Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

El objetivo general de este procedimiento es aislar los adipocitos primarios e inducir su diferenciación en cultivo a células de color beige o brillantes. El primer paso es diseccionar el tejido adiposo de ratones. A continuación, el tejido se digiere con colagenasa.

Una vez que se aísla la fracción vascular del estroma, se colocan las células. El paso final es inducir la diferenciación de las células a células de color beige o brillantes. En última instancia, se utilizan métodos analíticos para mostrar una mayor expresión de genes específicos de adipocitos marrones.

Este método puede ayudar a abordar las preguntas clave en los tejidos adiposos marrones, que es qué mecanismo molecular regula el desarrollo de células brillantes o be. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la obesidad y otras enfermedades relacionadas con el estilo de vida. Dado que la manipulación del tejido adiposo marrón en humanos puede utilizarse como una posible intervención terapéutica, el primer paso es preparar el medio de digestión.

Luego, después de la eutanasia, se extirpa el tejido adiposo. Primero, aísle el tejido adiposo marrón interescapular o murciélago cortando a lo largo de la espalda del animal hasta el cuello. Dos lóbulos de tejido adiposo marrón se pueden encontrar justo debajo de la piel entre los hombros.

A continuación, retira con cuidado la fina capa de grasa blanca que cubre el murciélago. Una vez aislado, coloque el tejido directamente en el PBS limpio. El tejido adiposo blanco inguinal o wat se encuentra directamente debajo de la piel en ambos lados.

Se extiende hacia el interior de los muslos y hacia los testículos. Retire el pañuelo y colóquelo en PBS limpio. Los siguientes pasos se aplican tanto a las muestras de murciélago como a las húmedas.

Elimine rápidamente toda la contaminación, como el cabello, el músculo esquelético y el tejido conectivo de las secciones de tejido. A continuación, seque el pañuelo rápidamente sobre una toalla de papel para evitar la dilución del medio de disección con PBS y colóquelo en un plato seco. Agregue el medio de digestión y pique el tejido en trozos pequeños.

A continuación, transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga el resto del medio de digestión. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados con agitación constante durante 40 a 50 minutos para digerir. Revise cada 10 a 15 minutos para asegurarse de que la digestión vaya bien y para evitar la digestión excesiva.

Después de que el tejido esté bien digerido, detenga la digestión. Al agregar cinco mililitros de medio completo y mezclar bien, las células deben ser casi completamente homogéneas. A continuación, centrifugar la muestra a 700 veces G durante 10 minutos.

La fracción vascular estromal ahora debería ser visible como una bolita pardusca en la parte inferior del tubo que aspira la capa de adipocitos maduros aceitosos en la parte superior y la mayor parte de la capa líquida. A continuación, disuelva el pellet en 10 mililitros, complete el medio y mezcle bien. Una vez mezclado, coloque un colador de celdas sobre un nuevo tubo de 50 mililitros y filtre la suspensión de celdas.

Transfiera la suspensión celular filtrada a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 700 veces G durante 10 minutos. A continuación, aspire el medio y vuelva a suspender el pellet. En 10 mililitros de medio completo, pipetear y mezclar bien las celdas según sea necesario.

Por lo general, cinco ratones producirán dos placas de 10 centímetros de wat inguinal y una placa de murciélago. Una o dos horas después del emplatado. Aspire el lavado medio con PBS dos veces y agregue medio fresco.

Este paso es importante, ya que puede eliminar los glóbulos rojos, las células inmunitarias y otros contaminantes. Los medios de mantenimiento e inducción se preparan con anticipación. Una vez que los adipocitos primarios hayan crecido hasta un 95 a 97% de confluencia, cambie el medio completo regular por el medio de inducción.

Después de 48 horas, cambie el medio a un medio de mantenimiento que contenga 0,5 micromolares de RO glitazona. Después de 48 horas adicionales, cambie a un medio de mantenimiento fresco que contenga un micromolar de glitazona RO durante dos o tres días adicionales. Las gotitas aparecerán alrededor de tres o cuatro días después de la inducción, como se ve aquí, seis a siete días después de agregar por primera vez el medio de inducción.

Las células deben estar completamente diferenciadas de células grasas maduras y deben estar llenas de gotas de aceite. Las células ahora se pueden recolectar y usar para análisis posteriores. El pardeamiento de los adipocitos primarios se puede evaluar midiendo el ARNm de genes específicos o selectivos de grasa parda mediante Q-R-T-P-C-R, como se ve aquí.

RO glitazona, inducida de forma robusta por el tratamiento con FORSKOLINA con la expresión de ARNm de UCP uno, designado aquí como MP A cíclico. Aumentó aún más la expresión de UCP uno inducida por glitazona RO. Cdia. Otro gen selectivo de la grasa parda también se incrementó de manera robusta de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con glitazona RO también aumentó la expresión de FABP cuatro y el marcador adipogénico para la grasa parda y blanca.

Este efecto de pardeamiento no se debió simplemente a un aumento de la adipogénesis per se. Dado que la inducción de la expresión de UCP one y CDIA seguía siendo significativa, incluso si los niveles de ARNm se normalizaban a los de FABP 4, este Western blot confirma el aumento del nivel de proteína de UCP uno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar preadipocitos y cómo diferenciar estas células en células de color beige o brillantes en cultivo.