La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

El objetivo general de este procedimiento es separar el embrión de ratón, el ectodermo facial y el mechy. Esto se logra aislando primero los embriones CD one E 10.5. El segundo paso del procedimiento es tratar los embriones enteros con dys.

Segunda fase. Después del tratamiento enzimático, se aíslan las prominencias faciales y el paso final es separar cuidadosamente la dermis facial del mesénquima. La dermis facial aislada y el mesénquima están listos para una mayor experimentación.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el tratamiento de la prominencia facial disecada, es que el tratamiento de todo el embrión con DYS space mantiene intacto tanto el accidente facial como el tratamiento con espacio distinto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo de los mamíferos, como la forma en que la expresión génica diferencial, la modificación epigenética y la unión de factores de transcripción pueden regular la diafonía molecular entre la dermis facial y el mesénquima. Durante la embriogénesis, planifique de cuatro a seis horas desde ahora hasta el aislamiento de los tejidos, limpie el área de disección y las herramientas para etanol al 70%.

Y si las muestras son para el aislamiento de ARN, use ARN de distancia. Es fundamental que las pinzas estén afiladas. Además, para el aislamiento de ARN, la solución debe tratarse con percarbonato de etilo.

Ahora eutanasiar a una hembra embarazada de CD uno utilizando protocolos aprobados para recolectar embriones E 10.5. Rocíe el abdomen con etanol al 70%, abra el abdomen. Use un juego de pinzas para jalar el útero y otro para separar el meso nutrium del útero.

Retire el útero del cuerpo y repita el proceso en el cuerno uterino opuesto. Enjuague brevemente el útero con PBS helado en una placa de Petri de 10 centímetros para lavar la sangre. Transfiera el útero a un plato nuevo con PBS helado.

Sepáralo en fragmentos de embrión cortándolo entre los sitios de implantación. A continuación, transfiera un embrión a PBS helado bajo un microscopio estereoscópico. Comenzando en uno de los sitios de corte.

Utilice las pinzas finas para arrancar la pared muscular del útero y exponer el embrión con el saco vitelino. A continuación, retire el saco vitelino y el amnios. Transfiera el embrión disecado a una placa de Petri de seis centímetros con PBS en hielo y repita el procedimiento hasta que se hayan recolectado todos los embriones.

Antes de tratar los embriones con pasta dos, lávelos con PBS helado en una placa de Petri de seis centímetros. Reemplace el PBS con 10 mililitros de Pastas Dys Pastas diluidas en PBS frías. Tapa el plato e incuba a 37 grados centígrados durante unos 25 minutos.

Ajustar el tiempo en función de la actividad enzimática de la disfase dos, que puede variar para confirmar la digestión, mirar bajo un microscopio estereoscópico y comprobar que la dermis se ha aflojado. Esto se caracteriza por un claro espacio entre esta capa de tejido y el mecha subyacente. Si no está suelto, incube el tejido durante otros cinco minutos.

Cuando se complete la digestión, coloque las muestras en hielo. Manténgalos refrigerados a partir de ahora, excepto durante las disecciones después del tratamiento con dys. En la fase dos, la dermis facial es fácil de despegar.

Utilice una pipeta de vidrio desechable para transferir un embrión tratado a PBS helado en un plato de seis centímetros bajo un microscopio estereoscópico. Use fórceps para sostener el embrión y busque fórceps para cortar cuidadosamente los límites de las prominencias faciales unidas a la cabeza. Preste especial atención a la contaminación de otros ectodermos, descartes o tejido potencialmente contaminado para diseccionar las prominencias faciales intactas.

Comience la disección desde un lado Primero, diseccione bajo el MNP. A continuación, proceda con el MXP y el FNP. Repita este proceso desde el otro lado para completar el aislamiento en este punto si es necesario, separe y aísle las tres prominencias faciales con todos los tejidos preparados con tres aumentos.

Separe el derm facial y mecha lo más rápido posible. Primero, use una pipeta de pasta de vidrio larga para pipetear suavemente las prominencias faciales hacia arriba y hacia abajo cinco veces. El ectodermo ahora se elimina fácilmente.

Use una pinza para sujetar las prominencias faciales y una segunda pinza para despegarlas del ectodermo muy lentamente. Este es el paso más difícil de este procedimiento. Se asegura de que las pinzas estén muy afiladas.

Y cuando pele suavemente el olor de la subida mágica, hazlo muy lentamente. Además, siempre ajuste su posición según sea necesario. Usando una nueva pipeta larga de vidrio para pasta.

Transfiera la dermis facial a un tubo de 1,5 mililitros con PBS fresco en hielo. Transfiera el mesénquima a otro tubo de 1,5 mililitros con PBS fresco en hielo. Ahora lave las muestras con la centrífuga PBS next.

Las muestras de cuatro grados centígrados de 500 g y durante tres minutos aspiran el PBS utilizando pipetas largas de vidrio para pasta. Las muestras ahora se pueden procesar para un ensayo de chip o extracción de ARN o extracción de proteínas. Después de la fase dos del tratamiento, el ectodermo del embrión tiende a estar suelto.

Las prominencias faciales deben permanecer intactas después de la disección. El ectodermo facial aislado debe ser transparente y estar libre de tejido mecánico para determinar la eficacia del protocolo. La contaminación cruzada se probó a nivel molecular.

Se realizó RT PCR en cada tejido para los siguientes aspectos, para la expresión cerebral enferma. Tres, CDC CDH específico de ODEM uno y específico de Mety. Así que 10, los resultados confirmaron que los tejidos expresaban los genes esperados y estaban libres de contaminación cruzada.

Al intentar estos procedimientos, es importante recordar mantener las muestras en los ojos en todo momento, excepto para el tratamiento DASE dos y las disecciones después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo craneofacial exploraran la expresión génica diferencial, la señal molecular, la diafonía y la identificación de objetivos posteriores en la dermología facial embrionaria y la mecha con relevancia para el desarrollo facial o la hendidura facial. Siguiendo este procedimiento se encuentran los métodos como el armado chipsy como ASIC y la detección de proteínas se pueden realizar para responder preguntas adicionales como cómo las diferencias de expresión génica en la unión del factor de transcripción diferencial distinguen el odum y la increíble subida.