Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo obtener poblaciones enriquecidas de neuronas del hipocampo y neuronas individuales a partir de secciones de tejido congelado mediante microdisección por captura láser para su posterior análisis de expresión génica. Esto se logra mediante la anestesia inicial, una rata en una cámara anestésica. A continuación, se intuba a la rata, se ventila mecánicamente y se coloca en un soporte de cabeza estereotáxico para preparar a la rata Para la lesión cerebral por percusión fluida, se realiza una craneotomía.

El segundo paso es administrar la lesión cerebral por percusión fluida. A continuación, las secciones coronales del cerebro se cortan en un criostato y se tiñen con fluorescente, un marcador de neuronas en degeneración, o violeta real, una tinción de misil. El paso final es realizar una microdisección de captura láser y recolectar neuronas individuales o grupos de neuronas.

En última instancia, el ARN total se aísla de las células capturadas, se analiza la calidad y se cuantifica mediante un bioanalizador Agilent y se utiliza en aplicaciones posteriores como la PCR cuantitativa en tiempo real y el análisis de microarrays centrados en vías o de todo el genoma. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes como la micro disección manual, es que podemos obtener poblaciones enriquecidas de neuronas u otros tipos de células cerebrales como células gliales o inmunomoduladoras, o neuronas individuales a partir de secciones de tejido. Esto nos permite realizar análisis de expresión génica en distintos tipos de células identificadas en el cerebro y en otros tejidos heterogéneos compuestos por múltiples tipos de células, lo que no permitirá demostrar este procedimiento.

Debbie Boone, investigadora asociada sénior en nuestro laboratorio. Primero recupere el tejido cerebral obtenido de ratas con percusión de fluidos, lesión cerebral traumática o lesión simulada del congelador a menos 80 grados Celsius, y transfiéralo a menos 22 grados Celsius. Criostato durante 10 minutos para llevar el cerebro a la temperatura de sección mientras el cerebro se descongela.

Limpie el criostato con una descarga de ARN que contenga etanol y limpie los cepillos con etanol. Después de los 10 minutos transcurridos, retire el cerebro del tubo y colóquelo con el lado ventral hacia arriba sobre un trozo de gasa en la etapa de criostato, use una hoja de afeitar nueva y corte el cerebro para extraer la porción posterior del cerebro. Justo rostral al cerebelo y la porción anterior al quiasma óptico.

Llene un molde criogénico con medio de montaje OCT y coloque el cerebro en el molde con la parte anterior hacia abajo. Deje que el tejido cerebral se congele en el medio de montaje hasta que se vuelva blanco. Esto debería tomar aproximadamente 10 minutos.

Ahora congele el disco de muestra en el cerebro con OCT. A continuación, retira el molde. Inserte el disco con el cerebro conectado en la cabeza de la muestra y apriete los tornillos.

Inserte una hoja desechable de perfil bajo en el portacuchillos y apriete la palanca hacia abajo. Comience a cortar el cerebro a 20 micras para eliminar la capa exterior de OCT. Una vez que se alcance la región del hipocampo, ajuste el dial de micras a 10.

Recoja las secciones seriales coronales colocando un portaobjetos de vidrio o un vaso adicional. Deslízalo sobre la sección de pañuelos. Coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción libre de ARN a menos 20 grados centígrados hasta que se complete el corte.

Antes de proceder a teñir las secciones, limpie todos los recipientes de tinción y los cilindros graduados con ese y enjuague con agua mili Q. Asegúrese de que todas las soluciones se hayan preparado con agua libre de ARN y que la tinción de violeta crestal y jade fluorado haya pasado antes por un filtro de 0,2 micras. Use secciones de cerebro de Thor a temperatura ambiente durante 30 segundos y fíjelas en etanol al 75% durante un minuto.

A continuación, proceda a la contratinción adecuada para LCM de franjas de neuronas o neuronas individuales para LCM de franjas de neuronas después de la fijación, enjuague los portaobjetos en ARN con agua libre durante un minuto y tinte con 1% de violeta cresta durante un minuto. Enjuague con agua libre de ARN tres veces durante un minuto cada una, deshidrate con etanol al 95% dos veces durante 30 segundos cada una. A continuación, etanol al 100% dos veces durante 30 segundos y xileno dos veces durante tres minutos cada uno.

Después de teñir, seque al aire todas las secciones en una campana extractora durante 15 minutos y luego proceda a LCM.Here. Se realiza LCM. Usando un microscopio de células P dos E con un láser de diodo infrarrojo, primero ajuste el joystick central a la posición vertical.

A continuación, gire y bloquee el objetivo de Forex en su posición. Coloque un portaobjetos con secciones del hipocampo teñidas en el centro de la platina del microscopio y ajústelo manualmente hasta que la región del hipocampo esté a la vista. Utilice el curso y encuentre ajustes de enfoque.

Para enfocar la sección, active el mandril de vacío presionando el botón de vacío en el controlador. A continuación, gire y bloquee el objetivo 10 x en su lugar. Vuelve a concentrarte con el rumbo y los ajustes finos.

Cargue las tapas de sus tapas LCM macro en las tapas, su módulo de casete y coloque una tapa en la posición de la línea de carga. Gire el brazo de colocación de la tapa y colóquelo alrededor de la tapa. A continuación, levante el brazo de colocación de la tapa para quitar las tapas de la tapa del módulo de casete.

Gire el brazo de colocación de la tapa sobre la corredera y luego bájelo sobre la corredera para colocar la tapa en la corredera. Ajuste el enfoque fino y mueva el joystick para verificar si las celdas están dentro del círculo negro en la tapa. Todas las celdas a capturar deben estar dentro de este círculo negro.

Ahora configure los parámetros del láser. Primero presione el botón de habilitación láser en el controlador. El punto objetivo del láser será visible de color rosa.

en el campo de visión en el monitor de la computadora. Establezca el tamaño del punto láser en pequeño para enfocar el láser y ajuste la potencia y la duración a 65 a 75 milivatios durante uno o dos milisegundos, según sea necesario para una captura celular óptima. Para probar el láser, use el joystick para mover el punto láser a un área donde no haya celdas para recoger.

Dispare el láser con el interruptor de pulgar. Luego, use el joystick para alejar el punto láser del punto de polímero derretido y verifique si hay un anillo oscuro visible alrededor de un área clara donde se disparó el láser. Para capturar células, use el joystick para mover el punto láser sobre el área de células para capturar y disparar el láser.

Con el interruptor de pulgar, mueva el joystick mientras dispara el láser para capturar un área grande de celdas. Después de disparar todas las celdas de interés, levante el brazo de colocación de la tapa. Las células capturadas se separarán de la sección de tejido y se adherirán a la tapa.

Su gorra, el tejido restante y las células faltantes serán visibles en el campo de visión. Las celdas de la tapa también se pueden ver colocando la tapa en una parte vacía de la diapositiva. Levante el brazo de colocación de tapas y gírelo hasta la estación de descarga de tapas.

Baje la tapa en la estación y gire el brazo de colocación de la tapa a su posición anterior. Deslice la tapa de su herramienta de inserción a lo largo de la plataforma y sobre la tapa. Levante la herramienta con la tapa colocada desde la plataforma.

Toque ligeramente la tapa con la parte adhesiva de una nota adhesiva para limpiar el tejido no deseado. Coloque la tapa en un tubo libre de ARN de 0,5 mililitros lleno de 100 microlitros de tampón de lisis obtenido del kit de microaislamiento acuoso RN. Inmediatamente vórtice la tapa durante 30 segundos para mentir.

Las células incuban las muestras a 42 grados centígrados durante 30 minutos y se congelan a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. El procedimiento de tinción para la LCM de neuronas individuales lesionadas después de la fijación es similar al procedimiento para franjas de neuronas. Sin embargo, algunos tiempos de incubación difieren y las secciones se mantienen con fluoruro durante cuatro minutos antes del enjuague y la deshidratación, consulte la parte del texto del protocolo para obtener detalles después de la tinción.

Nuevamente, seque al aire todas las secciones en una campana extractora durante 15 minutos. Antes de proceder a LCM para capturar la carga de celdas individuales, capture las tapas HS LCM en la tapa o el módulo de casete utilizando el mismo procedimiento que para la tapa macro LCM. Nuevamente, establezca el tamaño del punto láser en pequeño para enfocar el láser, pero esta vez ajuste la potencia y la duración del láser a 65 a 75 milivatios durante 0,45 a 0,5 milisegundos para una captura celular óptima de celdas individuales.

Gire el brazo de colocación de la tapa sobre la corredera y baje el brazo hacia la corredera. Para colocar la tapa sobre el portaobjetos, la superficie de la tapa HS de captura se coloca elevada de la muestra. Durante el LCM, use el joystick para mover el láser sobre celdas positivas de ayuda de flúor individuales.

Todas las células que se capturan deben estar dentro del pequeño anillo negro en la tapa, dispare el láser usando el interruptor de pulgar. Cuando todas las células dentro del área del círculo negro se han disparado con el levantamiento láser, el brazo de colocación de la tapa, las células capturadas se separarán de la sección de tejido y se adherirán a la tapa hs de captura. Ahora coloque otro portaobjetos en la platina del microscopio y recoja las células positivas de fluorescencia hasta que el tapón HS esté lleno.

A continuación, coloque la tapa en un tubo libre de ARN de 0,5 mililitros lleno de 40 a 50 microlitros de lisis, tampón y vórtice e incubadoras antes de volver a congelar a menos 80 grados centígrados. Si no es así, realice inmediatamente el aislamiento de ARN de acuerdo con las instrucciones de la parte de texto del protocolo. Las siguientes imágenes muestran la microdisección de captura láser de franjas de poblaciones celulares específicas del cerebro de rata congeladas en secciones coronales de 10 micras del cerebro de rata.

Se prepararon de acuerdo con este protocolo y se tiñeron con violeta crestal y tinción de misil. Esta imagen muestra neuronas parametálicas de los subcampos ca uno a ca tres del hipocampo de la rata. Aquí, se han capturado células granulosas en el giro dentado del hipocampo.

Por último, mostramos franjas de neuronas capturadas de los núcleos bilaterales de supra quiasma situados a ambos lados del tercer ventrículo y por encima del quiasma óptico. El SCN contiene el reloj circadiano maestro que controla los ritmos circadianos en todo el cuerpo. Las siguientes imágenes muestran la microdisección por captura láser de neuronas individuales del hipocampo de rata.

Aquí se muestran tres neuronas en el hipocampo positivo con fluoruro en degeneración, tres neuronas que sobreviven a la ayuda fluro negativa, tres neuronas antes y después de LCM, se muestran las células capturadas y se visualizan en la tapa de LCM. Las siguientes imágenes mostraron el análisis de la expresión génica del ARN total, aislado de neuronas capturadas con láser. Esta imagen muestra datos cuantitativos de PCR en tiempo real de la expresión génica del reloj circadiano en el SCN.

Este mapa de calor de la expresión génica en neuronas del hipocampo moribundas y supervivientes muestra el perfil de expresión de genes relacionados con la apoptosis mediante matrices de PCR enfocadas. Finalmente, mostramos un ejemplo de un mapa de calor generado a partir de un análisis de microarrays ENT de genoma completo de la expresión génica en una a tres neuronas de ratas que recibieron una lesión simulada TBI o TBI más un virus siRNA adenoasociado reclinado diseñado para reducir la expresión de óxido nítrico neuronal, sintasia o glutatión peroxidasa, uno. ambos son genes inducidos por una lesión cerebral después de su desarrollo. Estas técnicas allanaron el camino para los científicos en muchos campos de investigación, incluidas las lesiones cerebrales y el cáncer, que utilizan modelos animales de estos trastornos para realizar perfiles genómicos, proteómicos y metabólicos de poblaciones celulares específicas.

Por ejemplo, actualmente estamos utilizando estas técnicas para capturar con láser poblaciones celulares específicas de la corteza prefrontal y las áreas cerebrales del núcleo accumbens que se sabe que están involucradas en la adicción.