Name: De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a rastrear la migración de células dendríticas mediante resonancia magnética de fluor-19 combinada con protones en modelos murinos. Este método no invasivo permite visualizar el movimiento celular hacia los ganglios linfáticos con imágenes libres de fondo.

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Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) y una beca universitaria a SW en el Centro de Investigación Experimental y Clínica, una colaboración del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular y la Facultad de Medicina Charité de Berlín. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. Agradecemos al Sr. Robert Westphal para el apoyo técnico durante su internado en nuestro laboratorio.

Todos los animales procedimientos deben ser aprobados por el comité local institucional bienestar de los animales antes de la ejecución. Durante las mediciones de RM un nivel adecuado de anestesia y monitorización fisiológica (temperatura corporal, la frecuencia respiratoria) son requisitos indispensables. 1. Generación de hueso de médula de ratón derivados de células dendríticas <ol><li> Extraer células de médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones como se describió previamente 12. Este protocolo se remonta a 1992 13 y fue descrito originalmente por el grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descubridor de la célula dendrítica 14. </li><li> Brevemente, se extrae la tibia y el peroné poco después de sacrificar los ratones. Trabajando bajo la campana de flujo laminar (para evitar la contaminación microbiana), enjuagar la médula ósea en una pequeña placa de Petri con medio de lavado (5% de FBS, HEPES 1% de penicilina / estreptomicina y 1% en RPMI) 12. </li><li> Transferir la suspensión celular a través de una estra célulainer (100 micras de malla, nylon) en un tubo de centrífuga estéril de 50-ml con el fin de retirar el hueso y el tejido sobrante. Después de varias etapas de lavado y un 12 lisis de paso, contar las células viables usando azul de tripano y un hemocitómetro a. </li><li> Volver a suspender las células de médula ósea a una concentración de 400.000 células ml -1 en medio de cultivo (RPMI suplementado con FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, HEPES 1% y 1% de L-glutamina) que contenía 75 ng ml -1 del ratón granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias (MGM-CSF) obtenido a partir de sobrenadantes de 293FT células HEK transfectadas con un plásmido GMCSF ratón. Transferir 10 ml de suspensión celular (4 x 10 6 células) en placas Petri (100 mm x 20 mm) y se incuban en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). El día 3, reponer el medio viejo con 10 ml de medio fresco (manteniendo la concentración final de mGM-CSF a 75 ng ml -1). El día 6, eliminar 10 ml de medio viejo y reponercon 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 75 ng ml -1). El día 8, eliminar 10 ml de medio viejo y reponer con 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 150 ng ml -1). </li><li> El día 10, el DC madurar diferenciada con 1 mg ml -1 lipopolisacárido (LPS) durante 24 horas. </li></ol> 2. El marcaje de las células dendríticas con 19 F-partículas ricas <ol><li> Durante la etapa de maduración hr 24 (1,5), la etiqueta de la DC con 1 mM flúor-rico perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) partículas (500-560 nm) también durante 24 horas. Preparar grandes partículas marcadas con flúor por emulsificación de PFCE en Pluronic F-68 (volumen total 2,5 ml) utilizando un sonotrodo celular interrumpiendo titanio y empleando un programa de pulso continuo (100% de amplitud, potencia = 250 W) durante 60 seg. </li><li> Después de las etapas de incubación anteriores, cosechar el maduro y flúor etiquetados-DC usando un raspador de células de cultivo de tejidos, transferencia en un tubo de centrífuga de 50-ml y centrifugara 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Para lavar cualquier partícula de restos y células muertas, deje células recolectadas a adherirse en poli-L-lisina platos. Para prepararse para este paso, capa placas de Petri con poli-L-lisina (1 mg ml -1) a 37 ° C durante 1 hora, después lavar el no unido poli-L-lisina con PBS. </li><li> Incubar por encima de las células cosechadas en las placas de poli-L-lisina en medio libre de suero y permitir que las células se adhieran (1 hora a 37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Lavar el medio para desechar las células no adheridas, partículas restantes y las células muertas y se lava tres veces con pre-calentado (37 ° C) PBS. </li><li> Cosecha de células adherentes por la tripsina-EDTA tratamiento (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubación a 37 ° C). </li><li> Después de otro paso de centrifugación lavado, resuspender la cantidad requerida de DC maduras en suero libre de PBS estéril. </li><li> Para determinar si las células han sido correctamente etiquetada, se recomienda comprobar la physicocheMical características de las células por medio de citometría de flujo (FACS). La dispersión lateral (SSC) debería revelar un aumento de la granularidad en estas células, como se ha descrito previamente 11. Debe también tenerse en cuenta que los fibroblastos pueden contaminar los cultivos de corriente continua y también podría llevar hasta los 19 partículas F en paralelo. Por lo tanto la pureza DC debe evaluarse (por la medición del porcentaje de CD11c + CD11b + células usando FACS) antes de la aplicación in vivo. </li></ol> 3. Aplicación in vivo de 19 F-etiquetados células dendríticas <ol><li> Administrar DC (06 10-julio 10) en un volumen de 50 a 100 l intracutánea en las extremidades traseras de un ratón C57BL / 6 colocando el ratón en un soporte y cuidadosamente inserción de una aguja G 26 ½ en las capas superiores de la piel antes de la aplicación (uso jeringas de tuberculina 0,5 ml con agujas permanentemente conectados a reducir al mínimo el volumen muerto). Para asegurar unan aplicación intracutánea adecuado, es importante que la parte insertada de la aguja sea parcialmente visible debajo de la piel. Si la aguja no es ya visible, la aguja se ha insertado demasiado profundo en las capas de la piel. Para el individuo no entrenado, la aplicación intracutánea podría realizarse bajo anestesia. </li><li> Imagen de los miembros de flúor en vivo (19 F) / protón (1 H) MRI (véase la sección siguiente) 21 hr inyección siguiente. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H resonancia magnética Las instrucciones detalladas para la configuración de las exploraciones de RM se refieren a un escáner Bruker MR utilizando el software de control Paravison (versión 5.1). Los nombres que se refieren a las funciones específicas de los proveedores y los elementos se han destacado en letra cursiva. Para otros escáneres MR estos pasos pueden tener que ser ajustados de acuerdo con las directrices de los fabricantes. <ol><li> Organizar el acceso a un dedicadoanimal pequeño MR escáner. Para una calidad de imagen adecuada, un sistema con una intensidad de campo magnético de 9,4 Tesla o más y adaptado de bobinas de radiofrecuencia (por ejemplo, 1 H / F 19 de doble bobina de RF sintonizable volumen, 35 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud; Rapid Biomed, Würzburg, Alemania) se recomiendan. </li><li> Antes de la resonancia magnética, preparar la instalación del escáner MRI para anestesia y monitorización fisiológica. Asegúrese de que la máscara de respiración del animal cama / soporte está conectado al sistema de isoflurano y que la sonda de temperatura y la almohadilla de respiración están conectados a un sistema animal de monitorización remota (por ejemplo, modelo 1025, SA Instruments Inc., Nueva York, EE.UU.). Este último sirve para monitorizar los parámetros vitales del animal, tales como la temperatura del cuerpo y la respiración. </li><li> Anestesiar a ratones por narcosis por inhalación usando una cámara de ratón conectado a un sistema de isoflurano. Ajuste el caudal de aire y O 2 a 0,2 L min -1 y 0,1 L min -1, respectivamentey 3% de isoflurano (ajustar de un vaporizador) por alrededor de 2 min hasta que el nivel deseado de anestesia se alcanza (no pellizco respuesta dedo siguiente). Las tasas óptimas de flujo puede variar dependiendo de la configuración que se utiliza. Tenga en cuenta que las altas tasas de flujo puede conducir a la deshidratación. Monitoreo cuidadoso de las condiciones de los animales se requiere en todo momento como se mencionó anteriormente. </li><li> Coloque el ratón boca abajo en la cama ratón / titular del animal pequeño MR escáner (Figura 1). </li><li> Mientras se mantiene la velocidad de flujo de aire y O 2 constante, ajustar el vaporizador de isoflurano al 0,8 - 1,5% hasta un patrón de respiración óptima se alcanza. Una frecuencia respiratoria de 50 a 70 respiraciones por minuto se recomienda. </li><li> Mantener la temperatura corporal a 36-37 ° C durante el experimento mediante el empleo de un agua caliente (o alternativamente aire caliente) sistema de circulación. </li><li> Mantener los ojos del ratón húmedo con ungüento lubricante estéril ojo durante la medición. </li><li> Después de asegurar que el animalen el soporte de imágenes y las conexiones con el sistema de supervisión, mover el soporte hasta el centro de la 1 H / 19 F bobina de RF (que se coloca en el isocentro del imán escáner animal). </li><li> Ajuste de la posición del ratón de tal manera que la rodilla se encuentra dentro del isocentro del imán, ya sea con un método automatizado (por ejemplo, utilizando un láser de posicionamiento en combinación con un soporte de animales accionado por motor) o manualmente por el cálculo de la distancia del soporte necesita ser movido en el imán para alcanzar el isocentro. </li><li> Para confirmar la correcta colocación del animal en el escáner y la posterior planificación de la geometría de corte de imagen (es decir, tamaño, posición y rotación en el espacio), adquirir explorar imágenes en tres orientaciones estándar (axial, coronal, sagital) utilizando la imagen de resolución rápida y de bajo métodos de adquisición (por ejemplo TriPilot protocolo, que utiliza una secuencia de pulsos FLASH). </li><li> Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia 1 H (por ejemplo,. 400,1 MHz para 9,4 T) y a la frecuencia de resonancia F 19 (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y recepción de la señal. </li><li> Realizar los ajustes necesarios automáticas del sistema, incluyendo cuñas para ajustar la homogeneidad del campo magnético (por ejemplo ADJ_SHIM), los ajustes del sistema de frecuencia para sintonizar la RF a la frecuencia de Lamor el ratón (por ejemplo ADJ_SF) y la ganancia de referencia para ajustar la amplitud de RF ( por ejemplo ADJ_REFG). Todos estos parámetros son importantes para hacer que los campos magnéticos estáticos y variables (B 0, B 1) en la región de interés lo más homogénea posible. </li><li> Adquirir un segundo conjunto de imágenes Scout (como anteriormente) a lo largo de las tres orientaciones ortogonales, después de ajustar el campo de visión (FOV) de tal manera que los dos miembros inferiores are visible desde la pelvis hasta los pies (LxAxH = 50x25x25 mm). Estas imágenes sirven para planificar las orientaciones de los últimos scans 3D F 1 H / 19. </li><li> Establecer un protocolo TurboRARE 3D por 1 H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Factor RARE = 16 (. Aprox tiempo de exploración de 60 min). Ajustar FOV con la ayuda de las imágenes de scouts, inicie el escaneo (semáforo). </li><li> Carga de un solo pulso FID-secuencia con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Scan Editar y establecer núcleo a 19 F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas. </li><li> Iniciar la medición sin el registro de datos para mostrar una señal de RM en tiempo real mediante el uso de GSP (ir de configuración). Si la señal F 19 espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta un SIgnal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica con el fin de centrar el pico espectral F 19 a 0 Hz en la ventana de adquisición. Aplicar frecuencia básica y pulse Stop. Tenga en cuenta que el isoflurano utiliza como anestesia puede generar una señal de fondo. A 9,4 Tesla MRI del desplazamiento químico entre los 19 que contienen F-partículas y el isoflurano es de aproximadamente 1.800 Hz. Asegúrese de que el ancho de banda de excitación es menor que 3.600 Hz para evitar la emocionante junto con isoflurano las células F-19 marcadas o partículas. La frecuencia básica debe establecerse correctamente en la señal generada por las células F-19 marcadas. Alternativamente, otro método de la anestesia podría ser utilizado como el experimentador crea conveniente. </li><li> Clone (duplicar) el protocolo TurboRARE 3D desde el anterior análisis 1 H. Vaya a Edición Método y anule la selección de la ganancia automática de referencias (como el anterior). Set 19 F núcleo de Edit Scan. Cambiar la matriz de 128x64x64y el. RARAS Factor de por lo menos 40 (hasta 64) Para una mseg TR / TE 1000/6 y 64 promedios, el tiempo de ciclo es de aproximadamente 70 min. Ajuste la ganancia del receptor al 101 (caja de herramientas) e inicie el escaneo sin necesidad de ajustes adicionales utilizando GOP (ir pipeline). </li><li> Cuando los análisis terminado retraer el soporte de ratón desde el escáner de MR. Desconectar el ratón cuidadosamente del soporte. Si el ratón no se sacrifica para el análisis ex vivo (por ejemplo, la histología o la espectroscopia, ver más abajo) directamente después de las mediciones RM, vigilar de cerca hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Regulación de la temperatura del cuerpo se ve afectado por la anestesia, así que durante el proceso de recuperación, poner el ratón en una jaula separada que se coloca en una tibia de temperatura regulada almohadilla. Una vez que el ratón se ha recuperado totalmente de la anestesia, devolverlo a su jaula explotación ya la sala de animales. </li><li> Para superponer las 19 imágenes de F a H 1 imagenes, utilice el menú Ver opción en el mismo software (Paravison). La función Underlay se puede encontrar bajo correlativas. Guarde el documento de base, cargar la nueva imagen y destacar la capa F 19, definiendo un nuevo color de la tabla de consulta. Para discriminar entre los 19 F y 1 exploraciones H, alterar el umbral para el color seleccionado (corte tabla de consulta) de tal manera que la señal F 19 tendrá el color elegido y el fondo 1 H imagen permanecerá en escala de grises. Otros programas de post-procesamiento (por ejemplo, ImageJ) están disponibles para crear las 1 H / F 19 superposiciones de imágenes. </li><li> En caso de una cuantificación in vivo de la señal F 19 ser necesario, siga un protocolo simple cuantitativo como se ha descrito anteriormente 15,16. En breve, la cuantificación puede realizarse mediante la colocación de un tubo de referencia con una concentración conocida de PFCE-Emulsión dentro del FOV al lado del ratón. Tras la adquisición de las imágenes de RM, quantificar las intensidades de las señales 19 F usando región de interés (ROI) y comparar con la curva de calibración en vitro como se muestra en la Figura 2. </li></ol> 5. Nodo linfático Espectroscopia de Resonancia Magnética (MRS) <ol><li> Después de sacrificar el ratón, quite el ganglio linfático poplíteo y el lugar en un pequeño tubo de RMN de 5 mm y añadir 100 ml de 2% PFA. </li><li> Instalar una bobina F 19 espectroscopía (por ejemplo, una bobina toroidal) que tiene una abertura de al menos 5 mm para sujetar el tubo de RMN que contiene el ganglio linfático. </li><li> Colocar el tubo de RMN en el interior de la bobina y mover la bobina en el isocentro del imán. </li><li> Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia F 19 (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y la señalrecepción. </li><li> Establezca todos los parámetros calza dentro de la caja de herramientas Nivelación a 0 y pulse Aplicar. Normalmente no es necesario aplicar métodos Shimming ya que el volumen de la muestra es relativamente pequeña. Si una señal suficiente 19 F está disponible, los métodos automatizados se puede aplicar para la frecuencia calzando sistema, y la ganancia del receptor como se describió anteriormente. </li><li> Carga de un solo pulso secuencia FID con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Editar Scan y establecer el núcleo a 19 F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas. Establecer el número de promedios a 1. </li><li> Inicie la secuencia utilizando SGP. Si la señal F 19 espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta que una señal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica a fin de que la 19 F espeCtral pico está en el centro de la ventana de adquisición en 0 Hz y aplicar frecuencia básica. Ajuste el atenuador de pulso de nuevo para maximizar la señal, para llegar a 90 ° excitación. Cuando la señal es en la parada máximo de la máquina. </li><li> Establecer los promedios en el método de edición entre 64 y 256 (o más si es necesario, dependiendo de la señal) y comenzar la adquisición utilizando GOP. La señal detectada se correlaciona linealmente con el número de promedios. Durante cuantificación tener en cuenta que la señal detectada debe ser normalizado a uno promedio. Además, un estándar de calibración de una concentración conocida o una curva de calibración es necesario calcular el número de células a partir de la señal normalizada F 19 (Figura 2). </li><li> Una vez que la exploración haya terminado, retire la muestra, coloque la siguiente muestra y continúe con el paso 5.3. </li></ol>

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<li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li>
<li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).</li>
<li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaacke%2C+EM+%22Magnetic+resonance+imaging+physical+principles+and+sequence+design%22">Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design</a>. , John Wiley & Sons. (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Este método de emplear 19 F / 1 H RMN para seguir el desplazamiento de CC en el nodo de linfa ofrece la oportunidad de estudiar los patrones de migración de las células inmunes in vivo. Las células dendríticas son excelentes ejemplos de la rápida migración de las células inmunes que son capaces de maniobrar a través de las estructuras tridimensionales sin fuertemente adherido a sustratos específicos 17. Aunque la baja resolución espacial (rango de micras) de la técnica descrita ...

El rastreo de las células in vivo es un aspecto crucial en varios campos de la biomedicina. Para ello, las técnicas de imagen no invasivas que selectivamente puede localizar células en un período de tiempo son extremadamente valiosos. Antes del desarrollo de tres dimensiones de imágenes de resonancia magnética (MRI), el seguimiento de la migración de células inmunes se limitan a los análisis microscópicos o biopsias de tejidos. Seguimiento de la célula con la ayuda de resonancia magnética ha ganado la atención inmenso en los últimos años, no sólo para los inmunólogos que estudian el comportamiento celular inmune in vivo, sino también para los investigadores clínicos y de células madre. Durante mediados de los 90, los primeros estudios sobre el óxido de nanopartículas de hierro 1 inició una cascada de acontecimientos para que las células de seguimiento con IRM. Partículas de óxido de hierro acortar el tiempo de relajación MR (T2 *) de las células marcadas y por lo tanto causar el agotamiento de la señal en imágenes de RM. Partículas de óxido de hierro se han empleado para la etiqueta 2 macrófagos, p oligodendrocyterogenitors 3 y muchos otros tipos celulares. Algunas de estas partículas también han sido clínicamente aprobado por la FDA para el etiquetado de vacunas celulares en 4 pacientes con melanoma. Dado que in vivo o ex vivo etiquetado de las células con partículas de óxido de hierro se basa en un acortamiento de la señal * T2 y el segundo podría ser también provocada por in vivo relacionados con la susceptibilidad-T2 * efectos tales como hemorragias, micro depósitos de hierro, o burbujas de aire, podría ser difícil de identificar células marcadas in vivo de fondo otro T2 * extinciones de señal 5. En este artículo, se describe una técnica para el seguimiento de las células dendríticas (DC) in vivo mediante el empleo de 19 F / 1 H formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Esta tecnología de rastreo celular se introdujo en 2005 6, varios años después de las primeras aplicaciones reconocidas para 19 F en la RM se habían notificado 7. Una importante Advantage de 19 F sobre el etiquetado de óxido de hierro de células de partícula es la baja aparición biológica de 19 F en el tejido, lo que hace posible el seguimiento de las células de forma muy selectiva con imágenes básicamente libres de fondo-. Además, es posible superponer la señal de MR 19 F a partir de las células trasplantadas etiquetados con imágenes anatómicas obtenidas de RM convencional 1H. 19 F / 1 H RMN es por lo tanto considerablemente relevantes para los estudios que investigan la migración celular in vivo. Células estudiadas con este método se etiquetan con 19 F-partículas ricas. Perfluorocarbonos sintéticamente derivados (PFC) que consisten principalmente de carbono y átomos de flúor se utiliza comúnmente para preparar las partículas. Estos compuestos son insolubles en agua y deben ser emulsionado antes de la aplicación in vitro o in vivo. El tamaño habitual de las partículas de PFC que han sido empleados por otros grupos en vivo 19 F-RMN experimentos de seguimientooscila entre 100 nm y 245 nm 6,8-10. Sin embargo, hemos demostrado que la eficiencia en el etiquetado de las células dendríticas con perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) las partículas aumenta con el aumento del tamaño de partícula (&gt; 560 nm). 11

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> C57BL / 6 ratones </td><td> Charles River, Berlin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco </td><td> 21875-091 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0615 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 15630-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> PFA </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-281692 </td><td></td></tr><tr><td> Perfluoro-15-corona-5-éter </td><td> ChemPur </td><td> 391 -1996 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-68 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P5556 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri (35 x 10 mm) </td><td> VWR, Alemania </td><td> 391-1996 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ jeringas G </td><td> VWR, Alemania </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> Tamices de nylon de malla de células (100 micras) </td><td> VWR, Alemania </td><td> 734-0004 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de RMN </td><td> VWR, Alemania </td><td> 634-0461 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> FST </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubadora </td><td> Carpeta </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pequeños animales MR sistema </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td> 9.4T BioSpec 94 / USR 20,Paravision Adquisición y Procesamiento de Software </td></tr><tr><td> 1 H / F 19 de doble bobina de RF sintonizable volumen </td><td> Rapid Biomed, Würzburg, Alemania </td><td></td><td> 35 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud </td></tr><tr><td> 19 F bobina espectroscopia </td><td> en casa </td><td></td><td> sintonía / partido bobina de lazo, 4 vueltas, diámetro interno 5 mm, 10 mm de largo, dos condensadores de sintonización y la congruencia </td></tr><tr><td> Sistema de inhalación de isoflurano </td><td> Föhr Medical Instruments GmbH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monitoreo Animal sistema Modelo 1025 </td><td> SA Instruments Inc., Nueva York, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de las migraciones células dendríticas mediante resonancia 19f / 1h magnetic

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuos avances en las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética (RM) han mejorado en gran medida nuestra capacidad para estudiar los procesos fisiológicos o patológicos en los organismos vivos. Resonancia magnética también está demostrando ser una herramienta valiosa para la captura de las células trasplantadas in vivo. Iniciales estrategias de etiquetado celulares para uso MRI hecho de agentes de contraste que influyen en los tiempos de relajación MR (T1, T2, T2 *) y conducen a una mejora (T1) o agotamiento (T2 *) de señal en la que están presentes las células marcadas. T2 * Agentes de mejora tales como agentes ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO) se han empleado para estudiar la migración celular y algunos también han sido aprobados por la FDA para su aplicación clínica. Un inconveniente de los agentes de T2 * es la dificultad de distinguir la extinción de la señal creada por las células marcadas de otros artefactos, como coágulos de sangre, hemorragias micro o burbujas de aire. En este artículo se describe una nueva técnica para el seguimiento de las células in vivo queestá basada en el etiquetado de las células con flúor (19 F)-partículas ricas. Estas partículas se preparan mediante emulsión de perfluorocarbono (PFC) y compuestos entonces se utiliza para marcar células, que posteriormente se pueden obtener imágenes por resonancia magnética F 19. Ventajas importantes de PFC para el rastreo de células in vivo incluyen (i) la ausencia de carbono enlazado a 19 F in vivo, lo que proporciona entonces libres fondo-imágenes y completo de células selectivityand (ii) la posibilidad de cuantificar la señal de la célula por espectroscopía 19 F MR .

Dieciocho a veintiún horas después de la aplicación intracutánea, 19 F-etiquetados células dendríticas (DC) migran hacia el ganglio linfático poplíteo de drenaje. El movimiento de DC a través de los conductos linfáticos en el ganglio linfático de drenaje politeal puede ser apreciado por una superposición de las imágenes 1 H anatómicas con las imágenes 19 F CC (Figura 2A). Hemos reportado previamente en la migración de estas células in vivo, así como el impacto d...

El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor (<sup&gt; 19</sup&gt; Partículas F)-ricos, la aplicación in vivo de estas células, y para determinar el alcance de su migración a los ganglios linfáticos de drenaje con<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H RMN y<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en visualizar la migración de células dendríticas hacia el ganglio linfático drenante mediante imágenes por resonancia magnética con flúor no invasiva o IRM, en combinación con la IRM convencional con protones. Esto se logra primero preparando células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón y marcando las células completamente diferenciadas con partículas ricas en flúor. En una segunda etapa, las células marcadas con flúor se administran por vía intracutánea en las extremidades posteriores de un ratón, asegurando así la transmigración eficiente de las células administradas.A continuación, se realiza la imagen del área anatómica de interés mediante resonancia magnética de flúor y protón para monitorear la migración de las células dendríticas desde la piel hasta los ganglios linfáticos drenantes. En última instancia, la migración de las células dendríticas desde el área de aplicación hacia el ganglio linfático drenante puede visualizarse mediante resonancia magnética de flúor. La principal ventaja de este método frente a otras técnicas de rastreo celular, como aquellas que requieren nanopartículas de óxido de hierro, es que el flúor unido al carbono está prácticamente ausente en todos los organismos vivos.Esto produce imágenes completamente libres de fondo y una selectividad celular completa tras la aplicación de células marcadas con flúor in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología, como cuál es la influencia de candidatos moleculares en la migración de células dendríticas in vivo. Demostrando el método está Yulia Kovski, técnica, y Helma VIIs, científica senior de mi laboratorio, en el día 10 del cultivo de células dendríticas a partir de médula ósea.Activee las células dendríticas con LPS durante 24 horas. Etiquete las células dendríticas con partículas de perfluoro 15 crown cinco éter rico en flúor de un milimolar durante este tiempo también, para confirmar que las células dendríticas han sido etiquetadas con éxito, verifique las características físico-químicas de las células mediante citometría de flujo. Las células marcadas con flúor se muestran aquí como eventos rojos en el gráfico de dispersión hacia adelante y lateral, y las células no etiquetadas se muestran como eventos azules.Siguiente posición: coloque un ratón C57 negro seis en un sujeto y luego cargue una jeringa tuberculínica de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 26 y media con células dendríticas marcadas con fluorescencia en un volumen de 50 a 100 microlitros. Ahora inserte cuidadosamente la aguja en las capas superiores de la piel en cada una de las extremidades traseras del animal para administrar las células. Después de anestesiar al ratón, coloque al animal en posición prona sobre la camilla del escáner de RM para pequeños animales.Después de asegurar al animal en el soporte de imagen y las conexiones al sistema de monitoreo, mueva el soporte al centro de la bobina de RF de protones y flúor para confirmar la posición correcta del animal y del escáner, y posteriormente planificar la geometría del corte de imagen. Adquiera imágenes preliminares en tres orientaciones estándar utilizando métodos rápidos y de baja resolución para la adquisición de imágenes en el software del escáner de RM.Sintonice la bobina de RF a la frecuencia de resonancia del protón y a la frecuencia de resonancia del flúor. Utilice el monitor de sintonización del escáner de RM para animales para ajustar la impedancia característica de la bobina a 50 ohmios. A continuación, configure los ajustes necesarios de los sistemas automáticos, incluyendo el shim para ajustar finamente la homogeneidad del campo magnético, ajustes de frecuencia del sistema para sintonizar la RF a la frecuencia específica de LA del sistema de RM para protones y ganancia de referencia.Para ajustar la amplitud de RF, configure un protocolo turbo rare 3D para la exploración de protones, utilizando un TR de 1500 milisegundos y un TE de 53 milisegundos, una matriz de 400 por 200 por 200 y un factor rare de 16. Ajuste el campo de visión con la ayuda de las imágenes exploradoras. Luego inicie la exploración.Cargue una secuencia FID de pulso único con un TR de al menos 1000 milisegundos, luego abra la exploración de edición y configure el núcleo en flúor en el método de edición de la caja de herramientas. Deseleccione la ganancia de referencia automática utilizando el ajuste inicial. Inicie la medición sin grabar los datos para mostrar una señal de RM en tiempo real.Ajuste la frecuencia básica para centrar el pico espectral de flúor en cero hercios dentro de la ventana de adquisición. Luego seleccione, aplique la frecuencia básica y presione detener ahora. Clone el protocolo turbo rare 3D a partir del escaneo previo de protones.Vaya al método de edición y luego desactive la ganancia de referencia automática, tal como se mostró anteriormente en la edición del escaneo. Establezca el núcleo de flúor y luego cambie la matriz a 1 28 por 64 por 64 y el factor de rarefacción a al menos 40. Cuando finalicen los escaneos, retire el soporte del ratón del escáner de RM y utilice el menú de vista para superponer las imágenes de flúor sobre las imágenes de protones.Después de sacrificar el ratón, retire el ganglio linfático poplíteo de interés y colóquelo en un tubo de RMN de cinco milímetros que contenga 100 microlitros de PFA al 2%. A continuación, coloque el tubo dentro de una bobina de espectroscopía de flúor y mueva la bobina al centro ISO del imán. Sintonice la bobina de RF a la frecuencia de resonancia del flúor y luego, en el monitor de sintonización del escáner de RM para animales, iguale la impedancia característica de la bobina a 50 ohmios dentro de la caja de herramientas de ajuste del campo magnético.Establezca todos los parámetros de shim en cero y pulse aplicar. A continuación, cargue una secuencia FID de pulso único con un TR de al menos 1000 milisegundos. Abra edición de escaneo y configure el núcleo en flúor.Ahora, utilizando la configuración automática, inicie la secuencia, ajuste la frecuencia básica de modo que el pico espectral del flúor se sitúe en el centro de la ventana de adquisición a cero hercios y aplique la frecuencia básica. Luego, ajuste nuevamente el atenuador de impulsos para maximizar la señal y alcanzar la excitación de 90 grados. Cuando la señal esté en su máximo, presione detener.Finalmente, en el método de edición, ajuste los promedios entre 64 y 256 según la señal, y luego utilice la canalización go. Inicie la adquisición entre 18 y 21 horas después de la aplicación intradérmica. Las células dendríticas marcadas con flúor migran hacia el ganglio linfático poplíteo drenante.El movimiento de las células dendríticas a través de los conductos linfáticos hacia el ganglio linfático drenante puede observarse superponiendo las imágenes anatómicas de protones con las células dendríticas de flúor. En las imágenes, las células dendríticas se muestran como una señal de RM de flúor en rojo, mientras que los ganglios linfáticos y los conductos linfáticos se muestran en la imagen anatómica de RM de protones en escala de grises. Para cuantificar el grado de migración de las células dendríticas hacia los ganglios linfáticos drenantes, se extraen los ganglios linfáticos y se realiza espectroscopía de RM de flúor, como se acaba de demostrar; cuando la señal de flúor obtenida de cada ganglio linfático se compara con la señal de flúor obtenida de diferentes números de células dendríticas marcadas con partículas de perfluoro-15-crown-5 éter, tal como lo ilustra esta curva de calibración, puede deducirse el número de células dendríticas marcadas con flúor que llegan al ganglio linfático drenante en este experimento representativo.Se puede estimar que 7,5 veces 10 a la cuarta células dendríticas que no fueron cargadas con antígeno llegaron al ganglio linfático izquierdo, mientras que 3,6 veces 10 a la quinta células dendríticas cargadas con antígeno alcanzaron el ganglio linfático derecho. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la migración de células inmunitarias durante condiciones normales, también puede utilizarse en modelos animales, como los de enfermedades autoinmunes. Además, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el campo de la terapia contra el cáncer.Cualquier diana molecular identificada puede utilizarse para manipular las células dendríticas en la terapia de tumores.

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Research

Investigación

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Aprende a rastrear la migración de células dendríticas mediante resonancia magnética de fluor-19 combinada con protones en modelos murinos. Este método no invasivo permite visualizar el movimiento celular hacia los ganglios linfáticos con imágenes libres de fondo.

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

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