Name: Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas ( Apis mellifera L.) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a condicionar abejas Apis mellifera a estímulos táctiles y analizar patrones de muestreo antenal mediante captura de movimiento 2D en MATLAB. Este método permite estudiar la cinemática del comportamiento táctil.

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Damos las gracias a Joachim Erber para introducirnos en el paradigma de aprendizaje táctil en las abejas melíferas. Este trabajo fue apoyado por el Cluster de Excelencia 277 CITEC, financiado en el marco de la Iniciativa de Excelencia alemán.

1. Preparación de las abejas <ol><li> Recolectoras de néctar o polen son capturados en el campo ya sea desde un alimentador de sacarosa o directamente desde la entrada de la colmena cuando regresaba de un viaje de forrajeo. Cada abeja es capturado en un vial de vidrio que se cierra con un tapón de espuma y se lleva inmediatamente al laboratorio para su posterior manipulación. </li><li> En el laboratorio, las abejas se capturaron brevemente enfrió en el refrigerador a 4 ° C hasta que muestren signos primera de inmovilidad. </li><li> Cada abeja inmovilizado está montado en un pequeño tubo de metal con cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax y en el abdomen. Se debe tener cuidado de que la trompa y las antenas se mueven libremente. </li><li> Pintar los ojos compuestos y ocelos de la abeja fijo con pintura blanca (por ejemplo, libre de solventes Tipp-Ex) para ocluir la visión. </li><li> Agregar una pequeña gota de cera derretida detrás de la cabeza de la abeja para fijarlo a la cinta entre la cabeza y el tórax para evitar movimientos de la cabeza durante las grabaciones. </li><li> Marque cada abeja con un número en la cinta para una mejor identificación y coloque el tubo con la abeja fijo en un ambiente húmedo para evitar la deshidratación. </li><li> Alimentar cada sola abeja durante 5 segundos con gotitas de una solución de sacarosa al 30% se presentaron con una jeringa y dejar que todas las abejas recuperar durante 30 min antes de comenzar con el protocolo acondicionado táctil. </li></ol> 2. Aire Táctil <ol><li> Antes de acondicionamiento, cada abeja tiene que ser probada por la respuesta de extensión probóscide (PER) a un estímulo de sacarosa al 30% aplicado a las antenas. De esta manera la punta de la trompa tiene que cruzar una línea virtual entre las mandíbulas abiertas. Deseche todas las abejas que no responden con un PER para el estímulo de sacarosa. </li><li> Para el acondicionamiento táctil utilizar un cubo de latón (por ejemplo, 3 x 5 mm) con una superficie lisa o un patrón de grabado, por ejemplo, horizontal o ranuras verticales que forman una rejilla con 150 micras de longitud de onda, como el estímulo condicionado (CS). Fo el estímulo no condicionado (EE.UU.) utilizar una solución de sacarosa al 30% (azúcar doméstico, diluido en agua). </li><li> El cubo de latón (CS) se coloca en un soporte en un micromanipulador (por ejemplo, Märzhäuser MM33) para asegurar el posicionamiento exacto durante el procedimiento de acondicionado. Los EE.UU. se presenta a la abeja con una jeringa llena de una solución de sacarosa al 30%. </li><li> El procedimiento de acondicionamiento se compone de cinco emparejamientos de la estímulo táctil (CS) y solución de sacarosa (EE.UU.), con un intervalo entre ensayos (ITI) de 5 min. Coloque una sola abeja en frente de la micromanipulador con el estímulo táctil montada (CS). Coloque la CS lentamente, de tal manera que la superficie del estímulo táctil es paralela a la cabeza de la abeja (Figura 1 A y B). La distancia entre el animal y el objeto táctil debe estar en el rango del radio antenal de trabajo de la abeja probado, es decir, la abeja debe ser capaz de escanear el estímulo táctil en una posición cómoda wi-ésimo ambas antenas. En el ejemplo mostrado en la Figura 1, la distancia era de 3 mm. Deje que la abeja escanear el estímulo táctil (CS) durante 5 segundos. Después de la primera sec 3, presentan una gotita de la sacarosa al 30% (EE.UU.) solución con una jeringa bajo la proboscis. Utilice la punta de la jeringa para elevar suavemente la probóscide. Estimulación sacarosa bajo la probóscide provocará la incondicionado PER 15. Deje que la abeja a lamer la recompensa sacarosa. Use un cronómetro con una señal de alarma para mantener los intervalos de tiempo exactos durante el acondicionamiento. </li><li> El PER acondicionado se usa como una medida para el éxito de aprendizaje de una abeja. Después de que los emparejamientos primera recompensa, las abejas comienzan a responder a la presentación CS, por extensión, de su trompa, lo que indica que esperan que la recompensa futura. A probóscide completamente extendidas observadas en cualquier momento durante la ventana de tiempo de 3 segundos de presentación del estímulo táctil y antes de la presentación de sacarosa se obtuvo una respuesta positiva. No hay respuesta se cuenta negativa. El occurrence de la PER ha de señalar por el experimentador. El porcentaje de abejas que muestran el PER durante la presentación de CS se traza para cada ensayo. </li></ol> 3. Grabaciones cinemáticos <ol><li> Movimientos antenales de una sola abeja aprovechada se graban con una cámara de vídeo digital con un lente macro adecuada (por ejemplo Basler A602f-2 equipado con TechSpec VZM 200, funciona a 50 fps a través de una conexión de cable de fuego). La cámara se coloca por encima del animal en una vista de arriba hacia abajo (Figura 1 A). En la Figura 1, la resolución espacial de las grabaciones es 0,02 mm / pixel. </li><li> Calibrar la cámara mediante la grabación de imágenes individuales de un tablero de ajedrez 10 x 10 mm con una longitud de arista de 1 mm a partir de diferentes orientaciones en el marco del objetivo de la cámara. La calibración se puede hacer con la caja de la cámara herramienta de calibración 16 Matlab. </li><li> Coloque una sola abeja fijo por debajo del objetivo de la cámara. Presentar el estímulo táctil, fijado a un micromanipulador, Para el animal. Proceder de la misma manera como se describe para el acondicionamiento táctil, y registrar el movimiento antenal mientras que la abeja se analizó el objeto. Es importante que toda la gama de trabajo antenal y el estímulo táctil son visibles. Las opciones de los patrones de estímulos probados y números de ensayo dependerá del diseño experimental. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> El cálculo de la imagen de fondo se realiza en Matlab. En primer lugar, el valor medio de escala de grises en el tiempo tiene que ser calculado para cada píxel. Los objetos estáticos, como la cabeza fija de la abeja y el estímulo táctil, constituirán el fondo de la imagen. Los objetos en movimiento, como las dos antenas, no será parte de los antecedentes. </li><li> Cada fotograma de la grabación de vídeo tiene que ser cargado de forma secuencial, y la diferencia entre la trama actual y la imagen de fondo tiene que ser calculado. El resultado de esta resta hace hincapié en las partes de la imagen que se están moviendo de marco a marco. Identificacióneally, las antenas de las abejas son las únicas áreas de valores distintos de cero (Figura 1 C). </li><li> Para el tratamiento posterior, las dos mayores áreas con valores de los píxeles que no son cero se supone que son las antenas. Para ambas antenas una máscara binaria se ha de generar para cada píxel que contiene un valor de 1, si el píxel pertenece a la antena y el valor 0 de lo contrario. Esta máscara sirve de base para la localización de las puntas antenales más tarde. Para obtener una máscara preliminar para toda la imagen gris del valor de cada píxel de la imagen de diferencia se compara con un umbral predefinido. Dado que nosotros nos encargamos de ruido a finales de este umbral se elige para ser bastante baja. La máscara preliminar entonces todavía lleva dos tipos de errores: En primer lugar, debido al ruido de la imagen pequeñas regiones son todavía parte de la máscara. En segundo lugar, las zonas que pertenecen a la antena podría no ser necesariamente completamente conectada. En estas últimas, se produce si el fondo tiene aproximadamente la misma luminiscencia como la antena. Para eliminar estos artefactos, estándaroperación de procesamiento de imagen morfológica se aplican, es decir, una combinación de erosión y dilatación imagen, confiando en las funciones estándar de Matlab imerode y imdilate respectivamente (ver 17 pp 158-205 para una explicación más detallada). Después de que el proceso de eliminación de ruido de las hipótesis antenas son todavía contenido dentro de la misma máscara. Por lo tanto, como paso siguiente la máscara binaria está agrupado por áreas disjuntas utilizando el estándar de Matlab función bwlabel (ver 17 pp 40-48 para más detalles sobre el algoritmo de segmentación de imágenes). </li><li> El número de píxeles por racimo se cuenta y los dos mayores grupos seleccionados. El centro de gravedad se calcula para distinguir entre la antena izquierda y derecha (Figura 1D). </li><li> La punta antenal para cada antena puede ser definido como el píxel en un grupo con el valor más alto en la dirección proximal a distal (véase la Figura 1D). </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Preparación de las abejas: Recogida y se fijan las abejas debe hacerse rápidamente, con el fin de mantener el nivel de estrés de la baja animal. El estrés tiene un efecto sobre la capacidad de respuesta PER-y, por lo tanto, podría tener un efecto indirecto en el rendimiento de aprendizaje en las abejas 19, 20. El nivel de estrés se puede disminuir mediante la colocación de los viales de vidrio con las abejas directamente en hielo inmediatamente después de la recolección para inmovilizarlos rá...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Recolectoras de polen, Apis mellifera L. </td><td></td><td></td><td> Urticaria privadas </td></tr><tr><td> Viales de vidrio (22 x 45 mm) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> X655.1 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de latón, 10 x 30 mm </td><td></td><td></td><td> De producción propia </td></tr><tr><td> Cubo de latón, 3 x 5 mm </td><td></td><td></td><td> De producción propia </td></tr><tr><td> Tipp-Ex (sin disolventes) </td><td> Tipp-Ex GmbH &amp; Co KG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de sacarosa (30%) </td><td></td><td></td><td> Suger doméstico diluido en agua </td></tr><tr><td> Etanol (70%) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 9065,3 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Jeringa (1 ml) y la aguja (0,6 x 25) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 59,1 </td><td></td></tr><tr><td> Cronómetro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> L423.1 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Märzhäuser MM33 </td><td> 00-42-101-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara de vídeo digital </td><td> Basler A602f-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lente macro para cámaras </td><td> TechSpec VZM 200 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matlab R2009b </td><td> The MathWorks </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aire táctil y análisis de movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; apis mellifera</em&gt; l.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Las abejas de miel (Apis mellifera L.) son insectos eusociales y bien conocido por su compleja división del trabajo y la capacidad de aprendizaje asociativo 1, 2. Las abejas obreras pasar la primera mitad de su vida en el interior de la colmena oscura, donde se está cuidando las larvas o la construcción de la regular peines hexagonales para la alimentación (por ejemplo polen o néctar) y cría 3. Las antenas son antenas multi-sensoriales extraordinarias y desempeñan un papel fundamental en diversas tareas táctiles mediadas por 4, incluyendo la construcción de la colmena 5 y reconocimiento de patrones 6. Más tarde en la vida, cada abeja sale de la colmena para buscar comida. A continuación, una abeja tiene que aprender a discriminar fuentes rentables de alimentos, memorizar su ubicación, y la comunicará a sus compañeros de nido 7. Las abejas utilizan diferentes señales florales como colores u olores 7, 8, sino también señales táctiles de la superficie del pétalo 9 para formar memorias multisensoriales de la fuente de alimento. En virtud de laboratorio conditions, las abejas pueden ser entrenados en un paradigma de aprendizaje apetitivo para discriminar las características táctiles de objetos, tales como bordes o surcos con sus antenas 10, 11, 12, 13. Este paradigma de aprendizaje está estrechamente relacionada con el condicionamiento clásico de la respuesta olfativa de extensión proboscis (PER) en abejas enjaezados 14. La ventaja del modelo de aprendizaje táctil en el laboratorio es la posibilidad de combinar los experimentos de comportamiento en el aprendizaje con diversas mediciones fisiológicas, incluyendo el análisis del patrón de movimiento antenal.

En el siguiente experimento estudiamos cómo afecta la conducta de aprendizaje táctil muestreo antenal en las abejas melíferas. Para ello, se monitoreó el movimiento de la punta antenal en abejas naïve y acondicionado antes y durante la presentación de un estímulo táctil. En primer lugar, el movimiento espontáneo antenal de un grupo de recolectoras de polen (N = 42) fue registrada por 1 min. Una media de las abejas (N = 21) se acondicionó a continuación, por el emparejamiento de cinco veces u...

En este protocolo se muestra cómo acondicionar aprovechado las abejas a los estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento 2D para analizar la cinemática de escala fina patrón de muestreo antenal.

Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Los objetivos generales de este procedimiento son mostrar cómo condicionar a las abejas melíferas a estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento en 2D para analizar la cinemática de escala fina y 10 patrones de muestreo. Al principio, el procedimiento requiere capturar abejas voladoras libres frente a su colmena. El segundo paso es enganchar a las abejas en tubos de metal y ocluir sus ojos con pintura blanca.A continuación, las abejas se entrenan para recibir estímulos táctiles utilizando el procedimiento clásico de condicionamiento. El paso final es grabar el movimiento de la antena de la abeja condicionada con una cámara de video digital. En última instancia, la captura de movimiento 2D en MATLAB se utiliza para analizar los cambios en el comportamiento del movimiento de una antena en abejas melíferas según los paradigmas de aprendizaje táctil asociativo y no asociativo.Este método se puede utilizar para estudiar la discriminación táctil y la percepción en varias especies alterables. Puede diferenciar los cambios debidos al aprendizaje táctil no asociativo de los cambios que ocurren a partir del aprendizaje asociativo, como durante el condicionamiento. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las abejas deben manipularse con mucho cuidado y el momento del procedimiento de acondicionamiento táctil es crítico.El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la detección táctil activa. Utiliza un comportamiento reflejo natural como comportamiento de reporte, lo que nos permite saber si el animal puede o no discriminar entre dos estímulos táctiles. Para empezar, recoge las abejas directamente desde la entrada de la colmena.Capture cada abeja en un frasco de vidrio cerrado con un tapón de espuma y llévelo inmediatamente al laboratorio para su posterior manipulación en el laboratorio. Brevemente, enfríe las abejas en un refrigerador a cuatro grados centígrados hasta que comiencen a mostrar signos de inmovilidad. Primero, inmovilice cada abeja en un tubo de metal.Coloque cinta adhesiva alrededor de la cabeza y el tórax y sobre el abdomen. Confirme que el sonda y una antena se pueden mover libremente para ocluir la visión de la abeja. Pinta los ojos compuestos y el selli con pintura blanca.Coloque una pequeña gota de cera derretida entre la cabeza y la cinta para evitar que la cabeza se mueva. Durante las grabaciones. Para facilitar la identificación, marque la cinta de cada abeja con un número y coloque el tubo en una atmósfera húmeda para evitar la deshidratación.Por último, use una jeringa llena de solución de sacarosa al 30% para alimentar a cada abeja durante cinco segundos y dejar que se recuperen durante 30 minutos. Antes de comenzar el protocolo de acondicionamiento táctil, antes del acondicionamiento, pruebe cada B para la respuesta de extensión psis o PER. Para ello, aplica un estímulo de sacarosa al 30% en las antenas para una correcta respuesta.La punta del psis tiene que cruzar una línea virtual entre las mandíbulas abiertas. Solo se utilizan abejas con un PER correcto para el estudio. Para el acondicionamiento táctil, se utilizan estructuras de superficie metálica como estímulo condicionado o cs.Su superficie puede ser lisa o acanalada para crear una textura diferente. El estímulo incondicionado o US es una solución de sacarosa al 30%. Coloque el cubo de latón en un soporte en un micro manipulador.Esto permitirá un posicionamiento exacto durante el procedimiento de acondicionamiento. Una vez montado el estímulo táctil, coloque una abeja delante del micro manipulador. A continuación, coloque lentamente las C de modo que la superficie del estímulo táctil quede paralela a la cabeza de la abeja.La abeja debe ser capaz de escanear el estímulo táctil en una posición cómoda con ambas antenas. Para comenzar el procedimiento de acondicionamiento, permita que la cuenta escanee el estímulo táctil durante cinco segundos. Después de los primeros tres segundos, use una jeringa para presentar una gota de la solución de sacarosa al 30% debajo del probos.Utilice la punta de la jeringa para levantar suavemente el sono. Esta estimulación debe provocar el PER incondicionado. Permita que la abeja lama la sacarosa.Recompensa por un segundo. Continúe con el procedimiento de acondicionamiento hasta que la abeja reciba cinco emparejamientos. Después de los primeros emparejamientos recompensados, las abejas deben comenzar a responder a la presentación de CS por extensión de su psis, lo que indica que esperan la próxima recompensa.Una psis completamente extendida observada en cualquier momento durante los primeros tres segundos de presentación del estímulo táctil antes de la presentación de sacarosa se califica como una respuesta positiva. Finalmente, se genera una curva de aprendizaje para un grupo de abejas. Para ello, se representa gráficamente el porcentaje de abejas que muestran el PER durante la presentación de CS para cada ensayo.Después del acondicionamiento, se utiliza una cámara de video digital con una lente macro adecuada para registrar los movimientos de la antena. Aquí utilizamos una cámara basler a 602 F, equipada con una lente VZM 200 con especificaciones técnicas que funciona a 50 fotogramas por segundo a través de una conexión de cable de fuego, ajustamos la cámara de manera que la abeja enjaezada y el estímulo táctil sean visibles. A continuación, calibre la cámara tomando fotografías individuales de un tablero de ajedrez calibrado desde diferentes orientaciones.Utilice un software especializado con una herramienta de calibración de la cámara para analizar las imágenes. Una vez calibrado, coloque una sola B fija debajo de la lente de la cámara y presente el estímulo táctil. Como se mostró anteriormente.Registre el movimiento del sello mientras la abeja está escaneando el objeto. Una vez que se han recopilado los datos, se utiliza MATLAB para definir primero el fondo de la imagen, calcular el valor medio de la escala de grises a lo largo del tiempo para cada píxel. Los objetos estáticos como la cabeza fija de la abeja y el estímulo táctil constituirán el fondo de la imagen restando el fondo de la imagen de cada fotograma, las partes móviles del vídeo.Idealmente, las antenas de la abeja están aisladas como las únicas áreas con valores distintos de cero para su posterior procesamiento. Se supone que las dos áreas más grandes con valores de píxel distintos de cero son las antenas an. Se crea una máscara para localizar las puntas de las antenas y para toda la imagen para reducir la cantidad de error.Una combinación de herramientas de erosión y dilatación de la imagen se aplica una vez que estas técnicas han reducido el nivel de ruido. Se utiliza una función de máscara binaria para agrupar las áreas inconexas. El centro de gravedad se calcula para los dos mayores de estos cúmulos con el fin de distinguir entre la antena izquierda y la derecha.Aquí, están etiquetados con colores rojos y verdes. Finalmente, la punta de la antena para cada antena se puede definir como el píxel en un clúster con el valor más alto en la dirección proximal a distal, se crea un histograma bidimensional que muestra la distribución espacial de la punta mostrada. Aquí está la curva de aprendizaje del condicionamiento táctil PER en el forjador de polen.El porcentaje de respuestas positivas después del primer emparejamiento fue significativamente mayor en comparación con el comportamiento espontáneo, y la curva de aprendizaje muestra saturación después de la tercera recompensa. En este ejemplo, el movimiento de la punta anal tanto en el grupo condicionado como en el ingenuo se registró durante un minuto en presencia o ausencia del estímulo táctil observado. Aquí se presentan movimientos espontáneos y de túnel antes de la presentación del estímulo.La absa muestra la posición lateral de la punta del túnel, mientras que la ordenada muestra la posición distal. La escala de colores indica el porcentaje de tiempo que la punta anin pasó en un lugar determinado. El amarillo indica que las ubicaciones muy frecuentes, las ubicaciones rojas, menos frecuentes y negras están fuera del alcance.Estos datos muestran que tanto el grupo como el condicionado cambiaron su patrón de movimiento antal en presencia de un estímulo táctil en comparación con su comportamiento espontáneo. Tenga en cuenta que la región amarilla rectangular cerca de la superficie del estímulo indica que la punta del talón de la hormiga pasó mucho tiempo muestreando la superficie. Las abejas del grupo condicionado pasaron significativamente más tiempo con la punta de su antena en el área del estímulo que las abejas ingenuas.Siguiendo este procedimiento, se pueden encontrar métodos electrofisiológicos y farmacológicos para responder preguntas adicionales como, ¿cuál es la base neurofisiológica para el comportamiento táctil activo en las abejas melíferas después de su desarrollo? Esta técnica de condicionamiento táctil allanó el camino para que los investigadores en el campo de la detección activa del tacto exploraran varios aspectos de la discriminación de estímulos táctiles, pero también del aprendizaje táctil y la memoria en Alpha Pots. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar la búsqueda táctil activa y el muestreo de movimientos e insectos.Tenga en cuenta que el análisis de movimiento se puede ampliar a un análisis tridimensional si se agrega al menos una cámara adicional en sincronía con la primera.

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