Name: Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprende a rastrear selectivamente fibras auditivas en embriones de pollo mediante microinyección de tinte fluorescente en el ganglio acústico. Esta técnica permite visualizar proyecciones nerviosas con alta resolución en neurociencia del desarrollo.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Candace Hsieh para sugerencias y ayuda con técnicas de imagen y la Dra. Doris Wu por su experiencia en la anatomía del oído interno pollito durante la embriogénesis temprana. Este trabajo fue apoyado por NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 y DOE GAANN P200A120165.

1. Preparar las herramientas de disección tras y Reactivos <ul><li> Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa; 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glucosa, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) continuamente infundido con 95% de O 2/5% CO 2 a temperatura ambiente. Para la infusión, llene hasta 2/3 a 500 ml de boca ancha frasco Nalgene con un agujero perforado en la tapa. Tanque se fijan por medio de un tubo de vidrio vástago burbujeador, que penetra en el LCRa a través del agujero en la tapa del frasco. Ajustar la presión para obtener una corriente constante de burbujas que llegan a aproximadamente 1/3 del líquido, pero no son lo suficientemente fuerte como para causar salpicaduras sobre el borde. Sumergir 5 viales de vidrio ml (hasta 6) en el frasco Nalgene para separar las muestras individuales el uno del otro y de la turbulencia de flujo de gas. ACSF debe ser oxigenada durante al menos 20 min antes de cualquier tejido incubación. </li><li> Silicona pequeña placa de disección (35 mm x 10mm recubierto de Petri utilizando Sylgard élastomère Kit) con dos pernos de disección colocados en poliestireno hexagonal pequeño (47 mm inferior) pesan barco. </li><li> Dos pinzas de punta fina, una curva de punta de pinzas, un vaso de precipitados de 50 ml, y un contenedor para los residuos de tejido. </li><li> Sacó micropipeta de vidrio (1,2 OD / ID 0,9) rota a aproximadamente 20-50 micras abertura en la punta y se llena con rodamina dextrano amina (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) en una solución de 6,25% con 0,4% Triton X-100 en PBS . Conecte mediante un tubo fino para picospritzer y estabilizar a micromanipulador. </li></ul> 2. Micro-disección de revelar Papilla basilar en 4,5 E8 <ol><li> Con pinzas curvas, corte E8 embrión justo debajo del tronco cerebral, colocando la cabeza directamente sobre la placa de disección recubierto de silicona dentro peso barco. </li><li> Con los pernos de disección, la posición de la cabeza con una vista ventral por lo que el oído del lado de interés es ligeramente visible, la cabeza ligeramente inclinada hacia dorsal y apuntando 10-30 grados fuera de center (Figura 2A). Inmediatamente fijar el cabezal con pernos. Si se desea una localización bilateral, el centro de la cabeza a los 0 grados, o una vista ventral completo por lo que ambas partes pueden tener acceso. Del mismo modo, para una inyección del lado izquierdo, asegurar la cabeza de -10 a -30 grados desde el centro de manera que el lado izquierdo es accesible. </li><li> Usando el vaso de precipitados de 50 ml, transferir 30 ml de LCRa oxigenada en el plato, sumergiendo completamente el tejido. </li><li> Pellizque suavemente hacia abajo y la cáscara de la mandíbula inferior con unas pinzas de punta fina, luego retire el párpado inferior del lado de los intereses. </li><li> Retire el tejido vascular suprayacente, incluyendo cualquier paladar restante y garganta. Estos tejidos blandos pueden despegarse revelar la superficie lisa de desarrollar condrocráneo con las arterias vertebrales distintivas en su superficie. En este punto, la característica masa otoconial blanco debe ser visible. </li><li> Diseccionar cuidadosamente la piel alrededor del meato externo, el cartílago de la articulación de la mandíbula, y el oído medio, mientras que en el dejandoner oído intacto. Utilice las pinzas para cortar suavemente lejos estas estructuras cartilaginosas. </li><li> Quite las arterias vertebrales y la acumulación de sangre mediante un movimiento de barrido suave con las puntas de las pinzas finas. La sangre puede oscurecer vista y la coagulación puede tapar la abertura de la pipeta de inyección. </li><li> El conducto coclear con epitelio adyacente sensorial (papila basilar) y el ganglio acústico encuentra directamente debajo de la condrocráneo 6 y se puede visualizar como una forma alargada en forma de dedo saliente que se extiende desde el oído interno ventralmente, con la punta más distal (ápice) cerca de la anterior línea media 5. Puede haber una pequeña acumulación de sangre (roja) de la disección y / o calcificaciones otolíticos (blanco) en el vértice de la cóclea del conducto (Figura 2B) que puede ayudar en la visualización. En el vértice es la mácula lagenar, un parche sensorial cree que la función vestibular 7,8. </li></ol> 3. Etiquetado selectiva de CN VIII fibras auditivas <ol><li&gt; Coloque la pipeta de inyección cerca de la superficie del embrión en la región de la papila del conducto coclear y basilar. </li><li> Baje lentamente la micropipeta para perforar primero el cráneo. Esta región craneal es más delgada que las zonas circundantes y requiere menos fuerza para penetrar. La micropipeta ahora debe estar en el interior del conducto coclear. Opcional: una pequeña inyección de tinte trazado se puede hacer para ayudar en la visualización de la papila basilar. </li><li> Sin tener que reposicionar la micropipeta, seguir bajando hasta que sólo rompe la frontera profunda del conducto coclear (Figura 1). Realizar una inyección y repetir aquí en varias regiones a lo largo de la longitud de la papila basilar (figuras 2C, 2D), con exclusión de la punta más proximal donde la vestibular lagena se encuentra. Con la picospritzer establecido entre 10-30 psi, varias inyecciones se hacen. El volumen de fluido que se inyecta medio de contraste varía, y depende de la extensión de etiquetado deseado. Cada inyección debe dar lugar a un tinte fluorescente-lapunto Beled de aproximadamente 200 a 400 m de diámetro (Figura 2D). </li><li> Una vez que la inyección se ha completado, el uso de fórceps para seccionar la muestra por encima del tronco cerebral y el uso de una pipeta de transferencia para colocar la porción caudal en un pequeño frasco dentro del recipiente de LCRa continuamente se perfundieron con 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Para cada embrión, 20-30 min para permitir la transferencia de colorantes, en función de la distancia del centro de trazado deseado. </li><li> Quitar el tejido y prepararse para el seccionamiento histológico. En el ejemplo que se muestra aquí, el tejido se sumerge en 4% de paraformaldehído (en 1X PBS) durante la noche sacarosa,% 30 (en 1X PBS) durante la noche. </li></ol> 4. Contratinción y Análisis <ol><li> Contratinción es útil para ayudar a orientar al observador a la ubicación anatómica, así como la identificación de regiones particulares de interés. Una tinción de contraste eficaz en esta preparación es immunolabeling neurofilamentos (figuras 1, 3B, 3E), que fuertemente lAbels axones y permite la demarcación de las vías axonales en el SNC. </li><li> Análisis debe ser realizado en toda la región etiquetada, como las proyecciones pueden extenderse varios cientos de micras o más a lo largo del eje rostrocaudal. Algunos ejemplos de los análisis básicos son: las tasas de error de orientación, el tiempo y / o cambios en los patrones de divergencia de proyección. Axones marcados RDA-se visualizan en el sistema nervioso periférico y central con alta resolución (Figuras 3A, 3D). </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de intereses se declaran.

Estudios sobre el desarrollo temprano del nervio VIII se han limitado, en parte debido a la dificultad en la identificación de los axones embrionarias derivadas de los ganglios de distinta múltiple. Varios estudios han explorado las señales moleculares que guían auditivo y vestibular célula sensorial y destinos de células ganglionares durante el desarrollo temprano, 5,11,12 pero los procesos que regulan la inervación central tienen todavía por determinar. Informes de acústicos proyecciones de células ganglion...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Poliestireno Pesar Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de Petri de 35 x 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Se utiliza para hacer plato de silicona disección </td></tr><tr><td> Kit de elastómero de silicona Sylgard </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td><td> Escudo Petri plato para hacer la disección </td></tr><tr><td> Clavijas Dissection </td><td> Vario </td><td></td><td> Sostiene embrión en su lugar durante la disección </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte de la receta LCRa </td></tr><tr><td> Contenedor para LCRa. Sugerir translúcido Nalgene de boca ancha jar, 500 ml (16 onzas) con tapa. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Apertura taladro agujero en la parte superior de la tapa de vidrio del vástago bubling para penetrar líquido </td></tr><tr><td> Vacío 5 ml vial de vidrio o vial transparente comparable </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; usa durante la incubación LCRa para mantener las muestras separadas unas de otras y de la corriente de burbujeo </td></tr><tr><td> Tanque de carbógeno (95% O 2/5% CO 2) conectado mediante un tubo a burbujeador </td><td> Vario </td><td></td><td> Conecte mediante un tubo de vidrio pelele madre para infusión en LCRa </td></tr><tr><td> Vidrio tallo burbujeador </td><td> Vario </td><td></td><td> Para infundir carbógeno en LCRa </td></tr><tr><td> Curva de punta de pinzas </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501008 </td><td> Para quitar la cabeza de embrión de huevo </td></tr><tr><td> Dos pinzas de punta fina </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td> Para los micro-disección </td></tr><tr><td> 50 ml Vaso </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodamina dextrano Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> vario </td><td> Fluorescente axón trazador </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución salina tamponada con fosfato, (PBS 1X) </td><td> Vario </td><td></td><td> Reactivo de laboratorio estándar </td></tr><tr><td> Pared Delgada capilares de vidrio, 1,2 OD, ID 0.9 de 4 &quot;(100 mm) de longitud </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW120F-4 </td><td> Cargue con RDA. Cada capilar hace dos micropipetas de vidrio </td></tr><tr><td> Aguja / extractor de pipetas </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 720 </td><td> Ajustes utilizados: Calor 16,4, 2,2 solenoide </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> vario </td><td> Conecte mediante un tubo fino de vidrio micropipeta </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Narishige </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Disección microscopio con fluorescencia </td><td> Vario </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4% de paraformaldehído </td><td> Vario </td><td></td><td> Reactivo de laboratorio estándar </td></tr><tr><td> anticuerpo anti-neurofilamentos, opcional </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Seguir el protocolo recomendado por el fabricante histológico </td></tr><tr><td> Criostato y materiales conexos para seccionar </td><td> Leica </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia para formación de imágenes </td><td> Zeiss, diversos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastreo selectivo de fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

El embrión de pollo es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de las proyecciones de células ganglionares centrales y periféricas. En el sistema auditivo, el etiquetado selectivo de los axones en el nervio auditivo craneal VIII aumentaría el estudio del desarrollo central de circuito auditivo. Este enfoque es un reto porque varios órganos sensoriales del oído interno contribuir al nervio VIII 1. Además, los marcadores que distinguir confiablemente auditivo frente a los grupos vestibulares de los axones a la aviar nervio VIII aún no se han identificado. Vías auditivas y vestibular no pueden distinguirse funcionalmente en los embriones tempranos, como sensoriales evocados por las respuestas no están presentes antes de los circuitos se forman. Centralmente se proyectan axones del nervio VIII han sido localizados en algunos estudios, pero auditivo etiquetado axón fue acompañado por el etiquetado de otros componentes nerviosos VIII 2,3. Aquí se describe un método para la anterógrada trazado del ganglio acústico para selectivamente label axones del nervio auditivo dentro VIII desarrollo. En primer lugar, después de la disección parcial de la región cefálica anterior de un embrión de pollo de 8-día sumergido en fluido cerebroespinal artificial oxigenado, el conducto coclear es identificado por puntos de referencia anatómicos. A continuación, una micropipeta fina tira de cristal está posicionado para inyectar una pequeña cantidad de rodamina dextrano amina en la región profunda del conducto y adyacente donde las células ganglionares de la acústicos se encuentran. Dentro de los treinta minutos después de la inyección, los axones auditivos se remontan centralmente en el cerebro posterior y más tarde se puede visualizar después de la preparación histológica. Este método proporciona una herramienta útil para los estudios de desarrollo de periféricos al centro de formación de circuito auditivo.

Los componentes del nervio VIII y la anatomía del propio nervio son complejas y enrevesadas (Figuras 1, 3). Por selectivamente rastreo de fibras que surgen a partir de células ganglionares de la acústicos, los segmentos del nervio VIII, así como los aferentes primarios auditivas dentro del tronco encefálico puede ser limpiamente trazado y distinguirse de sus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Del mismo modo, esta técnica podría ser utilizada para estudiar proyecciones periféricas de...

Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

El objetivo de este procedimiento es trazar selectivamente las fibras auditivas desde el sistema nervioso periférico hasta el sistema nervioso central en un embrión. Esto se logra primero realizando una sección de microdosis para revelar el condrocráneo ventral e identificar el conducto coclear aviar. El segundo paso consiste en realizar una microinyección en las células del ganglio acústico subyacente y sus axones.A continuación, la muestra se incuba en LCR artificial oxigenado durante 20 minutos para permitir la transferencia de DIA. Finalmente, una preparación histológica y la sección del tejido permiten la visualización microscópica de las proyecciones centrales del ganglio acústico. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes son que permite el rastreo selectivo del nervio octavo.Las fibras auditivas con alta resolución permiten una transferencia rápida del colorante en tejido vivo y posibilitan experimentos en una etapa temprana del desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva. Por ejemplo, ¿cuáles son las moléculas que guían a los axones hacia sus objetivos centrales?O cómo responde la

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Plenario de células patch-clamp grabaciones de las dendritas de fibras nerviosas auditivas en la sinapsis cinta del pelo interior de células de la cóclea de los mamíferos.

Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

Este video muestra el proceso de preparación de cortes de cerebro en forma de cuña en un entorno de laboratorio. Usando un vibrátomo, se elabora una rebanada en forma de cuña del cerebro de un ratón con un grosor variable. Este corte contiene la raíz del nervio auditivo ubicada en el extremo más grueso, mientras que las neuronas relacionadas con la audición se encuentran en el extremo más delgado.

Preparación de cortes de cerebro en cuña para visualizar neuronas auditivas

¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

El órgano auditivo media la audición. En este trabajo presentamos un método modificado de microelectroporación in ovo optimizado para el estudio de la proliferación y diferenciación de células progenitoras auditivas en el órgano auditivo de pollo en desarrollo.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.

Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos

Hemos utilizado técnicas estándar de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) y las hemos aplicado a pollos lactantes, un modelo aviar precoz para la función auditiva. El protocolo describe en detalle las técnicas de preparación animal y adquisición de ABR, con pasos que podrían traducirse a otros modelos de aves o roedores.

Evaluación de la respuesta auditiva del tronco encefálico en crías de pollo

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

Aprende a rastrear selectivamente fibras auditivas en embriones de pollo mediante microinyección de tinte fluorescente en el ganglio acústico. Esta técnica permite visualizar proyecciones nerviosas con alta resolución en neurociencia del desarrollo.

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

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