Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

El objetivo general de este procedimiento es cultivar secciones de embrión de pollo para mantener el desarrollo neuronal normal, particularmente de las neuronas motoras espinales. Esto se logra primero mediante la disección del embrión de pollo para eliminar los órganos viscerales. El segundo paso consiste en preparar y seccionar el embrión incrustado en un bloque de agarosa.

A continuación, se retira cuidadosamente la sección del embrión del agarro. El paso final consiste en transferir la sección embrionaria a un medio de cultivo, que se incuba durante 24 horas a 37 grados Celsius. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia en secciones delgadas de la sección embrionaria para mostrar la presencia y localización de las neuronas motoras espinales tras el período de cultivo.

Por lo tanto, este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo. Por ejemplo, los mecanismos y las moléculas implicados en la migración de las neuronas motoras espinales. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere mucho cuidado durante las etapas de disección del protocolo.

Coloque 10 huevos fertilizados con el lado más largo en posición horizontal en una incubadora de aire forzado a 38 grados Celsius hasta que desarrollen hasta la etapa 24 de Hamburger y Hamilton. Esto generalmente requiere aproximadamente cuatro días de incubación. En el segundo día de incubación, esterilice la cáscara del huevo limpiándola con un papel absorbente empapado en etanol al 70%, luego perfore cuidadosamente el extremo plano de la cáscara del huevo usando una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros y retire cinco mililitros de albúmina.

Esto aleja al embrión de la cáscara para que el embrión no se dañe cuando se abre la cáscara. Devuelva los huevos al incubador y continúe la incubación durante otros dos días. Una vez transcurridos los dos días, use una punta roma.

Haga más. Número cinco, use fórceps para perforar cuidadosamente la parte superior media del cascarón y retire un cuadrado de cascarón de aproximadamente nueve centímetros de lado. Corte alrededor del embrión y sáquelo con cuidado, colocándolo en HBSS.

Para la disección. Todos los embriones utilizados deben estar cercanos al estadio 24. Cualquier embrión que presente signos de anormalidad debe descartarse.

Coloque el recipiente que contiene el embrión bajo un microscopio de disección. Utilice dos pinzas número cinco para retirar la membrana amniótica. La membrana corioalantoidea, el alantoides y la cabeza; a continuación, eviscere el embrión para eliminar todos los órganos internos usando tijeras de disección microscópicas para cortar a lo largo de la línea media ventral del embrión.

Luego, sostenga el embrión alrededor de la región del tronco rostral con un par de pinzas. Agarre la parte rostral del intestino y el corazón, y tire. Debe poder observar claramente los somitos del embrión.

Ahora recorte la pared corporal torácica utilizando tijeras de microdisección. A continuación, corte transversalmente el embrión por la mitad entre los brotes de las extremidades superior e inferior. Retire suavemente la mitad lumbar del embrión diseccionado utilizando dos pinzas para sostener el embrión fuera de la solución de disección y colóquelo en una placa de Petri seca usando una pipeta desechable para pasta con unos cinco centímetros de longitud.

Corte desde la parte inferior, aspire aproximadamente dos mililitros de Aros fundido al 4% peso por volumen en PBS. Pipete aproximadamente 0.5 mililitros de Aros sobre el embrión y luego aspire el fragmento del embrión dentro de la pipeta. Transfiera el embrión y el Aros a un molde plástico desprendible sin introducir burbujas en el Aros.

Baje suavemente el embrión hasta el fondo de los aros en el molde de plástico con la sección torácica orientada hacia abajo y utilice una aguja de calibre 25 para asegurarse de que el embrión esté recto. Los aros también contendrán parte del miembro en desarrollo y es importante que los embriones se coloquen verticalmente en los aros para permitir esto; coloque el molde de plástico sobre hielo durante aproximadamente dos minutos. Para solidificar los aros, tenga cuidado de que el embrión no cambie de orientación durante este período.

Configure el VT 1000 S o un modelo similar de manera que la cámara se llene con HBSS y esté rodeada de hielo. Agua fría. Utilice pegamento de contacto para fijar el bloque de aros a la plataforma del vibrátomo y luego corte el bloque con una cuchilla de afeitar, dejando el fragmento del embrión con uno a tres milímetros de aros alrededor.

Inicie el vibrátomo y comience a cortar el embrión. Se seleccionan los cortes que incluyen secciones del brote de extremidad con una cresta ectodérmica apical clara y luego se transfieren a una placa con HBSS. Por lo general, solo hay uno o dos cortes adecuados por embrión.

Retire suavemente el agarosa alrededor de las secciones de tejido utilizando dos agujas. Es esencial hacerlo de manera exhaustiva y cuidadosa. Añada 500 microlitros de solución de cultivo al número necesario de pocillos de una placa de cultivo de tejidos de adherencia ultrabaja de 24 pocillos.

Transfiera cuidadosamente las secciones desde la solución de HBSS al pocillo, colocando dos o tres secciones en cada uno, luego coloque la placa de 24 pocillos en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Tras el período de cultivo, añada 500 microlitros de fijador sin tampón a cada pocillo con secciones de embrión y deje en hielo durante 20 minutos. A continuación, aspire cuidadosamente toda la solución y lave tres veces con PBS en intervalos de cinco minutos. Luego añada 30% de sacarosa en PBS a los pocillos y coloque la placa a cuatro grados Celsius durante aproximadamente seis horas o más, hasta que las secciones se hundan.

Después de que los cortes se hundan, transfiera los cortes a una placa de Petri limpia de 10 centímetros y absorba el exceso de solución de sacarosa. A continuación, agregue un mililitro de OCT y deje que los cortes se equilibren durante cinco minutos a 20 grados Celsius. Monte cada corte plano en un molde plástico desprendible lleno de OCT después de montarlo.

Coloque los moldes verticalmente sobre hielo seco para solidificar, monte los bloques de OCT en el criostato y equilibre los bloques a menos 24 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Luego, corte cada sección en cortes de 15 micrones y móntelos sobre portaobjetos super frosts plus. Los portaobjetos pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarios para la tinción inmunofluorescente según se describe en la sección de texto del protocolo; esta imagen muestra el estado de la generación de la columna motora lateral en la etapa 24 de Hamburger y Hamilton.

La división lateral de la columna motora lateral se visualiza mediante tinción con LH X uno en el panel izquierdo. La columna motora lateral se visualiza mediante tinción con Fox P uno en el panel central y el panel derecho es una superposición de los dos canales. La línea media se muestra como una línea punteada y DV denota aquí el eje dorsal-ventral.

El estado de la división lateral de la columna motora lateral se muestra nuevamente mediante la tinción de LH X uno en el panel izquierdo y la columna motora lateral mediante la tinción de Fox P uno en el panel central, con la imagen fusionada a la derecha. Estas imágenes muestran el desarrollo en la etapa 27. Estas imágenes muestran la expresión de LH X uno a la izquierda y la expresión de Fox P uno en el panel central en secciones de una porción cultivada en un medio que favorece la supervivencia de neuronas motoras craneales disociadas.

LH X uno ya no se expresa en las neuronas motoras, aunque existe cierta supervivencia de las células de la CML evidenciada por la expresión de Fox P uno. DV representa la orientación del eje dorsal-ventral de la médula espinal, y ML representa la orientación del eje medio-lateral de la columna lateral de neuronas motoras de la médula espinal. Las células de la división lateral, nuevamente teñidas para LH X uno en el asta ventral en el panel izquierdo y la CML en general teñida para Fox P uno en el panel central, pueden observarse en cortes histológicos cultivados en medio que contiene 4% de suero de pollo y 100 nanogramos por mililitro de CNTF.

Téngase en cuenta que algunas células de la división lateral de la columna motora lateral se encuentran en una posición lateral en el asta ventral, como indica la flecha en el panel izquierdo. Esta imagen muestra el estado de expresión de LH X uno y Fox P uno en secciones de un embrión mantenido en OVO durante el cultivo de explantes del embrión mostrado previamente. Este histograma muestra los resultados de la cuantificación del porcentaje de células de la división lateral de la columna motora lateral, que son positivas para FOX P uno y LHX uno, frente a las células de la columna motora lateral, que son positivas para FOX P uno y LHX uno.

Se muestran datos negativos para células encontradas en cultivos de secciones en diferentes condiciones en comparación con embriones control mantenidos in ovo, que representan el 100 %. Los datos se analizaron utilizando la prueba t de Student. El triple asterisco representa un nivel de significancia menor a 0,01. Al intentar este protocolo, es importante tener cuidado al diseccionar el embrión y al eliminar los agros de las secciones, ya que es fundamental mantener la integridad de los axones motores en el brote de la extremidad.