De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la migración de las células dendríticas hacia el ganglio linfático drenante mediante imágenes de resonancia magnética de flúor no invasivas o resonancia magnética en combinación con resonancia magnética de protones convencional. Esto se logra preparando primero las células dendríticas derivadas de la médula ósea murina y marcando las células completamente diferenciadas con partículas ricas en flúor. Durante el segundo paso, las células marcadas con flúor se administran por vía intracutánea en las extremidades traseras de un ratón, lo que garantiza la transmigración eficiente de las células administradas.

A continuación, se obtienen imágenes de la región anatómica de interés mediante una resonancia magnética de flúor y protones, para controlar la migración de las células dendríticas de la piel a los ganglios linfáticos que drenan. En última instancia, la migración de células dendríticas desde el área de aplicación hasta el ganglio linfático drenante se puede visualizar mediante resonancia magnética con flúor. La principal ventaja de este método sobre otras técnicas de seguimiento celular, como las que requieren nanopartículas de óxido de hierro, es que el suelo unido al carbono está prácticamente ausente en todos los organismos vivos.

Esto produce imágenes completas sin fondo y una selectividad celular completa después de la aplicación de células marcadas con flúor in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología, como cuál es la influencia de los candidatos moleculares en la migración de células dendríticas in vivo. Demostrando el método está Yulia Kovski, técnica, y Helma VIIs, una científica senior de mi laboratorio, en el día 10 de cultivo de células dendríticas de médula ósea.

Activar las células dendríticas con LPS durante 24 horas. Etiquete las células dendríticas con un milimolar rico en flúor por fluoro 15 corona cinco partículas de éter durante este tiempo también, para confirmar que las células dendríticas se han marcado con éxito, verifique las características físico-químicas de las células mediante citometría de flujo. Las células marcadas con flúor se muestran aquí como eventos rojos en el diagrama de dispersión hacia adelante y hacia los lados, y las células sin marcar se muestran como eventos azules.

En la siguiente posición, un ratón C 57 black six en un soporte y luego cargue una jeringa de tuberculina de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 26 y medio con células dendríticas marcadas con fluorescencia en un volumen de 50 a 100 microlitros. Ahora inserte con cuidado la aguja en las capas superiores de la piel en cada una de las extremidades traseras del animal para incu administrar las células. Después de anestesiar al ratón, coloque al animal boca abajo en la cama del ratón del escáner de resonancia magnética de animales pequeños.

Después de asegurar al animal en el soporte de imágenes y las conexiones al sistema de monitoreo, mueva el soporte al centro de la bobina de RF de flúor de protones para confirmar la posición correcta del animal y el escáner. Y posterior planificación de la geometría del corte de la imagen. Adquiera imágenes de exploración en tres orientaciones estándar utilizando métodos de adquisición de imágenes rápidos y de baja resolución en el software MR Scanner.

Sintonice la bobina de RF a la frecuencia de resonancia de protones y a la frecuencia de resonancia de flúor. Utilice el monitor de sintonización del escáner de resonancia magnética animal para hacer coincidir la impedancia característica de la bobina a 50 ohmios. A continuación, establezca los ajustes necesarios de los sistemas automáticos, incluida la calce para ajustar la homogeneidad de los ajustes de frecuencia del sistema de campo magnético para ajustar la RF a la frecuencia LA específica del sistema MR para protones y ganancia de referencia.

Para ajustar la amplitud de RF, configure un protocolo 3D turbo raro para el escaneo de protones, utilizando un TR de 1500 milisegundos y TE de 53 milisegundos, una matriz de 400 por 200 por 200 y un factor raro de 16. Ajusta el campo de visión con la ayuda de las imágenes del explorador. A continuación, inicie el escaneo.

Cargue una secuencia FID de un solo pulso con el TR de al menos 1000 milisegundos y, a continuación, abra el escaneo de edición y establezca el núcleo en flúor en el método de edición de la caja de herramientas. Anule la selección de la ganancia de referencia automática mediante la configuración de go. Inicie la medición sin registrar los datos para mostrar una señal de RM en tiempo real.

Ajuste la frecuencia básica para centrar el pico espectral de flúor en cero hercios en la ventana de adquisición. A continuación, seleccione, aplique la frecuencia básica y pulse detener ahora. Clona el protocolo 3D turbo rare del escaneo de protones anterior.

Vaya al método de edición y luego anule la selección de la ganancia de referencia automática como se muestra en el escaneo de edición. Establezca el núcleo de flúor y luego cambie la matriz a 1 28 por 64 por 64 y el factor raro a al menos 40. Una vez finalizadas las exploraciones, retraiga el soporte del ratón del escáner de resonancia magnética y utilice el menú de visualización para superponer las imágenes de flúor a las imágenes de protones.

Después de sacrificar el ratón, extraiga el ganglio linfático popal de interés y colóquelo en un tubo de RMN de cinco milímetros que contenga 100 microlitros de PFA al 2%. A continuación, coloque el tubo dentro de una bobina de espectroscopia de flúor y mueva la bobina al centro ISO del imán. Sintonice la bobina de RF a la frecuencia de resonancia de flúor y, a continuación, en el monitor de sintonización del escáner de resonancia magnética animal, haga coincidir la impedancia característica de la bobina con 50 ohmios dentro de la caja de herramientas de calza.

Establezca todos los parámetros de la cuña en cero y presione aplicar. A continuación, cargue una secuencia FID de un solo pulso con un TR de al menos 1000 milisegundos. Abra el escaneo de edición y configure el núcleo en flúor.

Ahora, usando la configuración go, inicie la secuencia, ajuste la frecuencia básica para que el pico espectral de flúor esté en el centro de la ventana de adquisición a cero hercios y aplique la frecuencia básica. A continuación, vuelva a ajustar el atenuador de pulso para maximizar la señal y alcanzar una excitación de 90 grados. Cuando la señal esté al máximo, presione stop.

Finalmente, en el método de edición, establezca los promedios entre 64 y 256 dependiendo de la señal, y luego use go pipeline. Iniciar la adquisición de 18 a 21 horas después de la aplicación intracutánea. Las células dendríticas marcadas con flúor migran hacia el ganglio linfático popal que drena.

El movimiento de las células dendríticas a través de los conductos linfáticos hacia el ganglio linfático público que drena se puede apreciar superponiendo las imágenes anatómicas de protones con las células dendríticas de flúor. En las imágenes, las células dendríticas se muestran como una resonancia magnética de flúor. La señal está en rojo, mientras que los ganglios linfáticos y los conductos linfáticos se muestran en la imagen de resonancia magnética anatómica de protones en escala de grises. Con el fin de cuantificar el grado de migración de las células dendríticas a los ganglios linfáticos drenantes, se extraen los ganglios linfáticos y se realiza una MRS de flúor, como se acaba de demostrar cuando se compara la señal de flúor obtenida de cada ganglio linfático con la señal de flúor obtenida de diferentes números de células dendríticas marcadas con partículas de éter por fluoro 15 corona cinco, como se ilustra en esta curva de calibración. El número de células dendríticas marcadas con flúor que llegan al ganglio linfático drenante se puede deducir para este experimento representativo.

Se puede estimar que 7,5 veces 10 a la cuarta células dendríticas que no estaban cargadas con antígeno alcanzaron el ganglio linfático izquierdo, mientras que 3,6 veces 10 a las células dendríticas cargadas con quinto antígeno alcanzaron el ganglio linfático derecho. Aunque esto puede proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la migración de las células inmunitarias en condiciones normales, también se puede utilizar en modelos animales como los de las enfermedades autoinmunes. Además, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el campo de la terapia del cáncer.

Cualquier objetivo molecular identificado se puede utilizar para manipular las células dendríticas para la terapia tumoral.