Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

El objetivo general de este procedimiento es preparar vesículas unilaminares gigantes de una manera compatible con la integridad funcional de las proteínas de membrana incorporadas a la membrana de la vesícula. Esto se logra depositando primero lípidos o pequeños liposomas sobre una superficie conductora como un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO. El segundo paso es evaporar el disolvente de forma controlada para conseguir una película lipídica uniforme en la superficie conductora.

A continuación, rehidrate cuidadosamente la película lipídica en un tampón adecuado y prepare la cámara de electroformación. El paso final es aplicar un voltaje oscilante a través de la película lipídica para generar vesículas gigantes de Miller unales. En última instancia, se tomarán imágenes de las vesículas para determinar su tamaño y calidad y compararlas con las vesículas formadas mediante una técnica clásica.

La demostración visual de este protocolo es útil porque la deposición de lípidos puede ser difícil de dominar, depende de muchas variables y es mejor analizarla mediante inspección visual. Antes de comenzar este procedimiento, retire los lípidos del almacenamiento a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius y caliéntelos a temperatura ambiente. Si es posible, realice el experimento en una atmósfera de gas inerte, como una guantera.

A continuación, cubra los lípidos con argonato seco o gas nitrógeno y minimice en todos los pasos la exposición al aire. Si los lípidos no se suministran en disolvente orgánico, suspenda 0,3 miligramos de lípidos en cloroformo o cicloheano a 10 miligramos por mililitro. Tenga en cuenta que las concentraciones indicadas por el fabricante suelen ser solo nominales.

Utilice etanol para limpiar ambos lados de 2 portaobjetos de vidrio recubierto de ITO de 25 milímetros por 37,5 milímetros. A continuación, añada un 0,1 por ciento más de DPPE rojo de Texas a los lípidos para obtener imágenes fluorescentes. Mida la resistencia de la superficie con un multímetro para verificar que el lado recubierto de ITO de los portaobjetos de vidrio esté hacia arriba, lo que se indica con una resistencia de unos pocos cientos de ohmios.

Aspire los lípidos en una jeringa resistente a los disolventes sin que la aguja de la jeringa toque la superficie del ITO. Aplique lentamente el lípido moviendo la aguja hacia adelante y hacia atrás a través del portaobjetos. Cubra la superficie de manera uniforme, buscando un brillo de arco iris en la superficie del vidrio.

Después de esto, coloque los portaobjetos rápidamente en un vacío, desece y bombee la cámara a menos de un vacío durante 0,5 a una hora. Para eliminar cualquier rastro de disolvente. Libere el vacío con gas inerte.

Aplique una capa delgada de grasa de silicona a ambos lados de una junta de silicona y luego coloque la junta en la corredera. Deje al menos cinco milímetros de portaobjetos descubiertos expuestos en un extremo del portaobjetos. A continuación, hidrate cuidadosamente cada pocillo colocando una aguja de jeringa de calibre 27 en el borde de la junta y aplique lentamente el tampón para llenar cada pocillo de la junta en aproximadamente un 10% con tres montones milimolares.

Una vez que los lípidos estén hidratados, proceda rápidamente a través de los pasos restantes. Dado que las películas lipídicas comienzan a deslaminarse, verifique inmediatamente el lado conductor del portaobjetos con el multímetro. A continuación, aplique la segunda cara conductora de la corredera ITO en la parte superior de la junta.

Asegúrese de tener al menos cinco milímetros de voladizo fuera del área de la junta y frente al primer voladizo, y presione suavemente para asegurar un buen sellado. Limpie los dos voladizos con etanol. Ahora asegure el sándwich deslizante ITO a contactos eléctricos como barras de cobre o espuma de juntas.

Este gráfico muestra un despiece de la cámara y el conjunto de contactos como referencia. Los planos detallados se pueden encontrar en el protocolo de texto utilizando un multímetro. Verifique que no haya un cortocircuito eléctrico entre los contactos y que los contactos se conecten correctamente a las superficies ITO.

A continuación, coloque la cámara de electroformación en un horno y caliente la cámara 10 grados centígrados por encima de la temperatura de fusión más alta de cualquiera de los lípidos presentes. Mida el espacio entre las dos superficies recubiertas de ITO para determinar la amplitud de la onda sinusoidal. La amplitud de la onda sinusoidal debe ser de aproximadamente 0,7 voltios RMS Por cada espacio de milímetros entre las superficies ITO, aplique una onda sinusoidal de 10 hercios durante 60 a 90 minutos.

Conecte el generador a la cámara de electroformación y confirme el voltaje con un multímetro. Después de 60 a 90 minutos de electroformación, deberían haberse formado vesículas unales gigantes. Use un microscopio invertido equipado con un cubo de filtro para el tinte rojo de Texas para obtener imágenes de los liposomas.

El liposoma debe ser esférico, predominantemente Ella a simple vista y libre de defectos como hilos que cuelgan del liposoma. Los pasos anteriores cubrieron la preparación clásica de liposomas gigantes a partir de lípidos puros. Se muestra una preparación más desafiante utilizando liposomas pequeños.

A continuación, primero, prepare una solución saturada de carbonato de potasio del 44% de humedad relativa a 20 grados centígrados. Use un recipiente de plástico para yogur y granola con una taza superior anidada que haya sido modificada con agujeros en la taza superior. Coloque la solución salina saturada y el exceso de sal en un recipiente herméticamente cerrado con un estante interior.

Vuelva a colocar el estante después de llenarlo y asegúrese de que el líquido esté de cinco a 10 milímetros por debajo del estante. Coloque un sensor de humedad en una muesca en el costado del recipiente. Limpie ambos lados de los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO con etanol.

Utilice el multímetro para determinar qué lado es conductor y etiquete el lado no conductor con el nombre de la muestra. A continuación, engrase ligeramente ambos lados de una junta de silicona de una o varias sujeciones. Coloque el conductivo del portaobjetos, colóquelo en el banco y aplique las juntas de silicona a cada portaobjetos al que se aplicará el lípido.

Asegurándose de que haya al menos cinco milímetros de corredera expuesta en un extremo para conectarse al aparato de electroformación. Alise la junta para asegurar un buen sellado, diluya la preparación de la vesícula en el tampón iso modic bajo en sal a aproximadamente uno o dos miligramos por mililitro. Aplique el lípido al portaobjetos en gotas de uno a 10 microlitros.

Coloque el portaobjetos en el estante interior sobre la solución salina saturada y selle herméticamente el recipiente. Dejar a temperatura ambiente durante tres horas o toda la noche. El portaobjetos ahora se puede utilizar para la electroformación de liposomas gigantes como se mostró anteriormente en el protocolo clásico.

Observe la apariencia del arco iris de los depósitos individuales. Esta imagen muestra liposomas electroformados a partir de lípidos depositados fuera del cloroformo, las flechas apuntan a liposomas gigantes. Esta imagen tiene muy pocas áreas borrosas y, por lo tanto, indica una buena preparación.

La siguiente imagen tiene muchas regiones borrosas y, por lo tanto, indica una preparación generalmente pobre. Tenga en cuenta que la flecha dos indica una región con liposomas poco distinguibles y que no se puede enfocar ningún liposoma en el área indicada por la flecha tres. Aquí se muestra un aumento de 10 veces de liposomas electroformados con éxito a partir de lípidos depositados por deshidratación de pequeños liposomas.

Las flechas indican tres liposomas de buena calidad que varían en tamaño de aproximadamente cinco a 20 micrómetros con un aumento de 40x. Se puede ver un anillo transparente en el borde del liposoma, lo que indica un liposoma uni o casi lumal. Las corrientes iónicas TR PV one activadas por capsaicina registradas en parches de membrana lipídica extirpados de los liposomas gigantes formados se muestran aquí.

La corriente de fuga indicó una resistencia de sellado de 500 mega antes de que se agregara la capsaicina. La capsaicina saturada activó una gran T RRP V una corriente. La corriente regresa cerca de la línea de base a medida que la capsaicina se elimina del parche mientras se intenta este procedimiento.

Es importante mantener la flexibilidad, ya que hay muchos factores que afectan a la forma en que los lípidos se deshidratan y forman una película uniforme en el sustrato de vidrio. Consulte nuestra sección de solución de problemas en línea y varíe la temperatura, la humedad, la concentración de lípidos y el tamaño de las gotas para lograr los mejores resultados.