Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato

El objetivo general de este procedimiento es activar neuronas somatosensoriales individuales en larvas de pez cebra. Esto se logra preparando primero un cable óptico y conectándolo al láser azul A-D-P-S-S. El segundo paso es inyectar el transgén en uno o dos embriones en etapa celular.

A continuación, cribar embriones de grasa que expresan tomate C-H-E-F-T-D en neuronas somatosensoriales y montarlos en inus. El paso final es emitir un breve pulso de luz azul para la activación de una sola neurona y registrar el comportamiento resultante. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes que utilizan la opción dos de raíz de canal es que este enfoque podría usarse para provocar respuestas conductuales de neuronas individuales activadas hasta al menos cuatro días después de la hospitalización.

Sin embargo, este método se está utilizando para proporcionar información sobre la función de neuronas somatosensoriales específicas en las larvas de pez cebra. Este enfoque también podría adaptarse para estudiar los comportamientos provocados por cualquier población neuronal de pez cebra, como las neuronas internas o las neuronas motoras. Este enfoque genético podría utilizarse para activar neuronas específicas in vivo, caracterizar el desarrollo funcional, evaluar los efectos de las mutaciones o el bloqueo fenomenológico de proteínas específicas en el comportamiento y mapear las redes neuronales posteriores que conducen a distintas respuestas conductuales.

Para comenzar este procedimiento, cree una unidad de almacenamiento para el cable óptico derritiendo el cuello cónico de un vidrio. Pipetea la pasta sobre un toque y un quemador para hacer un ángulo de 150 grados. A continuación, con un cortador de alambre o una cuchilla de afeitar, corte con cuidado el cable óptico en dos piezas.

Cada pieza debe tener un extremo expuesto y un extremo con un adaptador de PC FC. A continuación, pele el cable óptico hasta el revestimiento quitando la cubierta de fibra, reforzando las fibras y el revestimiento desde 5,0 centímetros del extremo cortado del cable. A continuación, inserte el cable óptico en la pipeta de pasta preparada.

Asegúrese de que el cable pueda entrar y salir fácilmente de la punta de la pipeta con un cortador de vidrio de diamante o una pinza de punta fina. Corta la fibra de vidrio y rompe el extremo para crear un corte limpio en el extremo de la fibra. A continuación, retraiga el cable óptico en la pipeta para pasta.

A continuación, coloque el cable óptico en la pipeta de pasta utilizando un micro manipulador bajo el microscopio manualmente COATE 24 a 48 embriones HPF utilizando un par de pinzas después, anestesiar las larvas utilizando 0.02%trica utilizando un microscopio de disección fluorescente. Identificar las larvas con expresión de neurona de Ron Beard o neurona trigémino Los embriones con expresión dispersa en células fácilmente identificables son óptimos, pero las neuronas individuales se seleccionarán para su activación con un cable de fibra óptica, por lo que es aceptable un amplio rango de densidad de expresión. Transfiera las larvas a un nuevo plato con agua fresca de embrión azul PTU.

Almacenar los embriones a 28,5 grados centígrados en la oscuridad hasta la etapa experimental deseada. En esta sección, prepare agua baja en maltasa y doble destilada al 1,5% y almacene en un bloque de calor a 42 grados centígrados para evitar que se solidifique. Con una pipeta de vidrio para pasta, transfiera una de las larvas de precribado a un tubo de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 % con la menor cantidad posible de agua azul para embriones.

Luego transfiera la larva en una gota de agarosa a una pequeña placa de Petri. Bajo un microscopio de disección, coloque el lado dorsal de la lava hacia arriba cuando el aros se solidifique. Usa una hoja de afeitar delgada para cortar los aros de ambos lados de la lava.

Llene el área que rodea el aros con agua azul embrionaria. A continuación, haz dos cortes diagonales a ambos lados de la yema, teniendo cuidado de no cortar la lava. Después, retira el agrow del tronco y de la cola de la lava.

Ahora monte la cámara de alta velocidad en el telescopio de disección y conecte la cámara al ordenador. Luego encienda la computadora y la cámara de alta velocidad. Abra el software de imágenes de video y ajuste la configuración de la cámara.

A continuación, conecte el cable óptico, el láser y el estimulador. A continuación, encienda el estimulador y ajústelo a un máximo de cinco voltios y una duración del pulso de cinco milisegundos. A continuación, encienda el láser.

A continuación, utilice el microscopio de disección fluorescente para colocar la punta del cable óptico cerca de un cuerpo de célula neuronal con expresión de tomate C-H-E-F-T-D. Emite un pulso de luz azul para activar la neurona sensorial. A continuación, grabe las respuestas con una cámara de alta velocidad.

Ajuste a 500 o 1000 fotogramas por segundo, y repita el experimento con al menos un minuto entre activaciones para evitar la habituación, para liberar la lava de la parte anterior, el Aris con pinzas, y tenga cuidado de no inre el animal. Luego transfiéralo al agua fresca del embrión azul. Se puede permitir que los animales se desarrollen más y se puede repetir el procedimiento en etapas más avanzadas.

El embrión también podría ser remontado para obtener imágenes confocales de alta resolución de la célula activada con el fin de correlacionar el comportamiento con la estructura celular. La lava del pez cebra diagramada aquí está parcialmente montada en Aris con un 1,5% de malta baja representada por las líneas discontinuas que rodean su porción rostral. Una neurona del trigémino y una neurona de la barba de Rohan se representan en células de boca roja delineadas por las líneas guionas en la ilustración.

Aquí hay una película que muestra que la activación de una sola neurona de la barba de Rohan que expresa tomate C-H-E-F-T-D en una lava de aproximadamente 35 HPF provoca una respuesta conductual. Esta película muestra la activación de las neuronas de la barba de Rohan que expresan el tomate C-H-E-F-T-D en una lava de 60 HPF, y esta película muestra la activación de las neuronas de la barba de Rohan de la expresión del tomate C-H-E-F-T-D en una lava de cuatro DPF una vez dominada. Este enfoque genético se puede realizar en menos de una hora.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo activar las neuronas individuales y las larvas de peces Libra en varios puntos de tiempo. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones de seguridad adecuadas al realizar este procedimiento.