La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método corto, preciso y barato para evaluar la longitud de los telómeros y la actividad de los telómeros en múltiples tejidos y especies. Esto se logra aislando primero el ADN genómico para la determinación de la longitud de los telómeros mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El segundo paso consiste en aislar y analizar las células del mismo tejido en un tampón que preserve la función de la telomerasa y medir cuantitativamente la telomerasa mediante PCR en tiempo real.

En última instancia, tanto la determinación de la longitud de los telómeros como la detección de la actividad de la telomerasa se utilizan para encontrar las relaciones entre la longitud de los telómeros y la senescencia celular, los posibles mecanismos de acortamiento de los telómeros y las respuestas de recuperación al envejecimiento y los estados de proliferación celular. La primera vez que conocí este método fue cuando buscaba una forma rápida y sencilla de medir las longitudes de los omes y la actividad de los omeros. La implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico de enfermedades asociadas a la edad y la muerte prematura debido a su informe sobre el estado de las células, que se refleja en la condición de los órganos y la forma general del cuerpo.

La demostración de este procedimiento estará a cargo del Sr. Ur Bogo, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, aísle el ADN de la sangre del sujeto utilizando el kit Qiagen DNE, formulado específicamente para fuentes de sangre en el paso final. Eluir el ADN en agua de grado PCR y medir la concentración con un espectrofotómetro.

A continuación, prepare los cebadores de PCR estándar como se describe en OC Callahan et al para el gen de copia única o el control de SCG y para los telómeros diluyéndolos a 100 picomoles por microlitro. Usando agua de grado PCR mientras los cebadores se rehidratan, prepare diluciones en serie del ADN aislado. Comience diluyendo el ADN original con agua de grado PCR hasta una concentración máxima de 6,1 nanogramos por microlitro para las reacciones de telómeros y 1,8 nanogramos por microlitro.

Para las reacciones SCG, deje reposar la dilución durante un mínimo de 15 minutos antes de pasar a la siguiente. Después de 15 minutos, prepare la siguiente dilución de acuerdo con la tabla que se muestra aquí. Repita esto para cada dilución enumerada.

A continuación, configure las reacciones de PCR en una placa de PCR estándar. Cada muestra, junto con los controles SCG, se ejecutan por triplicado. Primero, agregue seis microlitros de agua de grado PCR a cada pocillo y luego agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción verde cibernética.

A continuación, añada los cebadores en las cantidades que se muestran aquí a sus respectivos pocillos. A continuación, diluya aún más una alícuota de cada uno de los cebadores madre con agua de grado PCR diez veces mayor para que la concentración final sea de 10 picomoles por microlitro. Por último, añade dos microlitros del ADN diluido en serie a sus respectivos pocillos y cubre la placa con una lámina de plástico adhesiva para sellar el contenido.

A continuación, coloque la placa en la máquina de PCR en tiempo real. A continuación, prepare un programa en el termociclador de luz Roche four 80, comenzando con una desnaturalización de 10 minutos. Camine a 95 grados Celsius, luego haga un ciclo de 95 grados Celsius durante 10 segundos, 60 grados Celsius durante cinco segundos y 72 grados Celsius durante 11 segundos.

Para un total de 50 ciclos, realice mediciones de verde cibernético después de cada ciclo. A continuación, comience el programa una vez que el termociclador se haya completado. Establezca la línea CT al comienzo de la curva exponencial y registre los valores del ciclo desde que cada muestra cruza la línea de umbral.

A continuación, calcule la relación de números de ciclo entre las muestras de telómeros y genes de copia única. Dado que el telómero tiene múltiples regiones, que se amplificarán en cada ciclo, los valores de CT de los telómeros serán más pequeños que el número de copias de un solo gen, lo que resultará en una proporción de menos de uno. Por último, calcule la longitud de los telómeros basándose en el trabajo de Terry Etal, donde un telómero por unidad de copia de un solo gen equivale a una longitud media de los telómeros de 4.270.

Los pares de bases en los leucocitos realizan mediciones de la actividad de la telomerasa utilizando la detección cuantitativa de telomerasa de Allied Biotech para comenzar las mediciones, recolectar de 10 a la quinta a 10 a la sexta células de sangre periférica y enjuagarlas en PBS. A continuación, explíquelos a 500 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de un tampón de lisis del kit de ensayo e incube en hielo durante 30 minutos.

Después de la incubación, centrifugar las muestras a 12.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Para granular los restos de la celda, transfiera 160 microlitros del sobrenadante resultante a un tubo nuevo y flash, congele el sobrenadante restante en un baño de etanol y hielo seco antes de almacenarlo a menos 80 grados Celsius para su uso repetido. A continuación, determine la concentración de proteínas del sobrenadante mediante un ensayo estándar de BCA.

Para cada muestra recolectada, calcule la cantidad de proteína necesaria para el ensayo en función del rango de trabajo del kit de telomerasa. Luego, dado que la telomerasa es una enzima sensible al calor, inactive con calor la mitad de cada muestra para usarla como control negativo mediante la incubación a 85 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, prepare la curva estándar cuantitativa diluyendo en serie el stock.

Los oligonucleótidos TSR diluyen la solución madre cinco veces en una dilución de una a cinco utilizando tampón de lisis. Los oligonucleótidos TSR tienen una secuencia idéntica a los cebadores de los telómeros y son de una concentración conocida. A continuación, configure la mezcla maestra que consta de 12,5 microlitros de dos premezclas de detección cuantitativa de telomerasa y 11,5 microlitros de agua de grado PCR por muestra y mezcla.

A continuación, pipetee 24 microlitros de la mezcla maestra en cada tubo que se utilice. Una vez que se haya dispensado la mezcla maestra, agregue un microlitro de cada plantilla que consista en el patrón, una muestra de calor y activada o una muestra regular a los pocillos. A continuación, selle la placa con una lámina de plástico adhesiva y mezcle las muestras por vórtice.

A continuación, colóquelos en el sistema de detección de PCR en tiempo real. Configure el programa de PCR para que comience a 25 grados centígrados durante 20 minutos. Durante este tiempo, tendrá lugar la reacción de la telomerasa.

Siga esto con 95 grados Celsius durante 10 minutos para el paso inicial de activación de PCR. Luego realice 40 ciclos de 95 grados Celsius durante 30 segundos, 60 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante 30 segundos. Para amplificar las plantillas de telómeros se añadieron durante los 20 minutos a 25 grados centígrados.

Finalmente, ejecute el programa y recopile los valores de ciclo umbral para cada muestra. A continuación, genere una curva estándar utilizando los valores de CT y utilícela para calcular la actividad de la telomerasa. En las muestras mostradas.

Estos son los resultados de PCR en tiempo real de un sujeto de 65 años. El gen de los telómeros, representado por las líneas rojas brillantes, alcanza su curva exponencial después de unos 27 ciclos. El segundo conjunto de líneas representa la amplificación del gen de una sola copia, que tiene solo una copia en el genoma y, por lo tanto, tiene menos copias que las muestras de telómeros representadas por las líneas rojas.

Además, el gen de copia única alcanza su curva exponencial después de unos 31 ciclos. Las líneas marrones representan la curva estándar 33 basada en una dilución en serie de concentraciones de muestra conocidas. Aquí se muestra la curva estándar para el logaritmo de la concentración frente a los valores umbral.

Una línea recta confirma que la dilución en serie se midió y cargó con precisión. Los resultados del análisis de PCR en tiempo real se utilizan para estimar la longitud de los telómeros. Una unidad de proporción de telómeros por copia de un solo gen equivale a una longitud media de telómeros de 4.270 pares de bases en leucocitos y, a partir de estos datos, se obtiene una relación de 0,87, que es un promedio de 3.715 pares de bases y una longitud intermedia para alguien de esta edad.

Utilizando los resultados de los ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real, se puede dilucidar una relación entre la actividad de los telómeros y la proporción de copias de telómeros a un solo gen. Este gráfico muestra una fuerte relación entre los dos ensayos después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento exploraran la senescencia celular en el organismo modal, la demografía del paciente y los sistemas de órganos.