza en sujetos humanos, estas mediciones proporcionan un enfoque poderoso, integrador y de la traducción para estudiar los cambios fisiológicos significativos. FOT mediciones se obtienen típicamente mediante el análisis de señales de presión y el volumen adquiridos en reacción a una predefinida, pequeña amplitud, forma de onda oscilatoria de flujo de aire (también conocido como perturbación o señal de entrada) aplicado en la apertura de las vías respiratorias del sujeto 1. En su forma más simple, una perturbación FOT sería una única forma de onda sinusoidal a una frecuencia bien definida. Perturbaciones más complejas consisten típicamente en una superposición de una selección específica de formas de onda de frecuencia (mutuamente primo) que cubre un amplio espectro. La descomposición de la multi-frecuenciaseñales de entrada y salida en sus constituyentes utilizando la transformada de Fourier permite el cálculo de la impedancia de entrada del sistema respiratorio (Zrs), es decir, la función de transferencia entre las señales de entrada y salida, en cada frecuencia incluida en la perturbación 2. Por lo tanto, FOT permite la evaluación simultánea de la mecánica respiratoria en un rango de frecuencias en una sola maniobra 2. Modelos matemáticos avanzados de montaje (por ejemplo, el modelo de fase constante 3) a los datos de impedancia a continuación, permiten una partición de la respuesta en las vías respiratorias (central y periférico) y los parámetros dependientes del parénquima del tejido pulmonar 1, 3. Debido a que muchos factores que influyen en la respuesta fisiológica (por ejemplo, frecuencia respiratoria, volumen corriente, volumen de los pulmones, las vías respiratorias superiores, los esfuerzos de respiración espontánea, el momento de las mediciones) son controlados y estandarizados por el sistema de medición y procedimientos experimentales, 1 la técnica es capcapaz de generar mediciones precisas y reproducibles siempre que se realice correctamente. El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada y cronológica del procedimiento necesario para la ejecución de dichas medidas en los ratones. El protocolo consta de cuatro partes: medidas preparatorias (reactivos, equipos y materias), ventilación mecánica, mediciones de la función pulmonar y análisis de datos. Ejemplos de resultados representativos de la mecánica del sistema respiratorio generan utilizando un ventilador de pistón controlado por ordenador (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canadá) se proporcionan. Estos se obtuvieron a partir de ratones no tratados previamente, así como a partir de un modelo impulsado por el estrés oxidativo de daños vías respiratorias caracterizada por la inflamación de las vías respiratorias, el daño celular epitelial y la mayor capacidad de respuesta las vías respiratorias a la metacolina en aerosol inhalado 4. Aunque este protocolo se utiliza a menudo para evaluar la capacidad de respuesta las vías respiratorias a la metacolina inhalada, se extiende a otros resultados y numerosas manifestacioness de patologías como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, fibrosis pulmonar, lesión pulmonar, así como para modelos de ratones transgénicos de patologías similares a la enfermedad humana. Resultados de las investigaciones que utilizan esta herramienta puede contribuir a una mejor caracterización y comprensión de los cambios fisiológicos o modelos de la enfermedad, así como a la expansión a nuevas áreas de investigación.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REACTIVOS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cloruro de acetil-&amp;#946;-metilcolina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>Metacolina</td></tr><tr><td>Pinzas Micro-Adson, 12 cm, dentadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Moria MC31, curvas dentadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris, corte resistente, rectas, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte, hojas de 2,5 mm, rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma no estéril (18g x &amp;frac12;")</td><td>Brico Medical Supplies Inc.</td><td>BN1805</td><td>Cánula endotraqueal</td></tr><tr><td>Sutura de seda 5-0 no estéril</td><td>Seraflex</td><td>IDI58000</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón fosfato</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Starstedt</td><td>SS-4001</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas TB de 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtrantes de 200 &amp;mu;l</td><td>Biosphere</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPO&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiVent&lt;/em&gt; FX</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neblinizador Aerogen Aeroneb</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

La técnica de oscilación forzada (FOT) es una poderosa herramienta de integración y de traducción que permite la evaluación experimental de la función pulmonar en los ratones de una manera integral, detallada, precisa y reproducible. Se proporciona mediciones de la mecánica del sistema respiratorio a través del análisis de las señales de presión y el volumen adquiridos en reacción a predefinido, pequeña amplitud, formas de onda oscilatoria de flujo de aire, que se aplica típicamente en la apertura de las vías respiratorias del sujeto. Los actuales datos de protocolo de los pasos necesarios para ejecutar adecuadamente las medidas de oscilación forzada en ratones utilizando un ventilador de pistón controlado por ordenador (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canadá). La descripción se divide en cuatro partes: medidas preparatorias, ventilación mecánica, mediciones de la función pulmonar y análisis de datos. También incluye información sobre la forma de evaluar la capacidad de respuesta las vías respiratorias a la metacolina inhalada en ratones anestesiados, una aplicación común de este technique que se extiende también a otros resultados y diversas patologías pulmonares. Las mediciones obtenidas en ratones no tratados previamente, así como a partir de un modelo impulsado por el estrés oxidativo de daños las vías respiratorias se presentan para ilustrar cómo esta herramienta puede contribuir a una mejor caracterización y comprensión de los cambios fisiológicos estudiados o modelos de enfermedades, así como para aplicaciones en nuevas áreas de investigación.

Mecánica del sistema respiratorio mediciones. Tabla 4 muestra los resultados típicos de ingenuos A / J ratones obtenidos al inicio del estudio y después de la broncoconstricción inducida por metacolina (12,5 mg / ml) usando cualquiera de las dos generaciones flexiVent soportados por el software flexiWare 7. Mecánica del sistema respiratorio, es decir, bajo condiciones de tórax cerrado, se evaluaron por perturbaciones de la frecuencia de oscilación familias individuales y de banda ancha forzados alterna de una manera estrechamente espaciados (snapshot-150, Quick Prime-3, respectivamente). Dado que la ventilación está en pausa durante las mediciones, el Quick Prime-3, que cubre una gama de frecuencias similar a la Prime-8, pero tiene una duración más corta (3 vs 8 segundos), fue seleccionado con el fin de acortar el período de apnea, minimizar el efecto de la perturbación de los gases en sangre y proporcionar una mejor resolución de la respuesta. Los parámetros asociados con cada perturbación se calcularon automaticaLLY por el software operativo. Los resultados muestran que las dos generaciones del sistema flexiVent producen medidas equivalentes de la mecánica respiratoria. Sitio de la respuesta pulmonar. Distinguiendo el sitio de la respuesta pulmonar permite al investigador identificar regiones más afectadas, así como para identificar los posibles puntos de intervención farmacológica 6. Por ejemplo, no tratados previamente ratones A / J muestran un aumento de la resistencia de línea de base cuando la presión espiratoria final contra el que se realizan las mediciones se incrementa del 3 al 9 cm de H 2 O (Figura 6A, SnapShot-150). En el presente ejemplo, el uso de las mediciones de banda ancha FOT (Quick Prime-3) proporciona detalles para aclarar la base para el cambio en la resistencia: El cambio en la presión espiratoria final resultó en una disminución en la resistencia de las vías respiratorias (R N) consistente con la efectos broncodilatadores de un volumen pulmonar mayor y la prensa inflación mayorUre (Figura 6D) y un aumento en el tejido de amortiguación (G; Figura 6E), un parámetro estrechamente relacionado con la resistencia del tejido que refleja viscoelasticidad tejido y, posiblemente, la resistencia de las vías aéreas pequeñas 7. Este último se sabe que aumenta con el aumento del volumen pulmonar. Hiperreactividad de las vías respiratorias. Después de la exposición al gas de cloro, capacidad de respuesta las vías respiratorias a la metacolina inhalada aumenta en comparación con la exposición al aire en ratones Balb / c como resultado de daños vías respiratorias 4 (Figura 2). El cloro se sabe que induce el estrés oxidativo, que conduce a la destrucción de las células estructurales en las vías respiratorias, en particular las células epiteliales, y la inducción de reclutamiento de células inflamatorias. Como se representa en la Figura 5, los cambios en todos los parámetros que describen la mecánica del sistema respiratorio pueden ser vistos en respuesta a los retos crecientes de metacolina. En comparación con los ratones expuestos al aire, los ratones expuestos a cloraciónne muestra de gas mayores respuestas máximas en todos los parámetros FOT (Figura 5A, 5B, 5D-5F), así como un desplazamiento hacia la izquierda estadísticamente significativa de la curva de concentración-respuesta se ejemplifica por una reducción de la concentración de metacolina requerida para causar una duplicación en la resistencia y elastancia (PC 200; Figura 5C). Estos resultados ilustran, respectivamente, la hiperreactividad de las vías respiratorias e hipersensibilidad a la metacolina inhalada después de la exposición al gas de cloro. Otras mediciones. Además de FOT, el sistema flexiVent también se puede utilizar para recoger otros tipos de 8-10 función pulmonar o cardiovascular 11 mediciones. Figura 7 muestra una curva representativa paso a paso, accionado por presión de presión-volumen en ratones ingenuos A / J en condiciones basales . La porción superior de la extremidad deflación de la curva se ajusta a la ecuación de Salazar-Knowles 12 </<html> sup&gt; y los parámetros son calculados automáticamente por el software. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="Tabla 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabla 1. Ejemplos de regímenes anestésicos utilizados en ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la tabla más grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="Tabla 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> Tabla 2. Las perturbaciones utilizados para mediciones de la función pulmonar en ratones. * Extensión requerida para el sistema. El sujeto también necesita estar en una cámara de pletismógrafo cerrada durante las mediciones.lacio &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la tabla más grande. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="Tabla 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabla 3. Ejemplo de parámetros exportados desde la frecuencia de oscilación forzada familias perturbación individuales y de banda ancha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la tabla más grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="Tabla 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabla 4. Comparación del sistema. Comparación de los parámetros de la mecánica pulmonar obtenida mediante las dos generaciones del sistema flexiVent operados por software flexiWare 7. Los resultados se generan en ratones ingenuos A / J (n = 5 /<html> grupo) al inicio del estudio y después de la broncoconstricción inducida por metacolina (Mch 12,5 mg / ml). * Los grupos se compararon mediante un ANOVA de dos vías para medidas repetidas y el registro de 10 de las respuestas individuales de homogeneidad de varianzas (GraphPad Prism, versión 5.03, GraphPad Software, San Diego, EE.UU.). <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> Figura 1. Captura de una inflación pulmón profundo. El panel superior muestra el volumen desplazado por el pistón del ventilador (trazo rojo) y el volumen entregado al sujeto (traza gris). El panel inferior muestra el aumento de la presión del cilindro a una presión ajustada de 30 cm de H 2 O durante un período de 3 segundos y se mantuvo constante durante el mismo período de tiempo. 172/50172fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Ejemplo de un guión típico utilizado para evaluar la mecánica del sistema respiratorio al inicio del estudio. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Los esfuerzos inspiratorios espontáneos durante la ejecución de una curva de presión-volumen paso a paso. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> La Figura 4. El curso temporal de respuesta siguientes desafíos crecientes de metacolina inhalada. Los resultados se expresan como la media (± desviación estándar) de un grupo de 5 ingenuos espontáneamente hyperresponsive A / J ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> Figura 5. Los cambios en la mecánica del sistema respiratorio siguientes desafíos crecientes de metacolina en cloro y ratones Balb / c con aire expuestos. Valor pico se identificó para cada parámetro en cada materia y la condición experimental. Luego se calcularon los promedios de grupo (media ± desviación estándar, n = 4-6). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante análisis de varianza utilizando el registro 10 de las respuestas individuales para la homogeneidad de las varianzas. La concentración de metacolina producir una duplicación de la línea de base (PC 200) se obtuvo mediante el ajuste de un polinomio de segundo orden a las curvas de dosis-respuesta individuales y la interpolación de la curva ajustada. Los puntos de datos que faltan en D, E y F en los ratones expuestos al cloroa las dos concentraciones más altas de metacolina debido a insuficiente altos coeficientes de determinación que refleja un mal ajuste del modelo matemático a los datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="La figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> La Figura 6. Creación de particiones de la respuesta de las vías respiratorias en las vías respiratorias y la mecánica de tejido pulmonar. Traza experimental de un ingenuo ratones A / J que ilustran una sola frecuencia (2,5 Hz) y banda ancha (1-20.5Hz) obligados mediciones de oscilación de la mecánica respiratoria, por triplicado, a dos presiones espiratorias finales diferentes (3 y 9 cm H 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> </a&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="La figura 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> Figura 7. Las curvas de presión-volumen curva de presión-volumen en ratones ingenuos A / J en condiciones basales. Se generaron utilizando una perturbación impulsado por presión por etapas (PV-P) para asegurar que cada uno se inflaron los pulmones del ratón a la misma presión, independientemente de su condición. Salazar-Knowles parámetros de la ecuación extraídos de las curvas de presión-volumen individuales también se promediaron y reportados en un formato de tabla. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (n = 6).

El presente protocolo proporciona una descripción paso a paso detallado de los procedimientos necesarios para ejecutar las mediciones de la mecánica del sistema respiratorio, así como la evaluación de las vías respiratorias de respuesta a la metacolina inhalada en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar mediciones de mecánica respiratoria mediante oscilación forzada en ratones utilizando el sistema flexiVent, un ventilador de pistón controlado por computadora. Esto se realizará mediante la evaluación de la respuesta de las vías respiratorias a la metilcolina inhalada. El primer paso consiste en preparar los reactivos necesarios, el equipo y al sujeto.Luego, se conecta al sujeto al ventilador para la ventilación mecánica y las mediciones de la mecánica respiratoria. Mediante un protocolo predefinido, se realiza una serie de mediciones automatizadas altamente controladas en condiciones basales y tras el desafío con metilcolina. El análisis de los resultados puede mostrar hiperreactividad de las vías respiratorias, evidenciada por mayores respuestas máximas de resistencia y elastancia en ratones expuestos al cloro en comparación con los sujetos control.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que proporciona una herramienta precisa para medir la función pulmonar de manera integral, detallada y traslacional. Esto se logra mediante el análisis de las señales de presión y volumen adquiridas en respuesta a formas de onda de flujo de aire oscilatorio predefinidas aplicadas en la abertura de la vía aérea del sujeto. Además, muchos factores que influyen en la respuesta fisiológica pueden controlarse y estandarizarse.Utilizando este método, encienda el sistema Flex event FX e inicie el software. El presente protocolo se aplica a cualquiera de las dos generaciones de flex event compatibles con flexi. Use el software seven en la primera sesión de experimentación o en cualquier momento anterior. Abra el módulo de definición y planificación del estudio para predefinir la estructura del estudio.Haga clic en el botón para crear un nuevo estudio y siga el asistente para crear un estudio. Esboce el protocolo y defina los grupos experimentales y los sujetos que se estudiarán. Inicie una sesión de experimentación abriendo el módulo de sesión de experimentación y siguiendo la secuencia de arranque.Para el estudio y selección de la plantilla. Asigne un sujeto al sitio de medición y confirme su peso. Continúe con la calibración del sistema siguiendo los pasos descritos en el software de operación.Aparece un aviso para conectar la cánula que se va a utilizar al tubo en Y con fines de calibración. Continúe con la calibración de la cánula siguiendo los pasos del asistente de calibración y verifique que los valores obtenidos se encuentren dentro del rango especificado. Si es necesario, repita el proceso de calibración; de lo contrario, cancele los avisos para iniciar la ventilación y la grabación de datos.Estos pueden iniciarse en un momento posterior. Anestesiar al sujeto utilizando dosis adecuadas de agentes anestésicos. Verificar que el sujeto haya alcanzado un nivel quirúrgico de anestesia.El sujeto no debe mostrar ninguna reacción ante un pellizco en el dedo del pie y su respiración debe ser regular y no forzada. Coloque al animal en posición supina con una fuente de calor para mantener la temperatura corporal adecuada. Una bombilla de 60 vatios colocada a 45 centímetros del ratón es suficiente.Luego limpie el área de la garganta con alcohol para exponer la tráquea. Haga una incisión y separe suavemente la glándula submaxilar y la capa muscular que la cubre. Levante suavemente la tráquea utilizando un par de pinzas microscópicas.Luego pase una sutura por debajo de ella. Corte entre los dos anillos de cartílago más cercanos a la laringe. Esto realiza una pequeña incisión en la tráquea sin seccionarla.Inserte la cánula calibrada en la incisión y avance suavemente a través de cinco anillos traqueales. En este ejemplo, se utiliza una cánula metálica de 18 gauge y 1,2 centímetros. Es fundamental asegurar la cánula utilizando la sutura.La conexión debe formar un sello hermético alrededor de la cánula. Acercar el animal canulado al ventilador. Iniciar la ventilación mecánica seleccionando un perfil de ventilación predefinido o personalizado en el módulo de ventilación.Ahora conecte el animal al ventilador mediante el tubo en Y. Alinee cuidadosamente el animal con el ventilador y asegúrese de que la cánula traqueal esté al mismo nivel que el ventilador. Esto evita una posible oclusión de la cánula o torsión traqueal en el software.Realice una perturbación mediante inflación profunda haciendo doble clic sobre el nombre de la perturbación para verificar la inserción y fijación de la cánula. A menos que haya una fuga, el sistema mantendrá una presión de 30 centímetros de agua durante un período de tres segundos sin desplazamiento excesivo de volumen. Las trazas registradas de volumen y presión deben ser suaves, sin signos de desviación o deformación.De lo contrario, podría haber una cánula, obstrucción o mal posicionamiento en este punto. Los transductores de signos vitales para el monitoreo de la frecuencia cardíaca y la temperatura corporal pueden conectarse si es necesario. La grabación de datos de estas señales puede iniciarse en cualquier momento, ya sea manualmente o automáticamente mediante un script.Las mediciones o comandos para la activación del nebulizador, marcadores de eventos, entre otros, pueden automatizarse mediante el uso de guiones predefinidos o personalizados para un proceso experimental altamente controlado y repetible. Seis familias de perturbaciones, que dan lugar a una serie de parámetros, pueden utilizarse para describir la mecánica del sistema respiratorio del sujeto en condiciones basales y tras un desafío determinado. Cuando se esté listo para comenzar a tomar mediciones, es importante ejecutar primero la perturbación de la inflación profunda para reclutar áreas pulmonares cerradas y estandarizar la historia del volumen pulmonar.A continuación, verifique la ausencia de esfuerzos inspiratorios espontáneos realizando una medición de prueba. Observe las trazas de la señal de presión en la vista del conjunto de datos seleccionado. Con curvas PV escalonadas.Los plateau de presión deben estar bien definidos y no presentar deflexiones hacia abajo. Una caída en la presión indicaría un esfuerzo inspiratorio del animal. Ahora inicie el script para la evaluación de la respuesta de las vías aéreas a la metilcolina inhalada haciendo doble clic en su título.En este ejemplo, el script realiza una serie de mediciones basales por triplicado. Luego, aparece un aviso para cargar el nebulizador con solución salina. O, en este ejemplo, una solución de metacolina: cargue aproximadamente 100 microlitros de la solución en el nebulizador.La nebulización comenzará automáticamente tan pronto como se introduzca la información en el software. Poco después del final de la nebulización, se inicia una secuencia de mediciones estrechamente espaciadas durante aproximadamente tres minutos. A continuación, aparecerá un aviso para realizar.Otro desafío se presenta y la secuencia de mediciones puede repetirse entre desafíos. Secar el interior del soporte del nebulizador con un hisopo puede ayudar a prevenir la acumulación de gotas o condensación en la línea inspiratoria. A medida que se recopilan los datos, el software calcula los parámetros asociados con la perturbación y proporciona un coeficiente de determinación basado en el ajuste de los datos al modelo.Posteriormente, el experimento puede accederse mediante el módulo de revisión y reportes del software para exportar o analizar más a fondo los datos. Al finalizar el experimento, detenga la ventilación y desconecte al sujeto. Una vez desconectado, sacrifique rápidamente al animal con una sobredosis de pentobarbital sódico, y luego puede realizarse una lavado broncoalveolar o pueden aislarse los pulmones para un análisis posterior.Antes de pasar al siguiente sujeto, enjuague y seque el adaptador del nebulizador, el tubo en Y y la cánula. Cambie al siguiente sujeto en el software de operación y confirme su peso. Luego, continúe con los pasos de calibración sugeridos antes de proseguir con el experimento.Al final del día, enjuague y seque el equipo. Recuerde, antes de finalizar la sesión experimental, limpiar también la válvula espiratoria del sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante para mantener el rendimiento de su sistema. Los siguientes ejemplos representan una selección de resultados típicos de experimentos con ratones naïve y expuestos al cloro, así como resultados equivalentes de ratones naïve aj.Los ratones se obtuvieron en la línea base y tras la broncoconstricción inducida por metilcolina, utilizando cualquiera de las dos generaciones de eventos flex compatibles con flexi wear seven. Dado que las mediciones de FOT de banda ancha permiten la partición de la respuesta pulmonar en parámetros de la vía aérea y del tejido parenquimatoso, proporcionan un medio para identificar las regiones pulmonares afectadas. Por ejemplo, los ratones AJ ingenuos mostraron un aumento de la resistencia basal cuando la presión expiratoria final se incrementó de tres a nueve centímetros de agua.El cambio en la presión al final de la espiración provocó una disminución en la resistencia de las vías respiratorias, consistente con los efectos broncodilatadores de un mayor volumen pulmonar y de una presión de inflación más alta, y un aumento en la amortiguación del tejido, un parámetro estrechamente relacionado con la resistencia del tejido que refleja la viscoelasticidad del tejido y posiblemente la resistencia de las pequeñas vías respiratorias. Se sabe que este último parámetro aumenta con el incremento del volumen pulmonar. Este protocolo se utiliza frecuentemente para evaluar la respuesta de las vías respiratorias a la metilcolina inhalada tras la exposición a gas cloro.Los ratones B.SEA mostraron hiperreactividad de las vías respiratorias en comparación con los controles expuestos al aire. En el presente ejemplo, los ratones expuestos al gas cloro mostraron respuestas máximas mayores en todos los parámetros de FOT. Estos ratones también mostraron un desplazamiento estadísticamente significativo hacia la izquierda de la curva de respuesta a la concentración o hipersensibilidad a la metilcolina inhalada, lo que se ejemplifica por una reducción en la concentración de metilcolina necesaria para provocar un duplicado en la resistencia y la elastina.Además de la FOT, el sistema de eventos de flexibilidad puede registrar otras mediciones, como las curvas de presión-volumen. La porción superior del tramo de desinflación se ajusta a la ecuación de Salazar Knolls, y el software calcula los parámetros asociados. Para tener éxito con esta técnica, es importante prestar atención a cada paso; en particular, la calibración del sistema, la resistencia de la cánula endotraqueal, la colocación del animal y la normalización de los volúmenes pulmonares.Si se siguen estos pasos con precisión, este método proporcionará una caracterización precisa de las propiedades mecánicas del pulmón de ratón.

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Research

Investigación

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