Name: Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende a cultivar rebanadas de embrión de pollo para estudiar el desarrollo normal de neuronas motoras espinales mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite mantener el desarrollo neuronal durante 24 horas en condiciones controladas.

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Nos gustaría agradecer a jactes Sharon para discusiones interesantes y muchas Novitch B. para el tipo de regalo que los anticuerpos FOXP1. Este trabajo financiado por una beca de la Fundación Wellcome a KCT y una subvención para el proyecto de la Wellcome Trust para SRP (Grant número de referencia 094399/B/10/Z).

1. Haga soluciones necesarias <ol><li> Tampón fosfato 1 M:. Pesar 109,4 g de Na 2 HPO 4 y 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, mezclar y disolver en agua hasta un volumen total de 1 litro. </li><li> Tampón fosfato salino (PBS): Preparar tampón de fosfato 0,1 M, 0,15 M NaCl. 100 ml de PBS debería ser suficiente para el tratamiento de las rebanadas de 10 embriones. </li><li> Agarosa: Heat solución de PBS a alrededor de 70 ° C y añadir sólidos de baja temperatura de fusión de agarosa lentamente mientras se agita continuamente. Hacer la solución a una concentración final de 4% (w / v) de agarosa. Hacer un stock de 50 ml de esta solución. Agregar esta solución en un baño de agua mantenido a 48 ° C hasta que se necesite. Cualquier solución de agarosa no utilizada después del experimento se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. </li><li> Anticuerpo solución bloque: Añadir suero de ternera fetal y triton X-100 al final de una concentración de 1% (v / v) de suero fetal de ternera, 0,1% (v / v) de Triton X-100 en PBS. 10 ml de solución de bloqueo será suficiente para la inmunotinción de 5 diapositivas de las secciones de criostato. </li><li> Fijador: Preparar 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) de paraformaldehído (PRECAUCIÓN). Para preparar la cantidad de calor requerida fijador de agua a 70 ° C, se añade NaOH concentrado a la concentración final requerida, añadir paraformaldehído sólido y mezclar hasta que se disuelva. Enfriar en hielo a 4 ° C. 10 ml de esta solución será suficiente para 20 pocillos de rebanadas de embriones. </li><li> Solución de sacarosa: Preparar 10 ml de una solución de sacarosa al 30% (w / v) conteniendo 0,1 M de tampón fosfato. 10 ml de esta solución será suficiente para 10 pocillos de rebanadas de embriones. </li><li> 70% (v / v) de etanol. Diluir 70 ml de etanol absoluto con 30 ml de agua. </li><li> Medio de Cultivo: Se prepara una solución de extracto de pollo 1% embrión, 1% penicilina / estreptomicina, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoethanol, 4% suero de pollo, 2% suplemento B27 y 100 ng / ml de factor de crecimiento ciliaryneurotrophic (CNTF) todo diluido en medio neurobasal; preparado en hielo y utilizarse el mismo día. 10 ml de medio de cultivo se requiere para 20 pocillos de rebanadas de embriones. </li></ol> 2. Polluelo Preparación de Embriones <ol><li> Coloque los huevos de gallina fertilizados con el lado más largo horizontalmente en un proyecto incubadora forzado a 38 ° C hasta que se desarrollan a la etapa 15 24. Esto normalmente requiere aproximadamente 4 días de incubación. </li><li> En el segundo día de incubación, esterilizar la cáscara del huevo, limpiando con un pañuelo de papel empapado en 70% de etanol. Perforar cuidadosamente el extremo plano de la cáscara del huevo usando una aguja de calibre 21 unida a una jeringa de 5 ml y 5 ml de eliminar la albúmina. Esto reduce el embrión lejos de la cáscara de modo que el embrión no se daña cuando la carcasa está abierta. Devolver los huevos a la incubadora y se incuban durante 2 días. </li><li> Usando romo dumont º 5 fórceps carefully perforar la parte superior central de la carcasa y retire alrededor de 9 cm 2 de shell. Corte alrededor del embrión y cuidadosamente saque el embrión y el lugar en HBSS durante la disección. Los embriones se organizaron de acuerdo a Hamburger y Hamilton (1992) 15. Todos los embriones utilizados deben estar en estrecha a la etapa 24. Los embriones que presentaban ningún signo de anormalidad debe desecharse. </li><li> Retire la membrana amnios, membrana corio-alantoidea, la cabeza, y alantoides con dos Dumont # 5 fórceps. Eviscerar el embrión para eliminar todos los órganos internos. Para ello, cortar la línea media ventral del embrión con unas tijeras de disección micro, mantenga el embrión en la región rostral del tronco con un par de pinzas, agarre la parte rostral del intestino y el corazón y tirar caudalmente. Es importante que esto se realiza limpiamente. Usted debe ser capaz de ver el embrión somitas claramente. Cortar el embrión por la mitad, transversalmente entre el buds.Now miembro superior e inferior del cuerpo recortar torácicapared usando tijeras de microdisección. </li></ol> 3. Preparación de embriones Slice <ol><li> Quitar la solución de agarosa del baño de agua. Cortar 5 cm de la parte inferior de un 3 ml desechable de plástico pipeta Pasteur. </li><li> Retire con cuidado la parte lumbar del embrión disecado con dos pinzas para acunar el embrión de la solución de disección y colocar en un lugar seco placa de Petri. Con la pipeta de Pasteur, eliminar alrededor de 2 ml de agarosa, pipeta de aproximadamente 0,5 ml en la parte superior del embrión y luego aspirar la rebanada embrión en la pipeta. La transferencia del embrión y la agarosa a una cáscara de molde de plástico lejos tener cuidado de no introducir burbujas en la agarosa. Baje suavemente el embrión a la parte inferior de la agarosa en el molde de plástico con la sección torácica hacia abajo. El embrión se deben colocar para ser recta usando una aguja de calibre 21. Las rodajas contendrá también parte de la extremidad en desarrollo y es importante que la orientación del embrión en el agarose lo permitirá. Coloque el bote en el hielo para fijar la agarosa. Tenga cuidado de que el embrión no cambia la orientación durante este período (alrededor de 2 minutos). </li><li> El Leica VT1000S vibratome (Speed ​​3, frecuencia 4, 400 rebanadas gruesas micras) debe ser configurado con la cámara de corte llena de HBSS y rodeado de agua helada. El bloque de agarosa es entonces pegado a la plataforma de vibratome con pegamento. El bloque de agarosa se recorta con una cuchilla de afeitar para dejar la pieza embrión con 1-3 mm de agarosa que lo rodea. Las rodajas que incluyen secciones extremidades brote con una clara apical ectodérmica Rigde se seleccionan y estos trozos se colocan luego en HBSS. En general, hay sólo una o dos rebanadas adecuados por embrión. Retire suavemente la agarosa en torno a los cortes de tejido con dos agujas. Es esencial que esto se hace a fondo y cuidadosamente. </li></ol> 4. Slices Cultivo de embriones <ol><li> Añadir 500 ml de solución de cultivo (descrito anteriormente) a la requiriendoed número de pocillos de un 24-así de ultra baja unión tratada placa de cultivo de tejido. Transferir las rebanadas con cuidado de la solución de HBSS en el pozo. En general, tratamos de tener dos o tres cortes en cada pocillo. Colocar la placa de 24-bien en el cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 5. Seccionamiento los segmentos para inmunotinción <ol><li> Tras el período de cultivo, añadir 500 l de solución no tamponada a cada pocillo de las rebanadas de embriones y dejar en hielo durante 20 min. La solución total se retiró cuidadosamente y tres lavados con PBS se llevó a cabo, con intervalos de 5 minutos. Las rodajas se deja entonces en solución de sacarosa a 4 º C, hasta que el disipador rodajas, alrededor de 6 horas pero se puede dejar durante más tiempo (por ejemplo durante la noche). </li><li> Retire las rodajas y dab off solución de sacarosa extra y equilibrar en alrededor de 1 de octubre ml por alrededor de 5 min a 20 ° C. Monte cada plano rebanada en un molde de octubre lleno de pelar lejos de plástico.Después del montaje, colocar los moldes verticalmente en hielo seco a solidificarse. </li><li> Montar los bloques de octubre en el criostato y equilibrar los bloques a -24 º C durante alrededor de 20 min. Corte cada rebanada con 15 mm secciones montadas en Superfrost-Plus diapositivas. Diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C hasta que se necesiten. </li></ol> 6. Inmunofluorescencia <ol><li> Pipetear 1-2 ml de PBS en los portaobjetos horizontales mantenidos en una cámara humidificada con los portaobjetos obtenidos de la parte inferior de la cámara (se utiliza 1 o 2 ml pipetas de plástico fijadas con cinta de autoclave). Se incuban las secciones en PBS durante 5 min a 20 ° C para eliminar el exceso de octubre Eliminar la solución de PBS de la diapositiva y añadir 500 ml de solución de bloqueo sobre las secciones, incubar durante 30 min a 20 ° C. Eliminar la solución de bloqueo y añadir inmediatamente 500 ml de anticuerpo primario diluido añaden a las diapositivas, se incuba a 4 º C durante 18-22 h. </li><li> Elimine la solución de anticuerpo primario y fue inmediatamenteh los portaobjetos con 1 ml de PBS durante 5 min, tres veces a 20 ° C para eliminar el exceso de solución de anticuerpo primario. Añadir 500 ml de anticuerpo secundario diluido a lo largo de las secciones. Los portaobjetos se dejó a 20 ° C durante 30 min. La solución de anticuerpo secundario se retira entonces y el portaobjetos se lavaron 3 veces 5 min en PBS a 20 ° C. </li><li> Después de estos lavados, eliminar el lavado final con PBS, limanda el borde del portaobjetos para eliminar el exceso de PBS, añadir dos gotas de Vectashield en las diapositivas y colóquela suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre las secciones, evitando la formación de burbujas. Eliminar el exceso de Vectashield por transferencia desde el borde de los portaobjetos antes de formación de imágenes. </li></ol> 7. Proyección de imagen <ol><li> Imagen de las secciones immunostained. Nosotros usamos un microscopio Nikon Eclipse E80i fluorescencia equipado con una cámara ORCA ER Hamammatsu digital y 10 X, 40 X 20X y lentes objetivo. </li></ol>

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</ol>

Ninguno de los autores que compiten intereses o conflictos de intereses.

El protocolo aquí descrito permite una rebanada de embrión de pollo que se incubaron durante más de un día, manteniendo las neuronas motoras vivo y continuo a migrar durante el período de cultivo. En la aclaración de las condiciones para mantener las neuronas motoras vivas, se han identificado varias características clave requeridas. Parece que hasta un 4% de suero de pollo es crítico para la supervivencia de las neuronas motoras y su sustitución con suero de una especie diferente no es tolerada. Curiosamente, hemos encontrado que la presencia de mayores concentraciones de suero fueron perjudiciales para las rebanadas, ya que promueven el crecimiento excesivo del tejido dando lugar a graves distorsiones en la forma de rebanada. Más importante aún, la presencia de factor neurotrófico ciliar también resultó crítica. Sigue siendo una clara posibilidad de que las rebanadas pueden ser capaces de ser cultivadas durante bastante más tiempo que sólo 24 hr, incluso permitiendo la visualización de la información sensorial aferente a la médula espinal. Además, el cultura condiciones también podrían ser útiles para cortar las culturas del tronco cerebral y el mesencéfalo desarrollo / cerebelo. Quizás el mayor beneficio potencial en el uso de estas condiciones de cultivo rebanada es que facilitan la posibilidad de que la manipulación farmacológica de función de la proteína mientras que se minimiza el potencial de efectos adversos en el resto del embrión, tales como el corazón. Un gran número de inhibidores y agonistas de diferentes vías de señalización se puede utilizar para evaluar la migración de los diferentes subtipos de neuronas espinales y, potencialmente, su efecto de la formación de circuitos locales espinales durante el desarrollo. Además, algunas perturbaciones genéticas de expresión de la proteína, tales como los que hacen uso de siRNAs y oligonucleótidos de morfolino, sufren del hecho de que sólo puede ser introducido en el desarrollo temprano (debido a las limitaciones en los procedimientos de electroporación in ovo) y los efectos sólo duran un corto período de time (generalmente un día). Nuestra cultura rebanada se inicia en etapas posteriores y ofrece la posibilidad de utilizar esta tecnología en el desarrollo posterior en la etapa de corte para ver sus efectos durante el período de la cultura de la rebanada. El protocolo de cultivo de cortes también podría permitir la visualización de ambas motoneurona espinal, así como la migración de interneuronas dorsal en tiempo real a través de microscopía de vídeo time-lapse. Esto podría conseguirse mediante microscopía de contraste de fase con luz blanca o mediante el uso de imágenes de fluorescencia. Si esta última técnica se iban a utilizar a continuación, la introducción de marcadores fluorescentes que se necesita. Esto puede lograrse ya sea mediante la introducción de tintes fluorescentes tales como Dil o DiO a través de cualquiera de marcado retrógrado de la extremidad o etiquetado anterógrada desde el ventrículo o la electroporación in ovo de constructos para conducir las proteínas fluorescentes en un subconjunto de neuronas.

Durante el desarrollo embrionario normal, muchos tipos de células diferentes que se generan deben migrar desde su punto de origen hasta donde eventualmente funcionarán en el organismo maduro. Dentro de la médula espinal en desarrollo, las células progenitoras se encuentra en la zona ventricular en la línea media y generan muchos subtipos de neuronas postmitóticas y células gliales que deben migrar a integrarse en los circuitos neuronales funcionales requeridos para el procesamiento sensorial y la salida del motor 1. Las neuronas motoras espinales que controlan la contracción de músculos de las extremidades se han estudiado ampliamente y se sabe mucho de las moléculas y mecanismos que conducen a la formación de sus subclases diferentes. Sin embargo, se sabe mucho menos de los mecanismos por los cuales las neuronas motoras migran, segregar y recibir entradas sinápticas. Motor identidad subtipo neuronal se adquiere durante el desarrollo de una manera jerárquica. Motor subtipos neuronales pueden ser ampliamente clasificados inPara distintas columnas, las divisiones y las piscinas que se definen por sus proyecciones axón. Motor columnas axones de proyectos a cualquiera de los músculos axiales, viscerales o la integridad física. Divisiones de motor subdividir la extremidad proyección de las neuronas motoras de la columna lateral del motor (LMC) en los que se proyecta a los músculos ventral o dorsal 2. Dentro de las divisiones, grupos de neuronas motoras motor denominado proyecto piscinas a los músculos individuales en el miembro 2, 3. Salientes de extremidad neuronas motoras se definen por su expresión del factor de transcripción FOXP1 4, 5, mientras que la identidad de división se caracteriza por la expresión de los factores de transcripción del homeodominio 1 Islet-(ventralmente proyección) o LHX 1-(dorsalmente proyectando) 6. En efecto, LHX-1 de expresión se requiere para las proyecciones apropiadas dorsal de las neuronas motoras 7. Cada uno de estos subtipos de ocupar distintas posiciones dentro de la médula espinal, las neuronas motoras ventrales proyectan venir a residir a medial dorsal projecting neuronas motoras. Esto resulta en la LMC siendo segregados en los llamados LMCmedial (LMCM) y divisiones LMClateral (LMCl). Organización piscina Divisional y el motor se adquiere en dos fases 8. En la primera fase, la segregación de división se consigue a través de una migración de las neuronas motoras en una característica medial a lateral de la moda. Las células LMCl se generan después de las células y así LMCM LMCl migra a través de la LMCM para alcanzar su posición de sedimentación final. La segunda fase se lleva neuronas motoras dentro de una división y agrupaciones ellos en conjuntos de neuronas motoras, presumiblemente a través de una clasificación dorsal-ventral de las neuronas motoras. Los miembros de la familia de las cadherinas catenina dependientes clásica han demostrado ser crucial para las dos fases de la neurona motora 8-10 organización. Sin embargo, como función de las cadherinas controla el movimiento celular se conoce bien. La adquisición de la identidad columnar, de división y de piscina requiere que el patrón de señales extrínsecas intrínsecamentec expresión de factores de transcripción 11. Además, alrededor de 50% de todas las neuronas motoras mueren por apoptosis durante el desarrollo normal en un proceso que requiere señales extrínsecas de la extremidad, en gran parte a través de soporte neurotrófico de motor supervivencia de las neuronas. Por lo tanto, las neuronas motoras de desarrollo requiere un entorno adecuado que se mantenga en un timecourse relativamente largo. Por esta razón, los aspectos prácticos de la generación de cultivos de cortes de médula espinal para mantener la supervivencia de las neuronas del motor requieren la elucidación de las condiciones de cultivo apropiadas. Anterior cultivos de cortes de embriones se han utilizado para seguir el comportamiento de extrínsecamente añadido purificado poblaciones neuronales 12-14. Sin embargo, para nuestros conocimientos Condiciones de cultivo que facilitan in situ motor supervivencia neuronal y la migración dentro de la propia división no se han publicado. Hemos modificado una condición de cultivo estándar que facilita la supervivencia de purificada, disociadas neuronas motoras craneales para facilitar motor neurona desarrollo dentro de un sistema de cultivo de embriones rebanada. También supervisó la colocación de las neuronas motoras supervivientes y demostrar que las posiciones en gran parte normal de la división de la motoneurona se adquiere durante el período de cultivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Huevos </td><td> Henry Stewart Farms, Reino Unido </td><td></td><td> Los huevos fecundados de gallina Brown Bovan Gold Farms (Henry Stewart, Reino Unido), almacenados a 14 ° C hasta que la incubación </td></tr><tr><td> Aguja de calibre 21 </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml jeringa </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tijera de disección </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 en directo) </td></tr><tr><td> Moldes de embriones incrustación: Despegue moldes </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> De forma piramidal 22 mm a 12 mm </td></tr><tr><td> Super Glue </td><td></td><td></td><td> Power Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Sodio di-hidrógeno fosfato, mono-hidrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio mono-hidrógeno fosfato </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Baja temperatura de fusión de agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de Sodio </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plástico desechables pipetas pasteur </td><td> Elkay Precision laboratorio consumibles </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml de volumen </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrógeno carbonato de sodio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de embrión de pollo </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina solución </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina solución </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Southern Grupo Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de CilliaryNeurotrophic (CNTF) </td><td> Sistemas R y D </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Polluelo Suero </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Los anticuerpos primarios </td><td></td><td></td><td> fueron adquiridos de Desarrollo del Banco hibridoma Estudios, con la excepción de anticuerpos anti-FOXP1, que eran una especie de regalo de Bennett Novitch de UCLA. Diluciones de anticuerpos primarios fueron de conejo anti-FOXP1 (1/32000), ratón anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FOXP1 (1/1000). Todos los anticuerpos fueron almacenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Los anticuerpos secundarios </td><td></td><td></td><td> Burro anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) adquiridos de Jackson Laboratories Inc. Immunoreseach burro anti-ratón (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-conejo (Alexa Fluor 594) (1:1000) adquirido de Invitrogen Todos los anticuerpos fueron almacenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Corning Costar </td><td> 3473 </td><td> accesorio ultra bajo 24-así placa </td></tr><tr><td> Octubre </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura óptima de corte </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield medio de montaje fluorescente </td></tr><tr><td> Diapositivas </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> Superfrost-Plus portaobjetos cargados positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Cubierta de cristal </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 mm </td></tr><tr><td> Obligado el proyecto incubadora: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> mantenerse húmedo, garantizando los niveles de agua siempre es suficiente, mantenida a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, Reino Unido </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubadora </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscopio de fluorescencia </td></tr><tr><td> Cámara Digital </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M y Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

embriones de pollo de la médula espinal slice cultura protocolo

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Cultivos de cortes puede facilitar la manipulación del desarrollo del embrión y farmacológicamente tanto a través de manipulaciones genéticas. En este sistema de reducción, los potenciales efectos secundarios letales debido a las solicitudes de fármacos sistémicos pueden ser superados. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que avanza el desarrollo normales dentro del entorno reducido de la rebanada. Nos hemos centrado en el desarrollo de la médula espinal, en particular la de las neuronas motoras espinales. Hemos variado sistemáticamente las condiciones de cultivo de las rebanadas de embrión de pollo desde el punto en el que las neuronas motoras espinales más había nacido. Analizamos el número y tipo de las neuronas motoras que sobrevivieron durante el período de cultivo y la posición de las neuronas motoras en comparación a que in vivo. Se encontró que el tipo de suero y factores neurotróficos se requiere durante el período de cultivo y fueron capaces de mantener las neuronas motoras vivo durante al menos 24 horas y permitir que las neuronas motoras a migrar a las posiciones adecuadas en lamédula espinal. Presentamos estas condiciones de cultivo y la metodología de preparación de los cultivos de cortes de embriones con embriones de pollo eviscerado embebidos en agarosa y en rodajas con un vibrátomo.

El uso de rodajas cultivadas para seguir el desarrollo de las neuronas de proyección interneuron y ha tenido influencia en el progreso de nuestra comprensión de la generación de organización dentro de la corteza 16. En la médula espinal, el desarrollo motor neurona se ha seguido usando cultivos de embriones de pez cebra enteros 17. Sin embargo, la columna vertebral de la neurona motora organización en el pez cebra es relativamente simple (debido a la falta de grandes músculos de las extremidades en el pescado). Los mecanismos moleculares que conducen a una jerarquía de organización de las neuronas motoras espinales durante el desarrollo de los vertebrados superiores están actualmente poco conocidos. Las condiciones de cultivo que facilitan la supervivencia neuronal y la migración cuerpo celular en cultivos de corte de embrión de los vertebrados superiores tanto, se requieren. En la actualidad, la médula cultivos de cortes de médula de los vertebrados superiores se han utilizado para las neuronas disociadas de semillas en la parte superior de las rebanadas 12-14, investigar los axones marcados con fluorescencia en la periferia de la rebanada18, o de la conducta de las células progenitoras en el desarrollo temprano de la médula espinal 19. Cortar las condiciones de cultivo para los cables más tarde espinales, en particular aquellos que mantienen el desarrollo de la neurona motora se carece actualmente. Para tratar de seguir el desarrollo neuronal espinal, particularmente la de las neuronas motoras espinales, investigamos diversas condiciones de cultivo que podrían promover la supervivencia neuronal motor y la adquisición de la orden inicial en la organización de motor a través de la migración lateral de las neuronas. Los ensayos iniciales con la etapa 18 a la etapa de embrión de pollo 20 rebanadas de médula espinal fueron infructuosos, nosotros no fuimos capaces de mantener las neuronas motoras con vida durante más de unas pocas horas y no pudieron demostrar la generación de un número importante de células LMCl durante el período de cultivo (datos no se muestra). Por ello, investigó los cultivos de cortes de la etapa 24 embriones, un punto de tiempo cuando la mayoría de las neuronas LMCl y LMCM se han generado, pero cuando LMCl neurona migración está todavía en su infancy (Figura 1a-c). Esta migración lateral de las neuronas LMCl está prácticamente terminada por la etapa 27, a unos 24 a 36 horas más tarde (Figura 1 df). Nuestro ensayo tanto, podría ser simplificado para ser capaz de mantener las neuronas vivas y para facilitar su migración lateralmente en el asta ventral. Empezamos nuestros experimentos con condiciones de cultivo relativamente simples que contienen sólo Hank de solución salina equilibrada con o sin suero de pollo o extracto de embrión de pollo. En todos los casos, a pesar de que hemos sido capaces de mantener las neuronas LMC en el sector, encontramos poca evidencia de neuronas LMCl objeto de mantenimiento (al menos por la expresión de LHX-1). Además, encontramos expresión inapropiada de genes tales como HB9 en la médula espinal dorsal, una situación que no se produce in vivo (datos no mostrados). Así, estas condiciones de cultivo simples no son adecuados para la investigación de la adquisición de motor organización de las neuronas. Así buscó a conditio más complejons y como una base que se utiliza una formulación que se ha publicado para facilitar la supervivencia de las neuronas disociadas de embriones de pollo de motor craneales. Esta condición 20 (1% de extracto de embrión de pollo, 1% Pen Strep, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoetanol, 2% de suero de caballo, 2% de suplemento B27 y 50 ng / ml de factor de crecimiento ciliaryneurotrophic (CNTF) en medio neurobasal (aquí llamado Guthrie medio) se mantenga más neuronas motoras vivas que los medios más simples. Además, no dio lugar a la expresión de factores de transcripción espurio en la médula espinal dorsal. Sin embargo, la supervivencia de las neuronas LMCl era pobre (Figura 1 gi, p). lo tanto, variar lo que consideran factores clave en el medio de Guthrie, a saber, el animal de origen del suero, la concentración del suero y la concentración de CNTF en el medio. Hemos encontrado que cambiando el suero a partir de suero de caballo en Chick suero y un aumento de la concentración de CNTF a partir de 50 ng / ml a 100 ng / ml aumentó sustancialmente tque la supervivencia de las células LMCl y LMCM y también permite su migración en el cuerno ventral sobre la hr 24 de las condiciones de cultivo (Figura 1 jl, p). El número total de neuronas motoras, la relación de LMCM a LMCl y, de hecho, la migración de las células LMCl en el cuerno ventral parecían muy similares a las secciones de embriones que se había permitido desarrollar in ovo en lugar de en el cultivo de cortes (figura 1 ko, p). Por lo tanto, creemos que, basándose en el número de células factor de transcripción expresión, y la posición de las neuronas motoras, nuestras condiciones de cultivo rebanada normal de recapitular el desarrollo neurona motora espinal al menos durante un período de 24 horas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Situación de la generación de LMC (FOXP1 tinción enb) y LMCl (LHX-1 tinción en a) en la etapa 24. c es una fusión de los dos canales. La línea media se muestra como una línea de puntos en A y D, V muestra la orientación de la dorsoventral (D, V), el eje de la médula espinal d -. F. . Situación de la LMC (FOXP1 tinción en d) y LMCl (LHX-1 tinción en e) organización en la etapa 27 f es una combinación de los dos canales g -. I. Lhx-1 (g) y FOXP1 (h) de expresión en secciones de una rebanada cultivaron en un medio que soporta craneal motor supervivencia de células neuronales (medio Guthrie, nuestro &quot;medio inicial&quot; véase la referencia 20). Lhx-1 ya no se expresa en las neuronas motoras, aunque hay alguna supervivencia de las células de LMC evidenciadas por FOXP1 expresión. D, V en (g) muestra la orientación de la dorsoventral (D, V), el eje de la médula espinal. ML muestra la orientación de la mediolateral (M, L) del eje de la sj cable pinal - l. Células LMCl (LHX-1 en el asta ventral en j) y la LMC en general (FOXP1 en k) pueden ser observados en rodajas cultivadas en medio que contiene 4% de suero de pollo y 100 ng / ml de CNTF. Tenga en cuenta que algunas células LMCl se encuentran en una posición lateral en el asta ventral. La flecha en (j) muestra la posición lateral de algunas de las células de los LMCl. (L) es una combinación de los dos canales m -. O. Estado de la expresión de LHX-1 (m) y FOXP1 (n) en las secciones de un embrión in ovo mantuvo durante el cultivo de cortes del embrión se muestra en la j - l. (O) es una combinación de los dos canales. P. La cuantificación del porcentaje de LMCl (FOXP1 + VE / Lhx1 + ve) en comparación con las células de LMC (FOXP1 + VE / Lhx1 ve-) células que se encuentran en cultivos de corte en diferentes condiciones compared para controlar embriones mantenidos in ovo (que representan 100%). La t de Student prueba representa *** p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

Cultivos de cortes de facilitar la manipulación del gen por el desarrollo del embrión y las perturbaciones farmacológicos. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que el desarrollo normal puede proceder en el entorno reducido de la rebanada. Se ilustra un protocolo que facilita el desarrollo normal de la médula espinal para continuar durante al menos 24 h.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar secciones de embrión de pollo para mantener el desarrollo neuronal normal, particularmente de las neuronas motoras espinales. Esto se logra primero mediante la disección del embrión de pollo para eliminar los órganos viscerales. El segundo paso consiste en preparar y seccionar el embrión incrustado en un bloque de agarosa.A continuación, se retira cuidadosamente la sección del embrión del agarro. El paso final consiste en transferir la sección embrionaria a un medio de cultivo, que se incuba durante 24 horas a 37 grados Celsius. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia en secciones delgadas de la sección embrionaria para mostrar la presencia y localización de las neuronas motoras espinales tras el período de cultivo.Por lo tanto, este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo. Por ejemplo, los mecanismos y las moléculas implicados en la migración de las neuronas motoras espinales. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere mucho cuidado durante las etapas de disección del protocolo.Coloque 10 huevos fertilizados con el lado más largo en posición horizontal en una incubadora de aire forzado a 38 grados Celsius hasta que desarrollen hasta la etapa 24 de Hamburger y Hamilton. Esto generalmente requiere aproximadamente cuatro días de incubación. En el segundo día de incubación, esterilice la cáscara del huevo limpiándola con un papel absorbente empapado en etanol al 70%, luego perfore cuidadosamente el extremo plano de la cáscara del huevo usando una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros y retire cinco mililitros de albúmina.Esto aleja al embrión de la cáscara para que el embrión no se dañe cuando se abre la cáscara. Devuelva los huevos al incubador y continúe la incubación durante otros dos días. Una vez transcurridos los dos días, use una punta roma.Haga más. Número cinco, use fórceps para perforar cuidadosamente la parte superior media del cascarón y retire un cuadrado de cascarón de aproximadamente nueve centímetros de lado. Corte alrededor del embrión y sáquelo con cuidado, colocándolo en HBSS.Para la disección. Todos los embriones utilizados deben estar cercanos al estadio 24. Cualquier embrión que presente signos de anormalidad debe descartarse.Coloque el recipiente que contiene el embrión bajo un microscopio de disección. Utilice dos pinzas número cinco para retirar la membrana amniótica. La membrana corioalantoidea, el alantoides y la cabeza; a continuación, eviscere el embrión para eliminar todos los órganos internos usando tijeras de disección microscópicas para cortar a lo largo de la línea media ventral del embrión.Luego, sostenga el embrión alrededor de la región del tronco rostral con un par de pinzas. Agarre la parte rostral del intestino y el corazón, y tire. Debe poder observar claramente los somitos del embrión.Ahora recorte la pared corporal torácica utilizando tijeras de microdisección. A continuación, corte transversalmente el embrión por la mitad entre los brotes de las extremidades superior e inferior. Retire suavemente la mitad lumbar del embrión diseccionado utilizando dos pinzas para sostener el embrión fuera de la solución de disección y colóquelo en una placa de Petri seca usando una pipeta desechable para pasta con unos cinco centímetros de longitud.Corte desde la parte inferior, aspire aproximadamente dos mililitros de Aros fundido al 4% peso por volumen en PBS. Pipete aproximadamente 0.5 mililitros de Aros sobre el embrión y luego aspire el fragmento del embrión dentro de la pipeta. Transfiera el embrión y el Aros a un molde plástico desprendible sin introducir burbujas en el Aros.Baje suavemente el embrión hasta el fondo de los aros en el molde de plástico con la sección torácica orientada hacia abajo y utilice una aguja de calibre 25 para asegurarse de que el embrión esté recto. Los aros también contendrán parte del miembro en desarrollo y es importante que los embriones se coloquen verticalmente en los aros para permitir esto; coloque el molde de plástico sobre hielo durante aproximadamente dos minutos. Para solidificar los aros, tenga cuidado de que el embrión no cambie de orientación durante este período.Configure el VT 1000 S o un modelo similar de manera que la cámara se llene con HBSS y esté rodeada de hielo. Agua fría. Utilice pegamento de contacto para fijar el bloque de aros a la plataforma del vibrátomo y luego corte el bloque con una cuchilla de afeitar, dejando el fragmento del embrión con uno a tres milímetros de aros alrededor.Inicie el vibrátomo y comience a cortar el embrión. Se seleccionan los cortes que incluyen secciones del brote de extremidad con una cresta ectodérmica apical clara y luego se transfieren a una placa con HBSS. Por lo general, solo hay uno o dos cortes adecuados por embrión.Retire suavemente el agarosa alrededor de las secciones de tejido utilizando dos agujas. Es esencial hacerlo de manera exhaustiva y cuidadosa. Añada 500 microlitros de solución de cultivo al número necesario de pocillos de una placa de cultivo de tejidos de adherencia ultrabaja de 24 pocillos.Transfiera cuidadosamente las secciones desde la solución de HBSS al pocillo, colocando dos o tres secciones en cada uno, luego coloque la placa de 24 pocillos en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Tras el período de cultivo, añada 500 microlitros de fijador sin tampón a cada pocillo con secciones de embrión y deje en hielo durante 20 minutos. A continuación, aspire cuidadosamente toda la solución y lave tres veces con PBS en intervalos de cinco minutos. Luego añada 30% de sacarosa en PBS a los pocillos y coloque la placa a cuatro grados Celsius durante aproximadamente seis horas o más, hasta que las secciones se hundan.Después de que los cortes se hundan, transfiera los cortes a una placa de Petri limpia de 10 centímetros y absorba el exceso de solución de sacarosa. A continuación, agregue un mililitro de OCT y deje que los cortes se equilibren durante cinco minutos a 20 grados Celsius. Monte cada corte plano en un molde plástico desprendible lleno de OCT después de montarlo.Coloque los moldes verticalmente sobre hielo seco para solidificar, monte los bloques de OCT en el criostato y equilibre los bloques a menos 24 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Luego, corte cada sección en cortes de 15 micrones y móntelos sobre portaobjetos super frosts plus. Los portaobjetos pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarios para la tinción inmunofluorescente según se describe en la sección de texto del protocolo; esta imagen muestra el estado de la generación de la columna motora lateral en la etapa 24 de Hamburger y Hamilton.La división lateral de la columna motora lateral se visualiza mediante tinción con LH X uno en el panel izquierdo. La columna motora lateral se visualiza mediante tinción con Fox P uno en el panel central y el panel derecho es una superposición de los dos canales. La línea media se muestra como una línea punteada y DV denota aquí el eje dorsal-ventral.El estado de la división lateral de la columna motora lateral se muestra nuevamente mediante la tinción de LH X uno en el panel izquierdo y la columna motora lateral mediante la tinción de Fox P uno en el panel central, con la imagen fusionada a la derecha. Estas imágenes muestran el desarrollo en la etapa 27. Estas imágenes muestran la expresión de LH X uno a la izquierda y la expresión de Fox P uno en el panel central en secciones de una porción cultivada en un medio que favorece la supervivencia de neuronas motoras craneales disociadas.LH X uno ya no se expresa en las neuronas motoras, aunque existe cierta supervivencia de las células de la CML evidenciada por la expresión de Fox P uno. DV representa la orientación del eje dorsal-ventral de la médula espinal, y ML representa la orientación del eje medio-lateral de la columna lateral de neuronas motoras de la médula espinal. Las células de la división lateral, nuevamente teñidas para LH X uno en el asta ventral en el panel izquierdo y la CML en general teñida para Fox P uno en el panel central, pueden observarse en cortes histológicos cultivados en medio que contiene 4% de suero de pollo y 100 nanogramos por mililitro de CNTF.Téngase en cuenta que algunas células de la división lateral de la columna motora lateral se encuentran en una posición lateral en el asta ventral, como indica la flecha en el panel izquierdo. Esta imagen muestra el estado de expresión de LH X uno y Fox P uno en secciones de un embrión mantenido en OVO durante el cultivo de explantes del embrión mostrado previamente. Este histograma muestra los resultados de la cuantificación del porcentaje de células de la división lateral de la columna motora lateral, que son positivas para FOX P uno y LHX uno, frente a las células de la columna motora lateral, que son positivas para FOX P uno y LHX uno.Se muestran datos negativos para células encontradas en cultivos de secciones en diferentes condiciones en comparación con embriones control mantenidos in ovo, que representan el 100 %. Los datos se analizaron utilizando la prueba t de Student. El triple asterisco representa un nivel de significancia menor a 0,01. Al intentar este protocolo, es importante tener cuidado al diseccionar el embrión y al eliminar los agros de las secciones, ya que es fundamental mantener la integridad de los axones motores en el brote de la extremidad.

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Investigación

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En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

El video muestra la regeneración funcional de las conexiones propioespinales utilizando un ensayo basado en una matriz de electrodos múltiples (MEA). Los cortes de la médula espinal se colocan en el MEA y se dejan fusionar. Los cortes fusionados se separan mecánicamente creando una lesión, induciendo que las neuronas propioespinales crezcan sobre la lesión y conecten los cortes. Se evalúa la actividad eléctrica de las rodajas para identificar la regeneración de las conexiones funcionales.

Estudio de la regeneración de conexiones funcionales entre cortes de médula espinal utilizando una guía de electrodos múltiples

Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.

Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos

Aprende a cultivar rebanadas de embrión de pollo para estudiar el desarrollo normal de neuronas motoras espinales mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite mantener el desarrollo neuronal durante 24 horas en condiciones controladas.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

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