Name: Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a generar plantillas de ADN de alta calidad mediante ChIP-seq para identificar regiones de unión de proteínas en el genoma. Este método permite estudiar interacciones proteína-ADN en líneas celulares y tejidos.

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El trabajo es apoyado por una concesión del Instituto de Desarrollo del Hospital de Niños de Filadelfia.

1. Cross-link cromatina <ol><li> Se cultivan las células en placas de cultivo celular 100x20mm. La cantidad de células puede variar de 1 a 10 millones de células por plato dependiendo del tipo de célula. Aproximadamente 2 millones de células es suficiente para una inmunoprecipitación. </li><li> Células Cross-link en el 1% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional. </li><li> Se inactiva la reticulación mediante la adición de una concentración final de 125 mM de glicina y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) dos veces, se decanta PBS, y a continuación, añadir 0,2 ml de PBS. </li><li> Células de la cosecha con un rascador de células de plástico en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar las células a 2000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en tampón de lisis (SDS al 1% de SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,1) para lisado de células enteras o mantenerlos como una pastilla para la extracción nuclear. </li><li> Las células se pueden guardar a -80 ° C o se puede proceder immediately con ultrasonidos. </li></ol> 2. Prepare Núcleos (Continúe con el paso 3.5 para Todo el lisado celular) <ol><li> Suplemento Tampón de Lisis Celular (TUBOS 5 mM, pH 8,0, 85 mM de KCl, 0,5% de NP-40) con 1X inhibidor de la proteinasa cada experimento. </li><li> Resuspender el sedimento celular descongelado en aproximadamente 10 veces el volumen de pellets con Tampón de Lisis Celular. </li><li> Dounce-homogeneizar 10 veces con mano de mortero y luego se incuban en hielo durante 10 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 4000 rpm durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y guardar pellet nuclear. </li></ol> 3. Sonicación * <ol><li> Calentar SDS tampón de lisis y la cantidad de suplemento de tampón para ser utilizado con el inhibidor de proteinasa. </li><li> Resuspender el sedimento nuclear en SDS tampón de lisis (aproximadamente 0,5 ml de tampón por 1 a 10.000.000 células) </li><li> Incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Añadir alícuotas de 0,5 ml de las muestras a tubos de microcentrífuga. </li><li> Someter a ultrasonidos en hielo usando Misonix ultrasonidos con 30 segundos encendido y 45 segundosbajar en un ajuste de amplitud de 2. Número de ciclos para el tamaño ideal fragmento puede ser determinada por tratando primero a cabo varios números de ciclos (por ejemplo 2, 4, 8, 12, 16, y 20 o más ciclos). Una marca diferente de aparato de ultrasonidos puede utilizarse, sin embargo, las condiciones pueden variar. La experimentación con el número de ciclos y la cantidad de tiempo de encendido y apagado deben llevarse a cabo con el fin de determinar las condiciones ideales. </li><li> Recoge 20 l de cada muestra para comprobar los resultados de sonicación y hacer cuantificación. El resto de la muestra puede ser almacenada a -80 ° C. </li><li> Se diluye la 20 l de muestra mediante la adición de 30 l de 0,1 X tampón TE. </li><li> Tratar la muestra con 1 l de RNasa A a 37 ° C durante 1 hr a continuación, añadir 1 l de proteinasa K y se incuba a 62 ° C durante 2 horas. </li><li> Ejecutar 20 l de la muestra en un gel de agarosa al 2%. </li><li> Purificar la cantidad restante de la muestra con el kit de purificación de PCR QIAquick entonces cuantificar utilizando espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> * Para ChI nativaP, microccocal la digestión con nucleasa puede usarse alternativamente para cortar el ADN. 4. Cuentas bloque de agarosa * <ol><li> Si los granos ya están bloqueados, vaya al paso 5.1. </li><li> Utilice una proteína o proteína G agarosa. Para 5 inmunoprecipitaciones (IPs), utilice 600 l de 50% de suspensión de perlas (300 l sedimento de perlas) </li><li> Para lavar las perlas, girar hacia abajo a 800 rpm durante 1 min a 4 ° C y desechar el sobrenadante. Añadir un poco más de 2 ml de tampón de dilución de chip (0,01% de SDS, 1,2 mM de EDTA, 167 mM de NaCl, 1,1% de Triton X-100, Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1) y mezclar lentamente invirtiendo el tubo 10 veces. Girar de nuevo a 800 rpm durante 1 min a 4 ° C y desechar el sobrenadante. Repita el lavado 2 veces más. </li><li> Bloque perlas por rotación a 4 º C durante la noche en solución de bloqueo. Consulte la Tabla 1 para la receta de la solución de bloqueo. </li></ol> 5. Cromatina Pre-clear <ol><li> Thaw ultrasonidos cromatina en hielo. </li><li> Centrifugar a 12.000 rpm fo 10 min a 4 ° C y luego se puso en hielo inmediatamente para eliminar el SDS (blanco pellet). </li><li> Recoger el sobrenadante, deseche pellet y combinar las muestras si es necesario. </li><li> Sacar las cantidades necesarias para el experimento sobre la base de cálculos (1-10 ug de la cromatina por IP). </li><li> Diluir 10 veces la cromatina en el tampón de dilución chip complementado con inhibidor de la proteinasa. </li><li> Añadir 100 l de cuentas bloqueadas por IP. </li><li> Girar a 4 ° C durante 1 hora. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol><li> Centrifugar las muestras a 800 rpm durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Decantar el sobrenadante a 800 rpm durante 1 min y la transferencia a otro tubo limpio. </li><li> Guardar 20 l del sobrenadante, para servir como el control de entrada, a -20 ° C. </li><li> Alícuota de la cromatina en el número de direcciones IP que se harán en el experimento. </li><li> Añadir 2 g de anticuerpo por ug 1-10 de la cromatina a cada muestra. </li><li> Incubar toda la noche 4 º C con rotación. </li><li> Añadir 100 l de cuentas bloqueadas a cada muestra IP. </li><li> Incubar durante 1 hora a 4 ° C con rotación. </li><li> Pellet las perlas por hilatura hacia abajo a 800 rpm durante 1 min y desechar tanto del sobrenadante como sea posible. </li><li> Lávese las cuentas una vez con sal baja Inmune tampón de lavado Complex. Añadir 1 ml de tampón a cada tubo; girar a temperatura ambiente durante 5-8 min; girar hacia abajo a 800 rpm durante 1 min, a continuación, eliminar el sobrenadante. Repetir el lavado una vez con sal de alta Inmune tampón de lavado y el tampón de lavado Complejo complejo inmunológico LiCl y dos veces con tampón TE para un total de 5 lavados (Tabla 2). </li></ol> 7. Elución <ol><li> Descongelar las muestras de entrada a partir del día anterior a procesar con los eluyentes. </li><li> Hacer elución Tampón A nuevo (Tabla 3). </li><li> Hacer una mezcla maestra de suficiente tampón de elución necesario para IPs y muestras de control de entrada más 1-2 muestras adicionales. </li><li> Añadir 100 l de tampón de elución a cada muestra de IP e incubar a temperatura ambiente durante 15 mcon rotación. </li><li> Centrifugar a 800 rpm durante 1 min y añadir sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Añadir otra 100 l de tampón de elución a cada tubo de bolas y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación. </li><li> Vortex durante 15 segundos después de la incubación; centrifugar a 5.000 rpm durante 1 min, a continuación, combinar el sobrenadante con el sobrenadante de la primera elución. (Asegúrese de que no existen sobrantes cuentas en los sobrenadantes. Si no está seguro, la desaceleración sobrenadante de nuevo a 5.000 rpm durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. </li><li> Añadir 180 l de tampón de elución al 20 l de muestras de control de entrada. </li></ol> 8. Cross-link inversa <ol><li> Para los 200 l de eluyentes y controles de entrada, agregue 8 l de 5 M NaCl. </li><li> Tubos sello con parafilm y se incuba en un baño de agua a 65 ° C durante la noche. </li></ol> 9. Purificación de ADN <ol><li> Tratar a cada muestra con 1 l de RNasa A durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Añadir 4 μl de EDTA 0,5 M, 8 l 1 M Tris-HCl, la mezcla, a continuación, añadir 1 l de proteinasa K a cada muestra y se incuba a 45 ° C durante 2 horas. </li><li> Purificar las muestras usando kit de purificación QIAquick PCR. Las muestras pueden guardarse a -20 ° C y verificación PCR se puede hacer en una fecha posterior. </li></ol> * Alternativamente, perlas magnéticas chip-grado se pueden utilizar en lugar de agarosa para la porción de inmunoprecipitación. 10. Cheque PCR <ol><li> Para la comprobación de PCR, use cebadores para las regiones que se sabe están obligados por la proteína de interés. Asimismo, el uso cebadores para las regiones no vinculantes como controles negativos. </li><li> Mezcle los reactivos para la reacción. Diluir la muestra de entrada a 1:100 (Tabla 3). </li><li> Ejecutar reacción. Programa de PCR: </li></ol> Paso 1: 94 ° C 3 min Paso 2: 94 ° C 20 seg 59 ° C 30 seg 72 ° C 30 seg (Repita el paso 2 durante al menos 30 cycles) Paso 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Corra las muestras en gel de agarosa 1%. </li><li> Enriquecimiento también se puede determinar cuantitativamente con PCR en tiempo real. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
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<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
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<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Ahora es posible llevar a cabo un genoma en todo el perfil de asociación interacciones proteína-ADN utilizando chip-ss, como se ha demostrado muy recientemente con otros factores de transcripción 2,3. La clave para un resultado exitoso secuenciación es la generación de una cromatina immunoprecipitation molde de ADN de alta calidad. Una vez que la plantilla de ADN se ha generado y se cercioró de ser enriquecido adecuada, uno puede entonces tomar en preparación biblioteca para poste...

Durante muchos años ha habido una necesidad no satisfecha para identificar el conjunto de genes vinculados y regulado por una proteína dada genoma de ancho, en particular los de la clase de factor de transcripción. Odom et. Al 1 utiliza la cromatina immunoprecipitation (CHIP) en combinación con el promotor microarrays para identificar sistemáticamente los genes ocupados por reguladores transcripcionales pre-especificados en el hígado humano y los islotes pancreáticos. Posteriormente, Johnson et al. 2 desarrollaron un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina a gran escala basada en la secuenciación directa de ultra alto rendimiento de ADN (chip-ss) para asignar globalmente las interacciones proteína-ADN a través de todo los genomas de mamíferos. Como caso de prueba, se asignan in vivo la unión del factor silenciador restrictivo neuronal (NRSF) a 1.946 localizaciones en el genoma humano. Los datos muestran una nítida resolución de la posición de encuadernado (+ 50 pares de bases), lo que facilitó la isolation de motivos y la identificación de motivos NRSF vinculantes. Estos datos chip-seq también tenían una alta sensibilidad y especificidad y la confianza estadística (P &lt;10 -4), propiedades que son importantes para inferir nuevas interacciones candidatos. Robertson et al. 3 también se utiliza chip-ss con el fin de asignar STAT1 objetivos en interferón-γ (IFN-γ)-estimulado y células HeLa S3 humanos no estimulados in vivo. Por chip-ss, con 15,1 y 12,9 millones de secuencia asignado únicamente lee, y se estima una tasa de falso descubrimiento de menos de 0.001, se identificaron 41.582 y 11.004 supuestos regiones STAT1 vinculante en células estimuladas y no estimuladas, respectivamente. De los 34 loci se sabe que contienen STAT1 que responden al interferón vinculante sitios 4-8, chip-ss encontraron 24 (71%). Objetivos chip-ss fueron enriquecidos en secuencias similares a conocidos STAT1 vinculante motivos. Las comparaciones con los datos de dos chip-PCR existentes establece sugirióque la sensibilidad chip-ss fue entre 70% y 92% y la especificidad fue de al menos 95%. Además, estaba claro que el chip-ss ofrece tanto de baja complejidad analítica y la sensibilidad que aumenta con la secuenciación de profundidad. Como las tecnologías de secuenciación tal, genoma &quot;de nueva generación&quot; ofrecen 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías 9. Por lo tanto, los métodos de chip-ss proporcionan directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles eficaz de mamíferos interacciones proteína-ADN 3. En 2006, una fuerte asociación de variantes en el factor de transcripción 7-like 2 (TCF7L2) gen con la diabetes tipo 2 fue descubierto 10. Otros investigadores ya han replicado este hallazgo independiente en diferentes etnias y, curiosamente, a partir de los primeros estudios de asociación de todo el genoma de la diabetes tipo 2, publicados en la revista Nature 11,12 </sa&gt;, Ciencia 13-15 y en otros 16,17, la asociación más fuerte fue hecho con TCF7L2, lo que ahora se considera el hallazgo genético más importante en la diabetes tipo 2 al día 18-20. Además, TCF7L2 se ha relacionado con el riesgo de cáncer 21,22, de hecho, esta conexión se hizo más evidente cuando el locus 8q24 revelado por estudios de asociación en todo el genoma de un número de cánceres, incluyendo carcinomas colorrectales, se demostró que era debido a un extremo aguas arriba TCF7L2 elemento de unión a conducir la transcripción de MYC 23,24. Como tal, hay un gran interés en la determinación de los genes aguas abajo regulados por este factor de transcripción clave. Basándose en la experiencia con TCF7L2 como un ejemplo de la metodología, este documento describe cómo generar chip plantilla de ADN de alta calidad. Chip se llevó a cabo en la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, para la posterior secuenciación para construir una alta resollución mapa de los genes vinculados por TCF7L2 25 en un esfuerzo para producir una mayor comprensión en a su papel clave en la patogénesis de los rasgos complejos.

<table><tbody><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP Kit </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Polimerasa de arranque en caliente </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Espectrofotómetro </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><Secuencias > cebadores de control positivo (TCF7L2-1) Adelante- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reversa- 5'-GCTCACCTCCTGTGTTCG-3' Secuencias de cebadores de control negativo (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGGTGTGGGGGAAC-3' Reversa- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

generación de plantilla adn immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Métodos de secuenciación (chip-chip-ss) ofrecen directamente la cobertura de todo el genoma, en donde la combinación de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y secuenciación masiva en paralelo puede ser utilizado para identificar el repertorio de secuencias de ADN de mamíferos vinculados por factores de transcripción en vivo. &quot;La próxima generación de&quot; tecnologías de secuenciación del genoma proporcionan 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías lo que permite métodos de chip-ss para proporcionar directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles efectiva de los mamíferos interacciones proteína-DNA. Para exitosos enfoques chip-ss, hay que generar chip molde de ADN de alta calidad para obtener los mejores resultados de secuenciación. La descripción se basa en la experiencia con el producto de proteína del gen más fuertemente implicados en la patogénesis de la diabetes tipo 2, a saber, el factor de transcripción factor de transcripción 7-como 2 (TCF7L2). Este factor también ha sido implicado en varios tipos de cáncer. Contorno es cómo generar plantilla de chip de ADN de alta calidad derivada de la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, con el fin de construir un mapa de alta resolución a través de la secuenciación para determinar los genes vinculados por TCF7L2, dando más detalles en a su papel clave en la patogénesis de rasgos complejos.

Una vez que la cromatina se ha sonicó y han sido tratados con RNasa y proteinasa, las muestras se ejecutan en el gel de agarosa al 2% deben presentar un frotis con la mayor parte del ADN en el tamaño deseado. Si se prueban varios ciclos diferentes, una disminución gradual en el tamaño debe ser visto como el número de ciclos de aumento (Figura 2). Después de completar la porción de inmunoprecipitación del protocolo el enriquecimiento o bien se puede comprobar por PCR o PCR en...

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar regiones de unión de proteínas mediante la cromatina. Esto se logra primero mediante la reticulación cruzada de la proteína con el ADN. El segundo paso consiste en romper el ADN.A continuación, la proteína diana unida al ADN se inmunoprecipita y luego se eluye. El paso final consiste en revertir el entrecruzamiento y aislar el ADN. En última instancia, la inmunoprecipitación de cromatina se utiliza para mostrar la localización del enlace de proteínas a lo largo del genoma.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional, como la identificación y la localización de interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular determinado. Las células para este procedimiento se cultivan en placas de cultivo celular de 100 por 20 milímetros. La cantidad de células puede variar desde un millón hasta diez millones de células por placa, dependiendo del tipo celular. Aproximadamente dos millones de células son suficientes para una inmunoprecipitación para entrecruzar proteínas y cromatina en las células.Añada formaldehído hasta una concentración del 1 % e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional. Detenga la reticulación añadiendo glicina hasta una concentración final de 125 milimolar e incube durante cinco minutos. Lave las células dos veces con fosfato salino tamponado 1x a temperatura ambiente; tras el segundo lavado, deseche el PBS y añada 0,2 mililitros de PBS fresco. Recojas las células con un raspador celular de plástico en un tubo de microcentrífuga. Centrifugue las células a 2000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Aspire el sobrenadante para la extracción nuclear. Mantenga las células como un botón para preparar un lisado completo de células, lo cual se demostrará en el siguiente segmento. Resuspenda las células en tampón de lisis SDS; los lisados completos de células se preparan a partir de las células entrecruzadas mediante sonicación en hielo húmedo.Mediante el uso de un sonificador, para obtener el tamaño ideal del fragmento de ADN, este procedimiento debe optimizarse probando diferentes condiciones de sonicación. Las muestras deben mantenerse sobre hielo durante todo el procedimiento. Sónica cada muestra con estas configuraciones: 30 segundos encendido y 45 segundos apagado, con un ajuste de amplitud de dos.En este ejemplo, se necesitan 12 ciclos para obtener el tamaño ideal de fragmento. Recolecte 20 microlitros de cada muestra para verificar los resultados de la sonicación y para la cuantificación. El resto de la muestra puede almacenarse a 80 grados Celsius negativos.Diluya la muestra de 20 microlitros añadiendo 30 microlitros de tampón 0.1 XTE. A continuación, trate la muestra con un microlitro de RNAsa A a 37 grados Celsius durante una hora. Después, añada un microlitro de proteinasa K e incube a 62 grados Celsius durante dos horas.Después del tratamiento con proteinasa K, aplicar 20 microlitros de la muestra en un gel de agarosa al 2%. Las muestras deben presentar una mancha difusa con la mayor parte del ADN en el tamaño deseado. Si se prueban varios ciclos diferentes, se debería observar una disminución gradual en el tamaño.A medida que aumenta el número de ciclos, la cantidad restante de muestra se purificará con un kit de purificación rápido de PCR kaya y se cuantificará utilizando un espectro NanoDrop de TER para comenzar este procedimiento. Fava muestras de cromatina sonicadas en hielo centrifugadas a 12.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Coloque inmediatamente en hielo.Para eliminar el SDS, que aparece como un pellet blanco. Recoger el sobrenadante y desechar el pellet de cada muestra. Combinar las muestras si es necesario y apartar las cantidades necesarias para el experimento según los cálculos previos.Se requiere de uno a 10 microgramos de cromatina por inmunoprecipitación. Diluya la cromatina de uno a diez en tampón de dilución suplementado con inhibidor de proteasas. Añada 100 microlitros de perlas bloqueadas por inmunoprecipitación y rote a cuatro grados Celsius durante una hora.Inicie el procedimiento de inmunoprecipitación de cromatina centrifugando las muestras a 800 RPM durante un minuto a cuatro grados Celsius, y transfiera cada sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugue el sobrenadante a 800 RPM durante un minuto y transfiéralo a otro tubo limpio. Guarde 20 microlitros del sobrenadante a menos 20 grados Celsius para utilizarlo como control de entrada.Posteriormente, al&iacute;cuota el resto de la cromatina seg&uacute;n el n&uacute;mero de inmunoprecipitaciones requeridas en el experimento. A cada muestra, a&ntilde;ada dos microgramos de anticuerpo por cada uno a 10 microgramos de cromatina e incube toda la noche a cuatro grados Celsius con rotaci&oacute;n. A la ma&ntilde;ana siguiente, a&ntilde;ada 100 microlitros de perlas de aros bloqueadas a cada muestra de inmunoprecipitaci&oacute;n. Incube durante una hora a cuatro grados Celsius con rotaci&oacute;n despu&eacute;s de una hora.Centrifugar las perlas a 800 RPM durante un minuto para formar un precipitado. Desechar el sobrenadante en la mayor cantidad posible. Lavar las perlas.Una vez con tampón de lavado de complejo inmune de baja salinidad, añada un mililitro del tampón a cada tubo. Incube en rotación a temperatura ambiente durante cinco a ocho minutos y luego centrifugue a 800 RPM durante un minuto tras desechar el sobrenadante. Lave las perlas una vez con tampón de lavado de complejo inmune de alta salinidad, una vez con tampón de lavado de complejo inmune de cloruro de litio y dos veces con tampón TE, para un total de cinco lavados. Posteriormente, se eluye el ADN de cada muestra de inmunoprecipitación, así como de las muestras de entrada.Para revertir el enlace cruzado, agregue ocho microlitros de cloruro de sodio 5 M a 200 microlitros de cada eluido y control de entrada. Selle los tubos con parafina y incúbelos en un baño de agua a 65 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, trate cada muestra con un microlitro de RNAsa durante una hora a 37 grados Celsius.Después de una hora, agregue cuatro microlitros de EDTA 0,5 molar y ocho microlitros de Tris-HCl 1 molar a cada muestra y mezcle. Luego, agregue un microlitro de proteinasa K e incube a 45 grados Celsius durante dos horas. Purifique las muestras utilizando el kit de purificación rápida de PCR Kaya.Las muestras pueden guardarse a menos 20 grados Celsius hasta que se analicen mediante PCR. El enriquecimiento mediante inmunoprecipitación de cromatina puede verificarse mediante PCR o PCR en tiempo real. Para las muestras de PCR, se debe realizar electroforesis en un gel de agarosa; deben observarse bandas en las muestras de entrada y en las de ChIP utilizando un anticuerpo contra la proteína de interés, que en este caso es el factor de transcripción TCF7L2. En contraste, no debe haber nada o, como máximo, una banda muy débil en la muestra de control negativo de IgG para la región de unión positiva.Para la región de unión negativa, debería observarse una banda muy tenue o ninguna banda en absoluto en las pistas del control de IgG y de la muestra. Debe haber una banda en la pista de entrada.Esta figura muestra los resultados de las mismas muestras analizadas mediante PCR en tiempo real. Al igual que con el resultado anterior, debe haber un enriquecimiento significativo en el número de copias de la región de unión positiva para la muestra de chip en comparación con el control de IgG.Además, debería haber muy poco enriquecimiento, si es que hay alguno, en la región de unión negativa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo entrecruzar una proteína de unión con la cromatina en un tejido o línea celular, precipitar su proteína diana y luego aislar el ADN para su posterior análisis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

Los métodos para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo se están volviendo cruciales para todos los aspectos de la investigación genómica, pero son laboriosos, costosos y requieren mucho tiempo. Aquí se presenta un sistema robótico de manejo de líquidos disponible comercialmente que automatiza la inmunoprecipitación de cromatina para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo con cantidades limitadas de células.

La automatización de experimentos-chip siguientes para generar perfiles epigenéticos en 10.000 células HeLa

Presentamos una inmunoprecipitación de cromatina nativa modificada secuencia (ChIP-seq) metodología para la generación de la secuencia de bases de datos adecuadas para un marco analítico de nucleosoma densidad ChIP-seq, integración de la accesibilidad de la nucleasa micrococcal (MNase) con medidas de modificación de las histonas.

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Aquí presentamos un protocolo que está diseñado para analizar la Unión de todo el genoma del oligodendrocyte del factor de transcripción 2 (Olig2) en células de cerebro agudo purificada oligodendrocyte precursoras (OPC) por la realización de inmunoprecipitación de cromatina baja-celular (ChIP) , preparación de biblioteca, alto rendimiento secuenciación y análisis Bioinformático de los datos.

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aprende a generar plantillas de ADN de alta calidad mediante ChIP-seq para identificar regiones de unión de proteínas en el genoma. Este método permite estudiar interacciones proteína-ADN en líneas celulares y tejidos.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

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