Name: Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a aislar miofibras esqueléticas de embriones y larvas de Danio rerio para estudiar la morfología y localización proteica subcelular mediante inmunofluorescencia. Este método permite analizar fibras musculares individuales con mayor detalle que los estudios de embriones completos.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, y William Telfer) que contribuyeron al desarrollo de la técnica y para la producción del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Instituto Taubman, el Departamento de Pediatría de la Universidad de Michigan, y en parte de subvenciones de la Asociación de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) y los Institutos Nacionales de Salud (JJD 1K08AR054835).

1. Preparación de poli-L-lisina recubierto cubreobjetos (Tiempo: 1 hr) Cubreobjetos de recubrimiento permite una rápida sedimentación de miofibras y adhesión. Esto se puede realizar durante la etapa de disociación del aislamiento de miofibras (paso 2 a continuación). <ol><li> Cortar y colocar Parafilm en la parte inferior de una placa de 60 mm de Petri (de cualquier marca). </li><li> Coloca los resbalones de la cubierta de vidrio de microscopio (12 mm de diámetro) en Parafilm en un 60 mm placa de cultivo de tejidos o colocarlos individualmente en pocillos individuales de placas de 24 pocillos. </li></ol> Nota 1: Estos pequeños cubreobjetos redondos ayudan a concentrarse miofibras números y reducir el uso de exceso de anticuerpo. Nota 2: Otros cubreobjetos tamaño trabajarán, sin embargo, tendrán que ajustarse en consecuencia los volúmenes de los reactivos y de los embriones utilizados. <ol start="3"><li> Pipeta de 50-200 l de solución de poli-L-lisina (0,01%) en cada vidrio de cubierta en la placa de Petri. </li><li> Deje que los portaobjetos para sentarse por lo menos una hour a 37 ° C. Incubaciones más largas no influirán negativamente en los resultados. </li><li> Retire la solución de poli-L-lisina de la cubierta de vidrio y se lava dos veces con un mínimo de 100 l de PBS 1x. </li><li> Permitir cubreobjetos se sequen. </li><li> Cubreobjetos ya están listos para las miofibrillas. </li></ol> Nota 3: Para asegurar la esterilidad, de recubrimiento se puede hacer en una campana y en cubreobjetos tratados en autoclave. Nota 4: Mantener el 60 mm placa de Petri con Parafilm en la parte inferior. Esta configuración se utilizará durante miofibra galvanoplastia y immunolabeling (posteriores pasos). Alternativa 1: En lugar de cubreobjetos de revestimiento inmediatamente antes del uso, un cubreobjetos de papel estucado se puede utilizar. Un plato de 60 mm de Petri que contiene un mínimo de 2 ml de poli-L-lisina se puede almacenar a 4 ° C que contiene numerosos cubreobjetos. Con esta alternativa comience en el paso 1.5 para procesar los cubreobjetos de las miofibrillas. Alternativa 2: También cubreobjetos capa de poli-L-ornitina. Tla suya es más mano de obra, pero es útil para el cultivo a largo plazo porque cubreobjetos recubiertos con poli-L-ornitina puede ser tratado UV. Con el tratamiento UV y una técnica estéril cuidado miofibras en vivo típicamente se pueden mantener en cultivo de 4-7 días. 2. Disociación de embriones de pez cebra y Plating de miofibras (Tiempo: 1 a 3 horas) Nota: el protocolo estándar se aplica mejor a 3 dpf (días después de la fecundación) embriones. <ol><li> Transferencia de embriones de pez cebra en un tubo de centrífuga de 1,5 ml estándar y eliminar la mayor cantidad de agua el exceso de pescado como sea posible. Por lo general, se pueden utilizar 10 a 20 embriones por tubo, aunque menos. El uso de más de 20-25 embriones a menudo resulta en una preparación de densidad excesiva. <ol><li> Eliminar chorions antes de la disociación, usando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, la eliminación corion química se consigue con un 10-15 min tratamiento con pronasa. Por lo general, sólo es necesaria la eliminación previa del corion cuando la confirmación previa de un mutSe requiere fenotipo hormiga o morfología, o cuando se utilizan etapas donde los embriones son, naturalmente, nacido de su corion. </li></ol></li><li> Añadir 900 l de CO 2 medios de comunicación independientes para el tubo que contiene los embriones. </li><li> Añadir 100 l de colagenasa de tipo II, una concentración final de 3,125 mg / ml (solución madre colagenasa a 31,25 mg / ml diluida en 1X PBS) para comenzar la disociación. La colagenasa IV también se puede utilizar para la disociación. </li><li> Girar embriones en un agitador orbital, y se tritura cada 30 min a temperatura ambiente usando un P1000 Pipetman para la trituración. </li></ol> Nota 2: Es importante vigilar cuidadosamente la disociación de embriones; sobre o debajo de la disociación (sobre todo mayores) son las razones más comunes para el fracaso del protocolo. Los tiempos para la digestión pueden variar dependiendo de la intensidad de la trituración, el número de embriones por tubo, y la edad de los embriones. También es a menudo menos (en comparación con los tipos salvajes) para embriones de los mutantes del músculo esquelético. Nota3: tiempo de digestión promedio por edad del embrión: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 horas, 3 dpf = 2 h, y 4 dpf = 2-2,5 horas. <ol start="5"><li> Detener la digestión cuando no hay embriones enteros son visibles, todavía trozos sólidos siguen siendo visibles - esto es esencial para prevenir overdigestion. </li><li> Tubos centrífuga con embriones disociadas a 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos a las células de pellets. </li><li> Aspirar el sobrenadante de células sedimentadas y lavar 2 veces con CO 2 medios de comunicación independientes. </li><li> Añadir CO fresco 2 medios de comunicación independientes para volver a suspender las células. 1 ml se utiliza normalmente para preparaciones de 10-20 embriones. El volumen se puede escalar basada en el número de embriones. </li><li> Con una pipeta P1000, pasar la suspensión del embrión a través de un filtro de 70 micras. Esto ayuda a eliminar los residuos no deseados de la preparación. </li></ol> Nota 4: suspensión de embriones se puede filtrar una segunda vez a través de un filtro de 40 micras para eliminar adicionalmente los desechos no deseados. A partir de una doble filtración, la recuperación es aproximadam ente 800 l de un volumen inicial de 1 ml. <ol start="10"><li> Añadir aproximadamente 50-100 l de suspensión de miofibras a cada cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina. </li></ol> Nota 5: Realice el paso 2.9 en las placas de Petri con Parafilm en la parte inferior, previamente preparado. El Parafilm mantiene la suspensión miofibra escurra los cubreobjetos recubiertos. Mantenga placas Petri cubiertas para evitar la evaporación. <ol start="11"><li> Permitir miofibras se asienten aproximadamente 1 hr en los cubreobjetos recubiertos a temperatura ambiente. </li></ol> Nota 6: miofibras comenzarán a instalarse dentro de 5-10 min. Sin embargo, para un buen agarre miofibra, se recomienda un mínimo de 1 hora (1-2 horas). Permitir que las miofibrillas se asienten durante más tiempo no dañará la preparación. Para incubaciones más largas (incluyendo durante la noche), los antibióticos pueden ser añadidos a los medios de comunicación. Con antibióticos y técnica estéril cultivos vivos normalmente se pueden mantener durante 1-2 días. <ol start="12"><li> Vivo myofibers se puede observar en este punto. Miofibrillas de embriones 2 DPF y más tarde se verá como células estriadas y alargadas (Figura 1). En este punto, las miofibras ya están listas para análisis en vivo o para immunolabeling. </li></ol> Nota 7: El músculo esquelético de 1 fdd embriones no platear fibras alargadas y claramente estriadas. En cambio, las grandes myoballs son visibles. Además, durante la fase de granulación mensaje de disociación (paso 2.6), 1 dpf myoballs necesitan ser centrifuga durante un mínimo de 8 minutos a 5000 xg para obtener un pellet. Para el análisis de los embriones en esta etapa, se recomienda utilizar la línea transgénica que expresa EGFP específicamente en el músculo esquelético 23. Esto permitirá la identificación de las células de origen muscular en comparación con otras fuentes. 3. Fluorescencia inmunotinción de disociadas de pez cebra miofibras (Tiempo: aproximadamente 1 día) 3.1. Immunolabeling <ol><li> Retire una parte demedios de miofibras adheridas a la cubreobjetos recubierto </li><li> Fijar las células utilizando paraformaldehído al 4% o metanol. Para PFA, retire ½ el volumen de los medios de comunicación y reemplazar con la misma cantidad de PFA. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente, a continuación, extraiga el volumen total, reemplace con 50-100 l de PFA, y fijar, por una suma adicional de 10 min. Para la fijación de alcohol, metanol enfriado con hielo o acetona se puede aplicar a 4 º C durante 10 min o 5 min, respectivamente. </li><li> Lávese las miofibrillas al menos 3 a 5 veces con 1x PBS o 1x PBS más 0,1% de Tween. El volumen medio de lavado es de 50 a 100 l por cubreobjetos. </li><li> Añadir la solución de bloqueo a las miofibrillas (solución de trabajo) e incubar 20-60 minutos a temperatura ambiente. El bloqueo de solución variará dependiendo de los anticuerpos primarios y secundarios. Los dos más comunes utilizados en el laboratorio son (1) 1x PBS, 2 mg / ml de BSA, 1% de suero de ovejas, 0,25% de Triton X-100 final y (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) y 5% de suero de oveja / cabra. </li><li> Eliminar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo primario diluido en cualquiera de bsolución de PBS o de bloqueo. Incubar miofibras la noche a 4 ° C. Asegúrese de que sea Parafilm o envuelva en Saran Wrap la placa de Petri que contiene los cubreobjetos miofibras cargada recubiertas con anticuerpos. Pequeños trozos de toalla de papel humedecida se pueden añadir para crear una cámara humidificada. </li><li> Eliminar el anticuerpo primario de cubreobjetos y lavar cubreobjetos 3-5x por 5 min con PBS o solución de bloqueo. </li><li> Añadir anticuerpo secundario a una concentración apropiada diluida en 1X PBS o solución de bloqueo durante 1-2 horas a TA. </li><li> Se quita el anticuerpo secundario y lavar miofibras 3-5x en PBS durante 5 min cada uno a temperatura ambiente. </li></ol> 3.2. Cubreobjetos de montaje <ol start="9"><li> Aplicar 1-2 gotas de antifade reactivo a un portaobjetos de microscopio. </li><li> Pick-up con cuidado el cubreobjetos recubierto y immunolabled utilizando fórceps y lugar (miofibrillas hacia abajo) el cubreobjetos sobre la antifade reactivo en el portaobjetos de un microscopio. </li></ol> Nota 1: La atención a la orientación de la ccubreobjetos oated es crítica. <ol start="11"><li> Coloque 1-2 Kimwipes sobre una superficie sólida duro. Invertir rápidamente la diapositiva con los cubreobjetos recubiertos de descanso en la antifade reactivo y colocarlo (cubreobjetos hacia abajo) en la Kimwipes. </li><li> Aplique una leve presión sobre las esquinas del portaobjetos para retirar el exceso Antifade y formar un sello hermético entre el portaobjetos y cubreobjetos </li><li> Permitir la Antifade restante secar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, y luego las fibras musculares están listos para la imagen (Figuras 2 A y B) o se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 4. Celular en vivo Imagen de calcio Usando GCaMP3 Experimentos con células vivas pueden ser realizados en fibras musculares antes de la fijación (siguientes paso 2,10). El siguiente protocolo describe imágenes en vivo en miofibras que expresan GCaMP3 24, un indicador de calcio codificado genéticamente, expresado por el promotor pez cebra específica del músculo esquelético-α actina (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica se puede adaptar fácilmente para utilizar colorantes indicadores de calcio tales como Fura-2. <ol><li> Inyectar embriones con pSKM: GCaMP3 construir en la etapa de 1-2 células </li><li> A las 3 dpf, recoger larvas y preparar las miofibrillas como se describe en las secciones 1 y 2. Permitir miofibras que se adhieran durante un mínimo de 1 hora. Para esta técnica, se requiere la preparación de cubreobjetos en placas de 24 pocillos. </li><li> Retire con cuidado el exceso de medios de comunicación, y añadir 300 l de fresco CO 2 medios de comunicación independientes a TA. </li><li> Observar las células bajo un microscopio invertido. Miofibras GCaMP3 positivos deben ser visibles bajo fluorescencia verde. </li><li> Preparar la cámara para la grabación, si se desea. </li><li> Prepare una solución de cafeína 30 mM en CO 2 medios de comunicación independientes. Para estimular las células, pipetear suavemente 300 l de solución de cafeína en el pozo con una lupa. Dentro de 5-10 segundos, miofibras GCaMP positivos deben responder a la cafeína con un rápido aumento de la fluorescencia (Figura 3). Myofibres también pueden contraer. Es de destacar que la cafeína induce la liberación de calcio de los almacenes de retículo sarcoplásmico 25. Otros agentes, como KCl 26 y rianodina 4, se pueden utilizar para estudiar la liberación de calcio inducible. </li></ol>

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<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio de desarrollo de los músculos y la función en vivo 25,27,28. Ellos también se han convertido en un activo valioso para el modelado de enfermedades musculares humanas 14,15,20,29. Aunque se han dado grandes pasos para avanzar en el uso y aplicación de pez cebra para el estudio de la función muscular y la enfermedad del músculo, hay una necesidad crítica constante para desarrollar herramientas que permitan an...

El músculo esquelético es un tejido altamente especializado responsable de generar las fuerzas contráctiles necesarias para la motilidad. La contracción se inicia a través de un proceso conocido como excitación-contracción (CE) de acoplamiento que convierte las señales eléctricas a la liberación de calcio desde las reservas intracelulares 1,2. La liberación de calcio intracelular activa el sarcómero se acorte y generar fuerza. Los numerosos componentes específicos de la maquinaria molecular responsable de mediar la transmisión unión neuromuscular 3, acoplamiento CE 4,5, y la actina-miosina contracciones dependientes 6 continúan siendo objeto de una intensa investigación en curso. Además, las proteínas que estabilizan la membrana muscular durante 7,8 contracción y que median la señalización entre la miofibras y la matriz extracelular 7,9 se han identificado y estudiado en gran detalle. Las mutaciones en un número de genes importantes para la estructura de un músculoND función se han identificado como causas de enfermedades del músculo esquelético humanos ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Estas enfermedades, que se clasifican en términos generales como miopatías esqueléticas y distrofias musculares basados ​​en las características clínicas e histopatológicas, se asocian a debilidad muscular, incapacidad permanente y 10,11 mortalidad temprana. El pez cebra ha demostrado ser un sistema excelente para modelar y estudiar las enfermedades del músculo esquelético humanos 8,12,13. Se ha empleado para validar nuevas mutaciones del gen 8, definir nuevos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad 14,15, e identificar nuevos enfoques terapéuticos 15,16. El poder del pez cebra para el estudio de la enfermedad de músculo humano se refiere a la gran cantidad de el rápido desarrollo de la estructura muscular y la función, la claridad óptica del embrión de pez cebra, y la facilidad de manipulación genética y farmacológica de la cebra el desarrollo de la descendencia,pescado 17. Nosotros y otros 12,18,19 hemos desarrollado recientemente una técnica simple para el aislamiento rápido y eficiente de las miofibras del pez cebra en desarrollo. Esta metodología ha permitido el examen de las miofibras en mayor detalle que puede ser proporcionada por el análisis de embriones conjunto. La técnica se ha explotado para la caracterización de la proteína de localización subcelular 20, así como para la identificación de importantes características histopatológicas como parte de los estudios de validación en modelos de enfermedad de nuevo desarrollo 21. Además, las miofibras aisladas, además, se pueden usar para formación de imágenes en vivo y para los estudios electrofisiológicos 22, técnicas que permiten la interrogación de los aspectos clave de la función muscular. El protocolo específico para el aislamiento de miofibras, junto con dos ejemplos de experimentos analíticos posteriores, se detalla en las partes restantes de este manuscrito.

<table><tbody><tr><td>placa de cultivo de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Medio independiente</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Worthington Biochemical</td><td></td><td>LS004186 Lote 41H12764</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 8%</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold reactivo antidecoloración</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&alfa;-actinina</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anticuerpo flúor</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de preparativos disociadas

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

El pez cebra ha demostrado ser un sistema modelo valioso para la exploración de la función del músculo esquelético y para el estudio de enfermedades musculares humanas. A pesar de las muchas ventajas que ofrece el análisis in vivo de los músculos esqueléticos en el pez cebra, visualizando el complejo y finamente estructurada entorno proteína responsable de la función muscular, especialmente en los embriones en su conjunto, puede ser problemático. Este obstáculo se deriva del pequeño tamaño del músculo esquelético pez cebra (60 m) y el tamaño aún más pequeño del sarcómero. Aquí describimos y demostrar un método sencillo y rápido para el aislamiento de miofibras esqueléticas a partir de embriones de pez cebra y larvas. También se incluyen los protocolos que muestran técnicas de correos de preparación útiles para el análisis de la estructura y la función muscular. Concretamente, se detalla la localización inmunocitoquímica posterior de las proteínas del músculo esquelético y el análisis cualitativo de la liberación de calcio estimulado a través de imágenes de calcio de células vivas. En general, este videoartículo proporciona un método sencillo y eficiente para el aislamiento y caracterización de miofibras esqueléticas de pez cebra, una técnica que proporciona un conducto para estudios posteriores miríada de estructura y la función muscular.

Inmunomarcaje fluorescente de miofibras (Figura 2) Las imágenes que muestra un patrón marcado fluorescente que se espera de las miofibrillas inmunotiñeron después del aislamiento y de las planchas de éxito. Las fibras musculares se han etiquetado con cualquier anti-receptor de rianodina (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticuerpos, y revelar la inmunotinción de la tríada y la banda Z, respectivamente. Los an...

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar de manera eficiente fibras musculares esqueléticas de peces cebra embrionarios y larvales. Esto se logra primero preparando cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina; luego, entre uno y cuatro días posteriores a la fertilización, se disocian embriones de pez cebra. A continuación, las fibras miológicas aisladas de los embriones disociados se siembran sobre los cubreobjetos de polilisina.Finalmente, las fibras musculares se fijan, tiñen e imaginan para el análisis de las proteínas musculares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la localización subcelular de las proteínas musculares mediante microscopía de inmunofluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el análisis de embriones completos es que permite estudiar la morfología y fisiología de fibras musculares individuales con mayor detalle.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo muscular, como aquellas relacionadas con la localización proteica subcelular, y puede combinarse con imágenes de calcio en células vivas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la validación de modelos de pez cebra de enfermedades musculares, ya que puede utilizarse para visualizar anomalías estructurales patognomónicas asociadas con enfermedades humanas. También puede emplearse para ayudar a identificar nuevos aspectos de las enfermedades musculares.La patogénesis mediante este método puede proporcionar información sobre la estructura y función muscular. Asimismo, puede aplicarse a otros estudios, como las enfermedades del músculo esquelético humano. Para prepararse para la disociación de embriones de pez cebra, prepare cubreobjetos cortando y colocando parafina en el fondo de una placa de Petri de 60 milímetros.Luego, coloque cubreobjetos de vidrio sobre el parfum y agregue mediante pipeta de 50 a 200 microlitros de solución de polilisina sobre cada cubreobjeto. Incube los cubreobjetos a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de eliminar la solución de polilisina y lavarlos dos veces con 100 microlitros de PBS. Deje secar los cubreobjetos y luego guárdelos en un recipiente cubierto.Para la disociación de embriones. Transfiera embriones de pez cebra de 10 a 23 días post-fecundación a un tubo estándar de centrífuga de 1,5 mililitros y elimine la mayor cantidad posible de agua excedente para peces. Pipetee 900 microlitros de medio independiente de dióxido de carbono al tubo.Luego, agregue 100 microlitros de colagenasa al 3,125 miligramos por mililitro, solución dos o cuatro, para iniciar la disociación. Incube los embriones en un agitador orbital a temperatura ambiente y, cada 30 minutos, utilice una pipeta P1000 para resuspender la muestra con el fin de prevenir una digestión excesiva cuando no sean visibles embriones completos, pero aún haya fragmentos sólidos. Detenga la reacción centrifugando las muestras a 0,8-2,3 G durante tres a cinco minutos.Elimine el sobrenadante y lave dos veces con medio independiente de dióxido de carbono. Pase la suspensión a través de un filtro de 70 micrómetros para eliminar los restos celulares, depositando aproximadamente entre 50 y 100 microlitros de la suspensión de miofibras en cada cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Permita que las miofibras sedimenten durante una hora a temperatura ambiente, después de fijarlas y etiquetarlas inmunológicamente según el protocolo descrito en el texto.Coloque las laminillas aplicando primero una o dos gotas de reactivo Antifa sobre una portaobjetos. Utilice pinzas para tomar cuidadosamente una laminilla, inviértala y colóquela sobre las gotas de reactivo antidesvanecimiento en la portaobjetos. A continuación, coloque una o dos toallillas sobre una superficie dura y sólida e invierta rápidamente la portaobjetos sobre las toallillas.Aplique presión ligera sobre las esquinas del portaobjetos para eliminar el exceso de reactivo Antifa y formar un sello hermético entre el portaobjetos y la cubreobjetos. Deje secar los portaobjetos durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adquisición de imágenes o guárdelos a cuatro grados Celsius. Se muestran aquí, las miofibras marcadas inmunofluorescentemente contra el receptor anódino y la alfa actinina revelan el triad y la zand, respectivamente.Hemos utilizado fibras miopáticas aisladas en estudios previos para determinar la localización subcelular de proteínas musculares. Para estudiar la localización de transgenes quiméricos expresados y definir parámetros específicos de las fibras miopáticas, incluido el tamaño. Esta figura demuestra la liberación normal de calcio inducida por cafeína en fibras miopáticas que expresan el constructo PSKM GCaMP tres.La técnica descrita en el protocolo escrito puede utilizarse para investigar el acoplamiento excitación-contracción mediante imágenes en vivo. Tras seguir este procedimiento, pueden realizarse otros métodos como la imagen de calcio en vivo con el fin de responder preguntas adicionales, tales como, ¿existen defectos en el acoplamiento excitación-contracción tras su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de enfermedades musculares exploraran estudios de validación de genes recién identificados asociados a enfermedades musculares y determinaran nuevos aspectos de la patogénesis de las enfermedades musculares.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el FBS leve individual de los embriones de pez cebra.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra.  Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

El análisis de elementos finitos es una herramienta de uso frecuente para investigar el rendimiento mecánico de estructuras bajo carga. Aquí aplicamos su uso para modelar la biomecánica de la mandíbula del pez cebra.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

El presente protocolo describe el aislamiento agudo de células viables del músculo liso cardíaco y vascular de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios (Danio rerio), adecuados para estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aprende a aislar miofibras esqueléticas de embriones y larvas de Danio rerio para estudiar la morfología y localización proteica subcelular mediante inmunofluorescencia. Este método permite analizar fibras musculares individuales con mayor detalle que los estudios de embriones completos.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

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