Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada
15 de mayo de 2013
El presente protocolo proporciona una descripción paso a paso detallado de los procedimientos necesarios para ejecutar las mediciones de la mecánica del sistema respiratorio, así como la evaluación de las vías respiratorias de respuesta a la metacolina inhalada en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).
El objetivo general de este procedimiento es demostrar las mediciones de oscilación forzada de la mecánica respiratoria en ratones utilizando el evento flex, un ventilador de pistón comercial controlado por computadora. Esto se hará a través de la evaluación de la respuesta de las vías respiratorias a la metilcolina inhalada. El primer paso es preparar los reactivos necesarios, el equipo y el sujeto.
A continuación, el sujeto se conecta al ventilador para realizar mediciones de ventilación mecánica y mecánica respiratoria. Utilizando un script predefinido, se realiza una colección de mediciones automatizadas altamente controladas al inicio y después del desafío con metilcolina. El análisis de los resultados puede mostrar hiperreactividad de las vías respiratorias, como se observa por las mayores respuestas máximas de resistencia y elastina en ratones expuestos al cloro en comparación con los sujetos de control.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que proporciona una herramienta precisa para medir la función pulmonar de forma exhaustiva, detallada y traslacional. Esto se logra a través del análisis de las señales de presión y volumen adquiridas en reacción a formas de onda de flujo de aire oscilatorias predefinidas aplicadas en la apertura de las vías respiratorias del sujeto. Además, muchos factores que influyen en la respuesta fisiológica pueden controlarse y estandarizarse.
Con este método, encienda el sistema FX de eventos Flex e inicie el software. El presente protocolo se aplica a cualquiera de las dos generaciones de eventos flex compatibles con flexi. Use el software Seven en la primera sesión de experimentación o en cualquier momento antes de ella Abra el módulo de definición y planificación del estudio para predefinir la estructura del estudio.
Haga clic en el botón crear un nuevo estudio y siga el asistente para crear un estudio. Esbozar el protocolo y definir los grupos experimentales y los sujetos a estudiar. Inicie una sesión de experimentación abriendo el módulo de sesión de experimentación y siguiendo la secuencia de inicio.
Para el estudio y la selección de plantillas. Asigne un sujeto al sitio de medición y confirme su peso. Proceda con la calibración del sistema siguiendo los pasos descritos en el software operativo.
Aparece un mensaje para conectar la cánula que se utilizará al tubo Y para la calibración. Continúe con la calibración de la cánula siguiendo los pasos del asistente de calibración y verifique que los valores de calibración obtenidos estén dentro del rango especificado. Si es necesario, repita el proceso de calibración a menos que esté listo, cancele las indicaciones para iniciar la ventilación y el registro de datos.
Estos pueden iniciarse en un momento posterior. Anestesiar al sujeto con dosis apropiadas de agentes anestésicos. Verificar que el sujeto haya alcanzado un nivel quirúrgico de anestesia.
El sujeto no debe mostrar ninguna reacción a un pellizco en el dedo del pie y su respiración debe ser regular y no dificultosa. Coloque al animal en decúbito supino con una fuente de calor para mantener la temperatura corporal adecuada. Una bombilla de 60 vatios colocada a 45 centímetros del ratón es adecuada.
Luego limpie el área de la garganta con alcohol para exponer la tráquea. Haga una incisión y separe suavemente la glándula submaxilar y la capa muscular que la cubre. Levante suavemente la tráquea con un par de micropinzas.
A continuación, pasa una sutura por debajo. Corte entre los dos anillos de cartílago más cercanos a la laringe. Esto hace una pequeña incisión en la tráquea sin seccionarla.
Inserte la cánula calibrada en la incisión y hágala avanzar suavemente a través de cinco anillos traqueales. En este ejemplo, está en funcionamiento una cánula metálica de calibre 18 de 1,2 centímetros. Es fundamental asegurar la cánula con la sutura.
El accesorio debe formar un sello hermético alrededor de la cánula. Acerque el animal canulado al ventilador. Inicie la ventilación mecánica seleccionando un perfil de ventilación predefinido o personalizado en la ventana acoplable de ventilación.
Ahora conecte el animal al ventilador a través del tubo en Y. Alinee cuidadosamente al animal con el ventilador y asegúrese de que la cánula traqueal esté al mismo nivel que el ventilador. Esto evita una posible cánula, oclusión o torsión traqueal en el software.
Ejecute una perturbación de inflado profundo haciendo doble clic en el nombre de la perturbación para verificar la inserción y la conexión de la cánula. A menos que haya una fuga, el sistema mantendrá una presión de 30 centímetros de agua durante un período de tres segundos sin un desplazamiento de volumen excesivo. Las trazas de volumen y presión registradas deben ser suaves, sin signos de desplazamiento o deformación.
De lo contrario, puede haber una cánula, obstrucción o extravío en este punto. Si es necesario, se pueden conectar transductores de signos vitales para la monitorización de la frecuencia cardíaca y la temperatura corporal. El registro de datos de estas señales puede iniciarse en cualquier momento, ya sea de forma manual o automática a través de un script.
Las mediciones o comandos para la activación del nebulizador, los marcadores de eventos, etc., se pueden automatizar mediante scripts predefinidos o personalizados para un proceso experimental altamente controlado y repetible. Se pueden utilizar seis familias de perturbaciones que dan lugar a una serie de parámetros para describir la mecánica del sistema respiratorio en cuestión al inicio y después de un desafío dado. Cuando esté listo para comenzar a tomar mediciones, es importante ejecutar primero la perturbación de inflado profunda para reclutar áreas pulmonares cerradas y estandarizar el historial de volumen pulmonar.
A continuación, verifique la ausencia de esfuerzos inspiratorios espontáneos mediante la ejecución de una medición de prueba. Observe las trazas de la señal de presión en la vista del conjunto de datos seleccionado. Con curvas fotovoltaicas escalonadas.
Las mesetas de presión deben estar bien definidas sin desviaciones hacia abajo. Un balanceo descendente de la presión indicaría un esfuerzo inspiratorio por parte del animal. Ahora inicie el script para la evaluación de la respuesta de las vías respiratorias a la metilcolina inhalada haciendo doble clic en su título.
En este ejemplo, el script realiza una secuencia de mediciones de línea base por triplicado. Luego hay un mensaje para cargar el nebulizador con solución salina. O en este ejemplo, una solución de metilcolina carga aproximadamente 100 microlitros de solución en el nebulizador.
La nebulización se iniciará automáticamente tan pronto como se ingrese la información en el software. Poco después del final de la nebulización, se inicia una secuencia de mediciones muy espaciadas durante aproximadamente tres minutos. A continuación, un mensaje para realizar.
Se proporciona otro desafío y la secuencia de mediciones se puede repetir entre desafíos. Secar el interior del soporte del nebulizador con un hisopo puede ayudar a evitar que se acumulen gotas o condensación en la línea inspiratoria. A medida que se recopilan los datos, el software calcula los parámetros asociados con la perturbación y proporciona un coeficiente de determinación basado en el ajuste de los datos al modelo.
Más tarde, se puede acceder al experimento a través del módulo de revisión e informes del software para exportar o analizar más a fondo los datos. Al final del experimento, detenga la ventilación y separe al sujeto. Una vez desprendido, se sacrifica rápidamente al animal con una sobredosis de pentobarbital sódico, luego se puede realizar un lavado broncoalveolar o se pueden aislar los pulmones para su posterior análisis.
Antes de pasar al siguiente tema, enjuague y seque el adaptador del nebulizador, el tubo y la cánula. Cambie al siguiente tema en el software operativo y confirme su peso. A continuación, continúe con los pasos de calibración sugeridos antes de continuar con el experimento.
Al final del día, enjuague y seque el equipo. Recuerde, antes de cerrar la sesión experimental, limpiar también la válvula espiratoria del sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante para mantener el rendimiento de su sistema. Los siguientes ejemplos representan una selección de resultados típicos de experimentos con ratones ingenuos y expuestos al cloro, resultados equivalentes de aj naïve.
Los ratones se obtuvieron al inicio y después de la broncoconstricción inducida por metilcolina utilizando cualquiera de las dos generaciones de eventos de flexión respaldadas por flexi wear seven. Debido a que las mediciones de FOT de banda ancha permiten una partición de la respuesta pulmonar en parámetros de las vías respiratorias y el tejido parenquimatoso, proporcionan un medio para identificar las regiones pulmonares afectadas. Por ejemplo, los ratones AJ ingenuos mostraron un aumento de la resistencia basal cuando la presión espiratoria final se incrementó de tres a nueve centímetros de agua.
El cambio en la presión final de la espiración resultó en una disminución de la resistencia de la vía aérea consistente con los efectos broncodilatadores de un mayor volumen pulmonar y una mayor presión de inflado, y un aumento en el amortiguamiento de los tejidos, un parámetro estrechamente relacionado con la resistencia de los tejidos que refleja la viscoelasticidad de los tejidos y, posiblemente, la resistencia de las vías respiratorias pequeñas. Se sabe que este último aumenta con el aumento del volumen pulmonar. Este protocolo se utiliza a menudo para evaluar la respuesta de las vías respiratorias a la metilcolina inhalada después de la exposición al cloro gaseoso.
Los ratones B.SEA mostraron hiperreactividad de las vías respiratorias en comparación con los controles expuestos al aire. En el presente ejemplo, los ratones expuestos al cloro gaseoso mostraron mayores respuestas máximas en todos los parámetros de FOT. Estos ratones también mostraron un desplazamiento a la izquierda estadísticamente significativo de la curva de respuesta a la concentración o hipersensibilidad a la metilcolina inhalada, que se ejemplifica con una reducción de la concentración de metilcolina necesaria para causar una duplicación de la resistencia y la elastina.
Además de FOT, el sistema de eventos flex puede registrar otras mediciones, como curvas de volumen de presión. La parte superior de la extremidad de deflación se ajusta a la ecuación de Salazar Knolls, y los parámetros asociados son calculados por el software. Para tener éxito con esta técnica, es importante prestar atención a cada paso de particular importancia son la calibración del sistema, la resistencia de la cánula endotraqueal, el posicionamiento del animal y la estandarización de los volúmenes pulmonares.
Si estos pasos se siguen con precisión, este método le proporcionará una caracterización precisa de las propiedades mecánicas del pulmón del ratón.
Descripción general
Este protocolo detalla los procedimientos para medir la mecánica del sistema respiratorio y evaluar la respuesta de las vías aéreas a la metacolina inhalada en ratones mediante la técnica de oscilación forzada (flexiVent). El método permite mediciones precisas y controladas de la función pulmonar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología respiratoria
- Modelos animales
- Técnicas de medición
Antecedentes
- La técnica de oscilación forzada proporciona un método no invasivo para evaluar la función pulmonar.
- La metacolina se utiliza para evaluar la hiperreactividad de las vías respiratorias.
- El sistema flexiVent permite un control preciso de los parámetros de ventilación.
- La estandarización de las respuestas fisiológicas es fundamental para la reproducibilidad.
Objetivo del estudio
- Demostrar las mediciones de oscilación forzada de la mecánica respiratoria.
- Evaluar la respuesta de las vías aéreas en un montaje experimental controlado.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores en fisiología respiratoria.
Métodos Utilizados
- Preparación de reactivos y equipo para el experimento.
- Ventilación mecánica del sujeto utilizando el sistema flexiVent.
- Mediciones automatizadas de la mecánica respiratoria en condiciones basales y tras el desafío con metacolina.
- Análisis de datos para evaluar la respuesta de las vías respiratorias y la función pulmonar.
Resultados principales
- Identificación de la hiperreactividad de las vías respiratorias en ratones tratados.
- Mediciones precisas de la resistencia y la elastancia en respuesta a la metacolina.
- Los protocolos estandarizados mejoran la reproducibilidad de los resultados.
- Demostración de las ventajas del flexiVent frente a los métodos tradicionales.
Conclusiones
- La técnica de oscilación forzada es eficaz para evaluar la mecánica respiratoria.
- Este protocolo ofrece un enfoque integral para los investigadores.
- Estudios futuros pueden basarse en esta metodología para obtener mayores conocimientos sobre la fisiología respiratoria.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La técnica de oscilación forzada (FOT) proporciona una herramienta traslacional para evaluar la función pulmonar en modelos preclínicos, permitiendo la reducción mecanicista de riesgos de dianas respiratorias. Al ofrecer mediciones cuantitativas y reproducibles de la mecánica del sistema respiratorio, la FOT apoya la validación de dianas y la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque ayuda a caracterizar modelos de enfermedad y a cribar compuestos frente a la hiperreactividad de las vías aéreas, aportando información para tomar decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de terapias respiratorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de los cambios en la resistencia y elastancia de las vías respiratorias en respuesta al desafío con metacolina.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas y automatizadas que reducen la variabilidad y apoyan evaluaciones reproducibles del acoplamiento al blanco.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante un fenotipado preciso de la mecánica pulmonar en modelos de enfermedad, ayudando en la selección de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos con respuesta dependiente de la dosis sobre la función de las vías respiratorias, permitiendo la selección confiable de compuestos con efectos broncodilatadores o broncoconstrictores.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante perfiles de ventilación predefinidos y secuencias automatizadas de perturbaciones, asegurando consistencia entre experimentos.
- Escalabilidad: El sistema flexiVent permite mediciones de alto rendimiento y repetibles, facilitando la reutilización de la plataforma en flujos de trabajo de investigación respiratoria.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar métricas clínicamente relevantes de la función pulmonar que reflejan las evaluaciones pulmonares humanas.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Divide la respuesta pulmonar en compartimentos de vía aérea y tejido, ayudando a identificar las regiones pulmonares afectadas y el mecanismo de acción.
- Caracterización del modelo de enfermedad: Permite comparar modelos sanos y modelos con estrés oxidativo (por ejemplo, ratones expuestos a cloro) para validar la relevancia fisiopatológica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
FOT se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco candidato y las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para indicaciones respiratorias donde la mecánica pulmonar es un biomarcador clave.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cambios en la resistencia y elastancia tras perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante lecturas estandarizadas y automatizadas de la función pulmonar que permiten una evaluación confiable de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos, incluyendo resistencia, elastancia, amortiguamiento tisular y coeficiente de determinación, facilitando el análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al ofrecer biomarcadores traducibles de la función pulmonar que predicen respuestas in vivo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en múltiples proyectos que estudian enfermedades de las vías respiratorias, fibrosis o lesiones pulmonares inducidas por tóxicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las evaluaciones de la función pulmonar.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la calibración del sistema, ventilación estandarizada y adquisición automatizada de datos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al proporcionar puntos finales objetivos y cuantitativos para la hiperreactividad de las vías respiratorias.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles de función pulmonar, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fisiología respiratoria, anestesia y técnicas quirúrgicas para la canulación traqueal en ratones.
- Depende de instrumentación como el sistema flexiVent, nebulizadores y transductores para la monitorización de presión, volumen y signos vitales.
- Necesita una estandarización entre equipos de los perfiles de ventilación, protocolos de desafío y tuberías de análisis de datos.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar la técnica en diferentes cepas de ratones, modelos de enfermedad o paradigmas de exposición.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de una colocación precisa de la cánula, sellos libres de fugas y una profundidad anestésica controlada para evitar esfuerzos ventilatorios que puedan confundir los resultados.
