Name: Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a preparar liposomas gigantes unilamelares mediante electroformación para estudios de electrofisiología con parche. Este método preserva la integridad funcional de proteínas de membrana en neurociencia.

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Damos las gracias a Bryan Venema y Eric Martinson para construir el aparato electroformation. Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (R01GM100718 a SEG) y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY017564 a SEG).

1. La deposición de lípidos a partir de disolventes orgánicos: Protocolo Clásica <ol><li> Eliminar los lípidos de almacenamiento a -20 ° C o -80 ° C; se calentó a TA Precaución:. Lípidos son extremadamente higroscópicos, y muchos son sensibles al oxígeno. Cubra lípidos en argón seco o nitrógeno gaseoso y en todos los pasos minimizar la exposición al aire. </li><li> Si es necesario, suspender los lípidos en cloroformo o ciclohexano en mg / ml 1-10, tenga en cuenta que las concentraciones indicadas del fabricante suelen nominal sólo PRECAUCIÓN: Use guantes y otros equipos de protección personal cuando se utilizan disolventes orgánicos.. Retire el PPE rápidamente si solvente se derramó sobre ellos, como la mayoría de los materiales están siendo permeable a estos disolventes y sólo proporcionan una protección temporal. </li><li> Limpie ambos lados de dos x 25 mm ITO portaobjetos de vidrio recubiertas con 37,5 etanol </li><li> Mezclar los lípidos para conseguir las proporciones molares deseadas. Por cada 1 cm 2 de área de ITO se desliza a recubrir con el labioid, mix ~ 15-20 g de lípidos. Por ejemplo, si ambos diapositivas 25 x 37,5 mm iban a ser totalmente revestido, que se utilizaría normalmente 30 l de 10 mg / ml de mezcla de lípidos Nota:. Añadir 0,1% en moles Rojo Texas-DPPE para formación de imágenes fluorescentes, y ver a continuación para precauciones acerca colorantes fluorescentes. </li><li> Verifique que el lado recubierto ITO de las placas de vidrio se enfrenta por la medición de la resistencia de la superficie con un polímetro o multímetro. </li><li> Aspirar los lípidos en un resistente a los disolventes jeringa Precaución:. No hay colas o plástico, excepto PTFE, debe ponerse en contacto con el disolvente orgánico. </li><li> Con la aguja de la jeringa sin llegar a tocar la superficie de ITO, aplicar lentamente el lípido mover la aguja hacia atrás y adelante a través de la corredera. Cubra la superficie de la forma más uniforme, en busca de un &quot;arco iris brillo&quot; en la superficie del vidrio. </li><li> Coloque las diapositivas rápidamente bajo &lt;1 Torr (1 mm Hg) de vacío durante 0,5-1 horas para eliminar cualquier traza de disolvente. Suelte vacío con gas inerte. </li><li> Aplique una junta de silicona, con uncapa fina de grasa de vacío de silicona en ambos lados. Deje al menos 5 mm de diapositivas descubierta expuesta en un extremo de la corredera. </li><li> Siga en la sección 4. </li></ol> 2. Preparación de liposomas pequeños para la deshidratación controlada <ol><li> Preparar la mezcla de lípidos que en los pasos 1.1 a 1.4. </li><li> Secar los lípidos usando una corriente de gas argón o nitrógeno en un tubo de cultivo de 10-15 mm de diámetro. Para pequeñas cantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, la película resultante puede ser hidratado directamente después de colocarla bajo vacío durante 0,5-1 horas para eliminar el disolvente residual; continúe en el paso 2.5. Grandes cantidades de lípidos tienden a atrapar disolventes orgánicos en un gel espeso, incluso bajo vacío, y están mejor preparados por liofilización; consulte los pasos 2.3-4. </li><li> Suspender la película lipídica seca en ciclohexano, cubierta con argón y sellado con un tapón, colocar el tubo en un bloque frío y se congelan a -80 ° C durante 1 hora mínimo. </li><li> Coloque el bloque frío y la muestra de lípidos en un sistema de vacíocapaz de alcanzar los 100 mTorr. Aplicar un vacío, sino que va a &quot;pararse&quot; en alrededor de 1 Torr tan sublimes solventes libres. Una vez disolvente se elimina por completo (aproximadamente 1 hora) de vacío caerá por debajo de este nivel. Liberar el vacío con gas inerte y sellar el tubo o hidrato inmediatamente. </li><li> Mientras que los lípidos están bajo vacío, tampón de hidratación degas usando vacío y rociado 15-17. </li><li> Hidratar los lípidos usando tampón desgasificado a una concentración final de 1-10 mg / ml. Permitir que los lípidos para hidratar lentamente. Después de 30 min-1 hora, remolino para romper los grumos que quedan. Espere un 0,5-1 horas más para permitir la hidratación completa. Utilice un osmoticant, tal como sorbitol o sacarosa hasta 200 mM, para prevenir la deshidratación completa en los pasos siguientes. </li><li> Prepare liposomas 100-200 nm de diámetro por extrusión. Ver protocolo de extrusión del fabricante para obtener más información. Tenga en cuenta que el buffer debe tener menos de ~ 25 mM fuerza iónica, o protocolos de voltaje electroformation especiales serán necesarias en la Sección 4. </li></ol> 3.La deposición de lípidos por deshidratación controlada de liposomas pequeños <ol><li> Precaución: Nuestro protocolo requiere lípidos para ser colocados en equilibrio vapor con soluciones salinas saturadas para muchas horas. Recomendamos realizar el protocolo en una atmósfera de gas inerte, con una caja de guantes o recinto similar. </li><li> Precaución: Si la preparación de muestras que contienen proteínas, evitar la deshidratación completa. Hidratar la atmósfera en un lugar cerrado con un vaso de agua tibia, o un humidificador basado en ultrasonidos. Utilice un higrómetro para asegurarse de que existe al menos 30% de humedad relativa. Usa sorbitol o sacarosa en el pequeño tampón de liposoma como una precaución adicional para prevenir la deshidratación total. </li><li> Preparar una solución de sal saturada de humedad relativa apropiada. Humedad del objetivo depende de la osmolaridad de la preparación de vesículas. Para las preparaciones con osmolaridad fisiológica, utilice el 30-45% de humedad relativa, mientras que las preparaciones de vesículas de baja osmolaridad pueden ser adecuadamente deshidratados enequilibrio con 75-90% de humedad relativa (Véase también la Tabla 1). </li><li> Ponga la solución saturada de sal y el exceso de sal en un recipiente herméticamente sellable con un estante interior. Contenedores de alimentos comerciales para yogurt y granola funcionan muy bien. Vuelva a colocar el estante después del llenado, y asegúrese de que el fluido es de 5-10 mm por debajo de la plataforma. </li><li> Limpie portaobjetos recubiertos de ITO como en la Sección 1. Utilice el multímetro para determinar cuál es el lado conductor, y etiquetar el lado no conductor con el nombre de la muestra. </li><li> Engrase ligeramente ambos lados de la (grado USP VI) junta de silicona (s) con uno o múltiples agujeros. </li><li> Coloque el lado conductor desliza en el banco, y aplicar la junta de silicona (s) a cada diapositiva a la que se aplicará lípidos, asegurándose de que hay por lo menos 5 mm de diapositiva expuesta en un extremo a conectar al aparato electroformation. Alise la junta para asegurar un buen sellado. </li><li> Se diluye la preparación de vesículas en un tampón isotónico bajo contenido de sal a ~ 1-2 mg / ml. Nos parece que el aumento de concentrciones producen resultados pobres. </li><li> Aplique grasa a la diapositiva en gotas l 1-10. Las gotas más pequeñas generalmente producen mejores resultados. </li><li> Posicionar el cursor en la plataforma interior por encima de la solución saturada de sal y sellar el recipiente herméticamente. Dejar a temperatura ambiente durante 3 horas a O / N. El recipiente se puede colocar a 4 ° C, pero tenga en cuenta que para algunas sales, la humedad relativa depende fuertemente de la temperatura, y que el frío aumentará el tiempo de equilibración. </li><li> La película resultante puede tener un arco iris ligero brillo a él, pero en cualquier caso debe aparecer casi desecado. Soluciones de partida muy osmóticos pueden ser imposibles de secar completamente a una película de lípidos, lo que no afectará negativamente a los resultados. </li></ol> 4. Electroformation de liposomas gigantes <ol><li> Películas de lípidos, especialmente los formados a partir de liposomas deshidratados, se desencajan fácilmente. Cuidadosamente hidrato de cada pocillo mediante la colocación de un G aguja de la jeringa 27 en el borde de la junta y aplicar lentamente tampón. Buffers puedeincluyen agua, ≤ 200 mM de sacarosa, ≤ 1 M sorbitol y ≤ 5 mM HEPES. Solución de sal de más de 10 mm puede requerir protocolos de voltaje electroformation alternos. Sobrellenado de cada junta y de ~ 10%. </li><li> Nota: una vez que los lípidos se hidratan, proceder rápidamente a través de los pasos restantes, ya que las películas de lípidos comienzan a exfoliar inmediatamente. Rendimiento y tamaño se maximizan si electroformation comienza puntualmente. </li><li> En un movimiento suave, aplique una segunda diapositiva, cara conductora ITO en, en la parte superior de la junta. Asegúrese de tener al menos 5 mm de voladizo fuera del área de empaque y frente a la primera proyección. Presione suavemente para asegurar un buen sellado. </li><li> Limpie los dos voladizos utilizan etanol y verificar que los lados que se enfrenta la junta son conductores con su multímetro. </li><li> La cámara se puede asegurar aún más con parafilm o ligeras pinzas de resorte de tensión si se desea. </li><li> Conectar la cámara de electroformation a una fuente de tensión, asegurando de aluminio o de cobre bares, &quot;EMI Gasket espuma &quot;, o cinta conductora-adhesivo a las superficies conductoras de las dos correderas. Utilizamos espuma junta EMI. Planes para una plantilla y la abrazadera se muestran en la Figura 5. </li><li> Compruebe que no hay cortocircuito eléctrico entre los contactos, y que los contactos se conectan adecuadamente a las superficies de ITO, usando el multímetro. </li><li> Se calienta la cámara de 10 ° C por encima de la temperatura de fusión más alta de cualquiera de los lípidos presentes, por ejemplo, para DPPC, calentar a 52 ° C, como mínimo, 10 ° C por encima de la temperatura de fusión de cadena de 42 ° C. </li><li> Para amortiguadores bajos en sal, aplique una onda sinusoidal 10 Hz, ~ 0.7 V rms para cada hueco milímetros entre las dos superficies revestidas de ITO, de 60 a 90 min. Para buffers de sal, otros protocolos de tensión se deben utilizar (ver referencias). </li></ol> 5. Imágenes y solución de problemas <ol><li> Imagen del liposoma utilizando un microscopio invertido equipado con un cubo filtro para rodamina o colorantes rojos de Texas. El liposoma debe ser esférica,predominantemente unilamelar por ojo, y libre de defectos tales como &quot;cuerdas&quot; que cuelgan del liposoma. </li><li> Si los liposomas son demasiado pequeños, utilizar menos lípidos. </li><li> Si hay muchos defectos o unos liposomas, esto puede ser debido a los lípidos de gel-fase. Considere la posibilidad de elevar la temperatura electroformation. </li><li> Si pocos o ningún liposomas gigantes formaron en absoluto de pequeños liposomas deshidratados, reducir la fuerza osmótica de la memoria intermedia de liposoma, o aumentar la fuerza osmótica de la memoria intermedia de electroformation. Una corriente de entrada de tampón en la solución tampón intersticial concentrada puede provocar la deslaminación de la película de lípido depositada. </li><li> Si el rendimiento de la vesícula, la calidad o el tamaño son pobres, y que incluyen sales o tampones de pH en los electroformation o liposoma buffers, tenga en cuenta los protocolos de voltaje electroformation alternativas. Por ejemplo, Pott, et al. 11, recomendar un protocolo de tres etapas utilizando una onda sinusoidal de 500 Hz, el aumento de la tensión de 50-1,300 Vpp / m durante 30 minutos, manteniendo durante 90 min, lan la disminución de la frecuencia de 50 Hz en 30-60 min. Platino o titanio electrodos pueden ser necesarios en este caso, pero esto no alterarán sustancialmente el protocolo. </li></ol>

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<li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Electroformation de liposomas gigantes se ha convertido en una técnica flexible, compatible con diversos lípidos, preparaciones y tampones. El control cuidadoso del proceso de deposición de lípidos es más crítico para el éxito. Hemos presentado herramientas simples para hacer deposición controlada de los lípidos de las pequeñas preparaciones de liposomas un proceso sencillo. La humedad relativa es crítica a la deshidratación adecuada de los liposomas iniciales, y el valor óptimo variará con la concentración inicial de s...

Liposomas gigantes (a menudo llamado vesículas unilamelares gigantes, o Guvs) principalmente se han utilizado para estudiar la física y la química física de bicapas de lípidos, incluyendo los estudios de deformación bicapa, la coexistencia fase lateral (&quot;balsas&quot;), la fusión de membranas, etc 1-4. Tienen una estructura groseramente similar a la célula: cáscara esférica de la membrana que rodea un interior acuoso que puede ser fácilmente hecho diferente que el tampón acuoso circundante. Ellos son, por definición, ≈ 1-100 micras de diámetro, por lo que se pueden obtener imágenes usando una variedad de enfoques de microscopía de luz. Pueden ser hechos tensa el uso de gradientes osmóticos o tensión aplicada mecánicamente, de modo que mientras que generalmente suave, sus propiedades pueden ser manipuladas para un fácil manejo. En particular, el control de la &quot;rigidez&quot; del liposoma hace que sea fácil para formar parches &quot;liposomas adjuntos&quot; o extirpado para electrofisiología. En el pasado, la reconstitución canal de iones se llevó a cabo en gran medida en los lípidos plana bilayers. Ahora, la capacidad para formar parches de liposomas gigantes y utilizar la considerable carcaj de herramientas desarrolladas para electrofisiología convencional (microscopía de fluorescencia, micropipeta de aspiración, la perfusión rápida y control de la temperatura, etc) hace que los liposomas gigantes cada vez más atractivo para los estudios de reconstitución de 5,6. Liposomas gigantes han hecho muchas estrategias. De hecho, los liposomas gigantes se forman espontáneamente por un proceso de hinchamiento cuando una película de lípido seca se rehidrata 4,7,8. El deseo de preparar más rápidamente más grande, liposomas más uniformes llevó a los investigadores a otros enfoques, entre los que electroformation 1,9. Electroformation también se basa en la hidratación de una película lipídica seca, pero acelera el proceso a través de la aplicación de un campo eléctrico oscilante a través de la película de lípido. El campo se aplica a través de dos electrodos, ya sea en alambres de platino o de indio-estaño-óxido (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertos, separados por el agua otampón y en la que los lípidos se depositan. Al acelerar la hinchazón de los liposomas, se logra un mayor rendimiento de los liposomas más grandes. Por lo tanto, electroformation ha convertido en el método por defecto para producir liposomas gigantes 4. El mecanismo de electroformation no se entiende completamente, y la mayoría de los protocolos se han desarrollado empíricamente (por ejemplo, 10,11). Sin embargo, podemos aprender un poco acerca de lo que puede esperar teniendo en cuenta la teoría y algunos resultados empíricos. La opinión generalizada es que electroformation se produce por la conducción del flujo electro-osmótico de amortiguación entre las bicapas lipídicas individuales apiladas en la película de lípidos depositados 10,11. Acoplamiento electrostático a las fluctuaciones térmicas de la bicapa lipídica es probable que también involucró 12. Estas hipótesis cualitativamente predicen los límites superiores de la frecuencia del campo eléctrico y la fuerza que se puede utilizar 10,12. En particular, se prevé que las soluciones de alta conductividad ( <eM&gt; es decir, soluciones salinas fisiológicas) reducen las fuerzas electrohidrodinámicos que pueden iniciar la electroformation liposoma 12. Las tasas de flujo electroosmótico generalmente disminuyen con el aumento de la concentración de sal y se alcanzó su punto máximo con frecuencia a una frecuencia de oscilación del campo eléctrico (por ejemplo, si bien en una geometría diferente, Green et al. 13). Por lo tanto, las intensidades de campo más altas y frecuencias más altas son razonables para soluciones de alta conductividad, dentro de los límites 10. Sin embargo, proteínas de la membrana es probable que sean incompatibles con el método habitual de depósito de lípidos en electrodos para el procedimiento electroswelling, a saber, en disolventes orgánicos que luego se evapora para dejar una película delgada de lípido. Hay dos rutas principales en torno a esta dificultad: para incorporar proteínas después de la formación de liposomas gigantes, o adaptar la forma en se depositan los lípidos. Nuestro enfoque se basa en otros 5,11 para depositar los lípidos y reconstitucióntuido proteína de membrana, junto a una suspensión de pequeñas o grandes &quot;proteoliposomas&quot;. Se describe el largo y más difícil proceso de producción de proteoliposomas de proteínas y lípidos purificados en otro lugar (Collins y Gordon, en revisión). A continuación se describe el protocolo en ausencia de cualquier proteína, pero es lo mismo cuando se incorpora proteínas; incluimos los resultados muestran que proteoliposomas contienen el canal iónico TRPV1 se pueden transformar en GUVs y utilizados para patch-clamp electrofisiología. En cualquier enfoque electroformation, la inspección visual de la muestra de lípidos durante el proceso de deposición de lípidos es crítica para el éxito. Nuestro enfoque puede ser relevante más allá de la aplicación especializada para la reconstitución canal de iones. En el tiempo desde que nos desarrollamos este protocolo y, ahora, también se ha demostrado que la forma en que los lípidos se depositan en los electrodos de electroformation afecta a la heterogeneidad de composición de los GUVs resultantes. Baykal-Caglar et. al 14 mostraron que GUVs cuidadosamente formados a partir de liposomas deshidratados tenían un 2,5 veces menor variación en la temperatura de transición miscibilidad de GUVs formados a partir de mezclas de diferentes fosfolípidos y colesterol. Su trabajo indica que los lípidos, y especialmente el colesterol, puede precipitar de la mezcla de lípidos cuando se depositan a partir de disolventes orgánicos, lo que resulta en una variación espacial en la composición de la película de lípido depositada. Esto es especialmente importante para los estudios de comportamiento de fase de lípidos de membrana, pero también puede ser crítico para experimentos cuantitativos en función del canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al. &#39;S es similar pero no idéntica a la nuestra, y se anima a los lectores a estudiar también. Este protocolo (véase el resumen, la Figura 1) es uno de los muchos que se podría utilizar. En principio electroformation éxito depende de la mezcla de lípidos, la hidratación, la temperatura, otros solutos (especialmente iones), y dePor supuesto, el voltaje y la frecuencia utilizada en la formación. Como electroformation se entiende mejor, esperamos refinar nuestro protocolo más. Por último, a menudo hay una pronunciada curva de aprendizaje en galvanoplastia liposomas gigantes. Sugerimos dominar el protocolo convencional (secciones 1 y 4, y de ser necesario, la Sección 5) antes de aprender a depositar los lípidos a partir de suspensiones de liposomas (Secciones 2-5).

<table><tbody><tr><td>Multímetro digital</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>U1232A o similar</td><td>Cualquier multímetro servirá, pero evite los ohmímetros analógicos de estilo antiguo que aplican mucha más corriente a la resistencia bajo prueba.</td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>117 o 177</td><td>Cualquier multímetro servirá, pero evite los ohmímetros analógicos de estilo antiguo que aplican mucha más corriente a la resistencia bajo prueba.</td></tr><tr><td>Generador de funciones</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>33210A o similar</td><td>La mayoría de los generadores de funciones funcionan para protocolos simples. Este modelo programable es útil para protocolos avanzados de electroformación. Asegúrese de que el generador pueda conducir 10 V de pico a pico a 50 &#937; cargar</td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio revestido ITO</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td><td>CB-90IN-S107 o similar</td><td>Rómpalos por la mitad para hacer dos portaobjetos, de 25 mm x 37 mm</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a> </td><td>CNi3233 o similar</td><td></td></tr><tr><td>Higrómetro</td><td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td><td>445815</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de caucho de silicona</td><td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td><td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td><td>Utilice silicona USP Grado VI por su</td></tr><tr><td>junta EMI</td> de alta pureza <td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td><td>4202-PA-51H-01800 o similar</td><td>Distribuido por Mouser <a href="http:// www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td></tr><tr><td>TxR-DHPE</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td><td>T1395MP</td><td>Existen otros lípidos marcados con fluorescencia, pero el TxR-DHPE es uno de los más brillantes y fotoestables.</td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lípidos Polares, Alabastro, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td><td>850457P o 850457C</td><td>Los lípidos se pueden pedir en polvo (P) o en cloroformo (C)</td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034P/C</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de liposomas gigantes de la imagen y patch-clamp electrofisiología

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

La reconstitución de los canales iónicos en las membranas de lípidos definidos químicamente para registro electrofisiológico ha sido una técnica poderosa para identificar y explorar la función de estas importantes proteínas. Sin embargo, las preparaciones clásicas, tales como bicapas planas, limitan las manipulaciones y experimentos que se pueden realizar en el canal reconstituido y su entorno de la membrana. La estructura más como una celda de liposomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionales sin sacrificar el control del medio ambiente de lípidos. Electroformation es un medio eficiente para producir liposomas gigantes&gt; 10 micras de diámetro que se basa en la aplicación de una tensión alterna a una, película de lípido ordenada delgada depositada sobre una superficie de electrodo. Sin embargo, ya que el protocolo clásico llama para los lípidos para ser depositados a partir de disolventes orgánicos, no es compatible con proteínas de la membrana menos robustos como canales de iones y debe ser modificado. Recientemente, protocols se han desarrollado para electroform liposomas gigantes de pequeños liposomas parcialmente deshidratadas, que hemos adaptado a los liposomas que contienen proteínas en nuestro laboratorio. Presentamos aquí el fondo, equipo, técnicas, y las trampas de electroformation de liposomas gigantes de pequeñas dispersiones de liposomas. Comenzamos con el protocolo clásico, que debe ser dominado primero antes de intentar los protocolos más desafiantes que siguen. Se demuestra el proceso de deshidratación parcial controlada de pequeños liposomas usando equilibrio vapor con soluciones saturadas de sal. Por último, demostrar el propio proceso de electroformation. Vamos a describir un equipo simple, de bajo costo que se puede hacer en casa para producir liposomas de alta calidad, y describir la inspección visual de la preparación en cada etapa para garantizar los mejores resultados.

En nuestros ejemplos, preparamos liposomas a partir de una mezcla de aproximadamente 55% en moles de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% en moles POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoserina , 30 moles% de colesterol, y 0,1% en moles marcados con Rojo Texas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composición fue elegido como representante de aproximadamente el ganglio de la raíz dorsal lípidos 18. Observamos que 15% en moles cargada lípidos (aqu...

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar vesículas unilamelares gigantes de manera compatible con la integridad funcional de las proteínas de membrana incorporadas en la membrana de la vesícula. Esto se logra primero depositando lípidos o liposomas pequeños sobre una superficie conductiva, como una placa de vidrio recubierta con ITO. El segundo paso consiste en evaporar el disolvente de forma controlada para obtener una película lipídica uniforme sobre la superficie conductiva.A continuación, rehidrate cuidadosamente la película lipídica en un tampón adecuado y prepare la cámara de electroformación. El paso final consiste en aplicar un voltaje oscilante a través de la película lipídica para generar vesículas gigantes unilaminares. Finalmente, las vesículas se observarán mediante imagenología para determinar su tamaño y calidad y compararlas con vesículas formadas utilizando una técnica clásica.La demostración visual de este protocolo es útil porque la deposición de lípidos puede ser difícil de dominar, depende de muchas variables y se evalúa mejor mediante inspección visual. Antes de comenzar este procedimiento, retire los lípidos del almacenamiento a menos 20 grados C

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante...

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

Este artículo describe métodos para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de canales pentaméricos activados por ligandos para estudios de Resonancia Paramagnética Electrónica. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína de membrana. El método de reconstitución descrito aquí también se puede utilizar para mediciones de patch-clamp de corrientes macroscópicas y de un solo canal en un sistema lipídico definido.

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Liposomas que contienen cadena simple Anfífilos, particularmente los ácidos grasos, presentan propiedades distintas en comparación con ésos que contienen diacylphospholipids debido a las propiedades químicas únicas de Anfífilos de cadena única. Aquí describimos las técnicas para la preparación, la purificación y el uso de liposomas, formado en parte o totalidad de estos Anfífilos.

Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

Presentamos una técnica de micromanipulación sin contacto de vesículas, con gradientes del ion de calcio localizada. Microinyección de una solución de iones de calcio, en las cercanías de una vesícula lipídica gigante, se utiliza para remodelar la membrana lipídica, dando como resultado la producción de protuberancias tubulares de membrana.

Remodelación de membrana de vesículas gigantes en respuesta a gradientes del Ion de calcio localizada

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este protocolo detalla un método para medir directamente la actividad de los canales iónicos en vesículas intracelulares utilizando un sistema manual de pinza de parche endolisosomal. Ilustramos el método que consiste en agrandar los endolisosomas y aislar manualmente estas vesículas. Este enfoque garantiza que los investigadores puedan replicar y aplicar con precisión el procedimiento.

Técnicas de patch-clamp para el análisis de vesículas endolisosomales únicas

Aprende a preparar liposomas gigantes unilamelares mediante electroformación para estudios de electrofisiología con parche. Este método preserva la integridad funcional de proteínas de membrana en neurociencia.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

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