Name: Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprende microdisección láser para aislar neuronas del hipocampo en cerebro de rata tras lesión traumática. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica por PCR y microarrays.

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Este trabajo está financiado por R01 NS052532 (a HLH), la Fundación Moody, y el Departamento de Anestesiología. Damos las gracias a Laurie Bolding, Christine Courteau Butler y Christy Perry por su asistencia editorial, y Christy Perry para el diseño y la producción excelente de todas las figuras, tablas e ilustraciones.

1. Procedimientos Quirúrgicos y percusión Fluid TBI <ol><li> Todos los experimentos con animales son primero aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Texas Medical Branch, Galveston, Texas, y los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8 ª Edición, National Research Council). </li><li> Las ratas (adulto macho Sprague-Dawley, 400-500 g obtenidos de proveedores Charles Rivers, Portland, Maine) están alojadas dos por jaula y proporcionó alimentos y agua ad libitum en un vivario con estas condiciones constantes: ciclo de luz (600 a 1.800 hr h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) y humedad (40% a 50%) una semana antes de su uso. </li><li> Se anestesia ratas con un 4% isoflurano, intubar y ventilar mecánicamente (NEMI Científico; New England Medical Instruments, Medway, MA) las ratas con 1.5-2.0% de isoflurano en oxígeno: el aire (70:30) y prepararlos para parasagital por perfusión lesiones como se ha descrito previamente. 8, 10 </li><li> Sacrificar las ratas en el punto de tiempo apropiado después de la lesión dependiendo del diseño experimental. Quite rápidamente el cerebro, congelar inmediatamente en hielo seco, y se almacena a -80 º C en un tubo de 50 ml o proceder de inmediato a integrar en octubre para la sección congelada. </li></ol> 2. De sección y tinción de cerebro de rata <ol><li> El tejido cerebral que no se usa inmediatamente se puede mantener a -80 º C durante hasta un mes si se mantiene a una temperatura constante. Los cerebros que se congelan a -80 º C, después se descongeló a -20 ° C para su seccionamiento, y luego volver a congelar no producen ARN de calidad después de la descongelación segundos. Una vez que el cerebro se descongela, montado en OCT y se seccionaron, diapositivas debe ser coloreada dentro de 24 horas y se utiliza para LCM dentro de 30 min a una hora de tinción. Esto asegurará ARN de buena calidad. Después de LCM, las células capturadas en las tapas de LCM se pueden almacenar en tampón de lisis a -80 ° C durante hasta una semana, pero el ARN se aisló de una manera oportuna para asegurar la más alta calidad. &lt;/ Li&gt; <li> Antes de seccionar el cerebro, limpie el criostato con RNasa-Zap y limpiar los pinceles con ETOH (reemplace la cuchilla desechable entre cada cerebro). </li><li> Recuperar el cerebro en el tubo de 50 ml a partir de la -80 ° C congelador; colocarlo en el criostato a una temperatura de -22 ° C y descongelación en el tubo durante aproximadamente 10 min. Retire el cerebro del tubo y el lugar en el escenario en una gasa, lado ventral hacia arriba. </li><li> Usando una hoja de afeitar, cortar el cerebro para eliminar la parte posterior del cerebro, justo rostral del cerebelo y la parte anterior en el quiasma óptico. Llene una criomolde con OCT medio de montaje (Tissue Tek), y el lugar del cerebro en el molde con el lado anterior hacia abajo. Permitir que el tejido cerebral para congelar en el medio de montaje hasta que se vuelve blanca (aproximadamente 10 min). </li><li> Congelar la platina (Tissue Tek) en el cerebro con octubre Eliminar el cerebro del molde. Inserte el cerebro dentro de la cabeza muestra y apriete los tornillos. </li><li> Inserte un Disposable, hoja de perfil bajo (Fisher Scientific) en el porta cuchillas y apriete la palanca hacia abajo. </li><li> Comience cortando el cerebro a 20 micras para eliminar la capa externa de octubre Una vez que la región del hipocampo se alcanza, ajuste el dial de micras a 10. Recoger coronal secciones en serie mediante la colocación de una placa de vidrio o portaobjetos de vidrio más en la sección de tejido (Fisher Scientific). Los portaobjetos se conservaron a -20 ° C en un bastidor de tinción libre de RNasa hasta seccionamiento es completa. </li><li> Para eliminar todas las RNasas de vidrio donde se procesan las secciones de tejido, limpie todos los recipientes de tinción y probetas graduadas con ELIMINase (Fisher Scientific) y enjuague con agua Milli Q. Preparar todas las soluciones con agua libre de RNasa y se filtra el violeta de cresilo (Sigma-Aldrich) y Fluoro-Jade (Histo-chem) mancha con un filtro de 0,2 micras antes de su uso. </li><li> Descongelar las secciones del cerebro a TA durante 30 seg y se fijan en 75% de EtOH (1 min). </li><li> Por LCM de neuronas lesionadas después de la fijación, enjuague los portaobjetos en agua libre de RNasa (1 min), Contratinción con un 1% cresil violeta (15-20 seg), enjuague con agua libre de RNasa (2 x 30 segundos), se tiñen con fluoro-Jade (4 min), enjuague con agua libre de RNasa (3 x 1 min), deshidratar con 95% de EtOH a partir de agua libre de RNasa (30 seg), 100% de EtOH (30 seg), y xileno (2 x 3 min). </li><li> Para LCM de franjas de las neuronas después de la fijación, enjuague los portaobjetos en agua libre de RNasa (1 min), se tiñen con 1% de violeta de cresilo (1 min), enjuagar en agua libre de RNasa para (3 x 1 min), se deshidrata con 95% ETOH (2 x 30 seg), 100% de EtOH (2 x 30 seg), y xileno (2 x 3 min). </li><li> Secar al aire todas las secciones en una campana de humos durante 15 min antes de la LCM. Las diapositivas se pueden almacenar, los laterales de sección arriba, en una caja de diapositivas llenas de desecante, si tienen que ser transferidos de una habitación a otra. Sin embargo, se obtienen resultados óptimos si LCM se realiza inmediatamente después de las secciones están secos. LCM debe limitarse a partir de 30 min a 1 hr. En la siguiente sección, se describe primero cómo captar franjas continuas de células, que es eaSiest de dominar para los que están aprendiendo esta técnica. A continuación se describe cómo capturar con precisión las neuronas individuales. En nuestro procedimiento, se identifican las neuronas que mueren por su afinidad por-fluoro-Jade un marcador de neuronas en degeneración. Células fluoro-Jade-negativas se presume que sobrevivir neuronas. </li></ol> 3. Laser captura microdissection (LCM) Mcm de franjas de poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo <ol><li> LCM se realiza usando un microscopio PixCell IIe con un láser de diodo de infrarrojos (Life Technologies). </li><li> Ajustar la palanca de mando central a la posición vertical. Gire y asegure el objetivo de 4X en su posición. </li><li> Colocar un portaobjetos en el centro de la platina del microscopio y ajustar manualmente hasta que la región del hipocampo está a la vista. Usar ajustes de enfoque grueso y fino para que la imagen enfocada. </li><li> Activar el mandril de vacío presionando el botón de vacío en el controlador. Gire y asegure el objetivo de 10X en place. Enfoque de nuevo con ajustes gruesos y finos. </li><li> Cargue el CapSure Macro LCM tapas (Life Technologies) en el módulo de casete CapSure y la posición de una tapa en la posición de la línea de carga. Gire el brazo de colocación y Cap posición alrededor de la tapa. Levantar el brazo de colocación Cap de quitar la tapa CapSure desde el módulo de casete. </li><li> Girar el brazo de colocación del tapón sobre la diapositiva y bajar el brazo hacia abajo sobre la corredera, lo que se coloque la tapa sobre el portaobjetos. Ajuste el enfoque fino y mover la palanca de control para comprobar si las células están dentro del círculo negro en la tapa. Todas las capturas de celulares deben estar dentro de este círculo negro. </li><li> Establezca los parámetros del láser. Primero, pulse el botón de láser a habilitar en el controlador. El punto blanco de láser será visible como un punto rosa en el campo de visión en el monitor del ordenador. </li><li> Establecer el tamaño del punto láser a pequeño (7,5 m) para enfocar el láser y ajustar la potencia y la duración de 65 a 75 mW, para 1.0-2.0 mseg como necesaria para la captura óptima de la célula. </li><li> A Tést el láser, utilice el joystick para mover el punto de láser en un área donde no hay celdas para recoger. Disparar el láser con el interruptor de pulgar. Utilice el joystick para mover el punto de láser de distancia desde el punto de polímero fundido y comprobar para ver si un anillo oscuro visible rodea un área clara donde se disparó el láser. </li><li> Para capturar celdas, utilice el joystick para mover el punto láser sobre el área de las células a la captura. Disparar el láser con el interruptor de pulgar. Mover la palanca de mando durante el disparo del láser para capturar una gran superficie de las células. Cuando el láser es disparado se funde la película de polímero termoplástico en la tapa a la superficie de las células diana. El polímero absorbe la radiación láser, por tanto, no alterar el ARN, ADN o proteína de garantizar la integridad de la muestra para futuras aplicaciones moleculares. </li><li> Después de disparar todas las células de interés, levante el brazo de colocación Cap. Las células capturadas se separará de la sección de tejido y se adhieren a la tapa CapSure. El resto del tejido y las células que faltan serán visible en el campo de visión. Las células de la tapa también se pueden ver mediante la colocación de la tapa en una parte vacía de la corredera. </li><li> Levante el brazo de colocación tapa y gírela hasta la estación de descarga Cap. Bajar la tapa en la estación y girar el brazo de colocación Cap de nuevo en su posición anterior. </li><li> Deslice la herramienta de inserción CapSure a lo largo de la plataforma y en la tapa. Levante la herramienta de la plataforma. La tapa quede unida. Toque ligeramente el tapón a la almohadilla de limpieza CapSure para limpiar el tejido no deseado. </li><li> Coloque la tapa en un 0,5 ml de RNasa libre de tubo relleno con 100 l de tampón de lisis obtenido de la RNAqueous Micro-Kit de aislamiento. Inmediatamente vórtice de la tapa durante 30 segundos para lisar las células. Incubar las muestras a 42 º C durante 30 min y se congelan a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN. </li></ol> LCM individuales de FJ + neuronas en el hipocampo <ol start="15"><li> Para captar células individuales, cargue CapSure HS LCM tapas en el módulo de casete CapSure y positien una tapa en la posición de la línea de carga. Gire el brazo de colocación tapa y colóquela alrededor del tapón. Levantar el brazo de colocación Cap de quitar la tapa CapSure desde el módulo de casete. </li><li> Establecer el tamaño del punto láser a pequeño (7,5 m) para enfocar el láser y ajustar la potencia del láser y la duración a 65 -75 mW de 0,45 a 0,50 ms para la captura óptima de la célula de las células individuales. </li><li> Girar el brazo de colocación del tapón sobre la diapositiva y bajar el brazo hacia abajo, hacia la diapositiva. Esto colocará la tapa sobre el portaobjetos. El Capsure HS superficie de la tapa se sienta elevado de la muestra durante la LCM. </li><li> Utilice el joystick para mover el láser sobre un solo FJ + células. Todas las células están capturados deben estar dentro del pequeño anillo negro en la tapa. Disparar el láser con el interruptor de pulgar. </li><li> Cuando todas las células en el área del círculo negro se han disparado con el láser, levante el brazo de colocación Cap. Las células capturadas se separará de la sección de tejido y se adhieren a la tapa CapSure HS. </li><li> Coloque otra diapositiva en las microsafrontar el escenario y recoger FJ + células hasta que la tapa HS está lleno. Coloque la tapa en un 0,5 ml RNasa libre de tubo lleno de 40-50 l de tampón de lisis. Inmediatamente vórtice de la tapa durante 30 segundos para lisar las células. Incubar las muestras a 42 º C durante 30 min y se congelan a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN. </li></ol> 4. Aislamiento de ARN total a partir de muestras LCM (Esta sección sólo se describirá en la presentación de vídeo) <ol><li> El ARN total de las células se aisló utilizando el kit RNAqueous-Micro (Ambion) siguiendo los protocolos del fabricante. Todos los reactivos y soluciones de lavado se incluyen en este kit. Humedecer previamente el conjunto de cartucho de filtro micro mediante la adición de 30 l de solución tampón de lisis para el filtro. Después de 5 min, se centrifuga el filtro durante 30 segundos a 10.000 x g. </li><li> Añadir 3 l de aditivo LCM para el lisado de muestras, la pipeta para mezclar y centrifugar. </li><li> Añadir 52 l de EtOH al 100% (medio volumen) al lisado de la muestra; pipeta para mezclar, y transferir el lisado al filtrocolumna. </li><li> Se centrifuga la columna de filtro a 10.000 x g durante 1 min para unir el ARN a la columna. Si hay múltiples tapas para una muestra, haga girar cada lisado a través de la misma columna por separado. </li><li> Complete el procedimiento de aislamiento de ARN como se describe en el kit RNAqueous Micro. </li><li> Realizar DNasa tratamiento y la inactivación de la DNasa LCM muestras de ARN como se describe en el kit, la transferencia de los ARN a un tubo libre de RNasa y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Cuantificación y aplicaciones posteriores Evaluación de la calidad del ARN y la cuantificación se realiza con un Agilent Bioanalyzer utilizando reactivos del Kit de Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. <ol><li> El ARN total se analizaron en un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). El software evalúa la concentración y la integridad de la muestra de ARN mediante la asignación de un número de integridad del ARN (RIN) a cada muestra f vanROM 1 a 10. 1-5 indica ARN degradado y 7-10 indica ARN de buena calidad. </li><li> No degradados ARN intacto serán utilizados para PCR en tiempo real; individuales ensayos TaqMan o RT2 matrices de perfiles utilizando SYBR verde-química. El ARN también se puede utilizar para el análisis de mRNA microarrays y el análisis de microarrays de microARN. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.

Esta técnica LCM nos ha permitido lograr avances significativos en la comprensión de los mecanismos moleculares de la LCT. 8,10,11,12,13 Fuimos los primeros investigadores que utilizan esta técnica para demostrar que diferentes subregiones del hipocampo de rata tienen perfiles de expresión de genes que correlaciona con su vulnerabilidad selectiva a una lesión. Nuestros estudios mostraron que pudiéramos cuantificar la expresión génica, por qPCR, de tan sólo 10 células láser capturados y que podríamos realizar genoma en todo el análisis de microarrays de tan sólo 600 células capturadas. LCM sería una herramienta valiosa en estudios similares de otras regiones del cerebro que se sabe que están implicados en diversos trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos. Por ejemplo, los estudios que utilizan LCM han arrojado luz sobre la patogénesis de la enfermedad de Parkinson en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, 14 y ayudados en todo el genoma estudios de perfiles del núcleo accumbens, que participa en los circuitos de recompensa implicados en strastornos de abuso de sustancias. ubstance 15 Heterogeneidad neuronal se refleja en el nivel de genoma y 16 pueden contribuir a la falta de éxito de los tratamientos experimentales para la LCT en ensayos clínicos. Por lo tanto, nuestro objetivo es utilizar esta técnica para investigar los elementos críticos que influyen en la supervivencia neuronal después de TBI. Nuestra reciente en todo el genoma estudio de perfiles de morir y adyacente sobrevivir las neuronas del hipocampo después de TBI sugiere que un reóstato celular que refleja la relación de los niveles de expresión de genes de la supervivencia celular a la muerte celular regula el destino celular después de TBI. Estos estudios en curso contribuirá al diseño y desarrollo de estrategias farmacoterapéuticas que pueden influir positivamente en el reóstato supervivencia celular. Por otra parte, actualmente utilizamos LCM para rastrear y controlar los efectos de los posibles tratamientos farmacológicos terapéuticos en las neuronas del hipocampo después de la lesión cerebral traumática. Por lo tanto, nuestros estudios demuestran que dado cuidadosas RNasa libre de las técnicas de manipulación y algunosmodificaciones de los protocolos existentes, es posible obtener alta calidad de muestras de ARN de LCM para análisis cuantitativo exacto la expresión génica. Sin embargo, hay algunas trampas asociadas con las técnicas LCM. Por ejemplo, recogiendo sólo las células neuronales sin ningún tipo de contaminación microglia puede ser casi imposible. En la capa de células piramidales del hipocampo se ha estimado que el 95% de las células son neuronas con 90% de esta población a ser células piramidales y las interneuronas 10%, dejando un pequeño porcentaje de los tipos de células gliales y otras. 8,17, 18 En nuestros estudios utilizamos fluoro-jade un tinte fluorescente que específicamente sólo etiquetas neuronas lesionadas en el tejido cerebral. Una mancha diferente que es un marcador para GFAP sería necesario para teñir microglia. 19 recogiendo sólo las jade fluoro-manchado cuerpos neuronales individuales asegura una población más homogénea de las neuronas. Otro problema común que puede requerir la solución de problemas es que hay un círculot se define cuando el láser se dispara. Si esto ocurre, es necesario comprobar los parámetros del láser y ajustar la potencia y la duración según sea necesario. También es importante asegurarse de que la tapa se coloca plano en el tejido y colocada correctamente en el brazo. En referencia a la dirección técnica LCM o llamar al soporte técnico a veces será necesario. Después de LCM y el aislamiento de ARN, la calidad de la ARN siempre deben ser evaluados utilizando un bioanalizador antes de cualquier análisis de la expresión génica. Hay varios tipos de instrumentos de captura láser actualmente en el mercado, incluyendo el corte por láser (Life Technologies, Leica Microsystems) y el láser catapultando (Zeiss) instrumentos. Nuestro sistema LCM funciona bien para la captura de pequeñas cantidades de células. Otros sistemas de alto rendimiento y más automatizado puede ser más adecuado para obtener un número mayor de células para el análisis genómico y proteómico en particular. En efecto, LCM utilizando estos sistemas automatizados tiene un gran potencial para el análisis de prOtein expresión en células identificadas o poblaciones enriquecidas de células. 20 Por otra parte, LCM puede facilitar el análisis de la expresión génica de las células inmunomarcadas, 21 lo que nos permite investigar la expresión génica en los tipos de células definidas independientemente de la complejidad en los tejidos más heterogéneos. Por lo tanto, LCM es una excelente herramienta para el corte-borde estudios moleculares de las poblaciones individuales o enriquecida de células.

Análisis de expresión génica de tejidos heterogéneos siempre ha sido problemática;. Esto es particularmente cierto en el cerebro de los mamíferos, que tiene aproximadamente 5.000 diferentes tipos de células 4 Antes del desarrollo de la microdisección por captura láser (LCM) técnica, los estudios genómicos de los efectos de la lesión cerebral traumática in vivo se basaron en el análisis de la expresión de genes en una población mixta de células cerebrales que comprenden, no sólo de diferentes tipos de células neuronales, pero también de células gliales de sostén e inmunomoduladoras. Los perfiles complejos resultantes de expresión génica obtenidos a partir de estos tejidos heterogéneos, y los patrones de frecuencia en conflicto de lesión inducida por señales celulares, puede ser una explicación para el fracaso en ensayos clínicos humanos de estrategias terapéuticas demostrado ser eficaz en estudios pre-clínicos de lesión cerebral traumática. 5 Para obtener una comprensión clara de la expresión génica inducida por la lesión en poblaciones vulnerables de las neuronas de la cadera ratahipocampo, hemos adoptado la técnica de la LCM, por primera vez por Emmert-Buck et al. 3 Posteriormente, se ha modificado y optimizado esta técnica de microdisección por captura eficiente de las poblaciones enriquecidas de las neuronas y las neuronas individuales para perfiles de mRNA utilizando cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de microarrays . Para mantener la integridad de ARNm en secciones congeladas de tejido cerebral para el análisis genómico, se modificaron los protocolos existentes para la fijación, la tinción y la captación rápida de las neuronas de congelados secciones de cerebro de rata. Para la identificación y el aislamiento de las neuronas del hipocampo lesionado y muriendo, que también se optimiza la técnica de tinción fluoro-Jade para LCM. Fluoro-Jade no distingue entre la muerte celular por apoptosis y necrosis. Por lo tanto, todos los tipos de neuronas en degeneración puede ser detectada por esta mancha. 6,7 A continuación, se describe el protocolo utilizado en nuestro laboratorio para obtener grupos de neuronas individuales que mueren o sobreviven, así como franjas de enriquecimiento poblaciócomplementos de los distintos tipos de células neuronales (es decir, CA1-CA3 neuronas para análisis de expresión génica después de TBI). El procedimiento para la lesión cerebral de percusión de fluido realizado en nuestro laboratorio se describe en detalle en Shimamura et al., 8 y es muy similar al protocolo de lesión lateral de percusión de fluido para ratones publicados en JoVE por Alder et al. 9 Dado que la técnica LCM tiene Se ha demostrado que tienen un efecto mínimo o nulo sobre la integridad del ADN, ARN y proteínas en los tejidos, esta es una excelente herramienta para el análisis molecular y la proteína de tipos celulares definidos.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de captura láser PixCell IIe</td><td>Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizador Agilent 2100</td><td>Microkit</td> ARNacuoso de Agilent <td></td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure Tapas LCM</td><td>Biosystems Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Acetato violeta Cresyl</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (grado histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (grado histológico)</td><td>Puntas</td> de pipeta de barrera sin RNasa de farmacia <td></td><td></td>UTMB</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Sistema de Microdisección de Captura Láser Arcturus (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Microdisección Láser Zeiss La familia PALM </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Discapacidad a largo plazo después de una LCT cognitivo está asociado con una lesión inducida por la neurodegeneración en el hipocampo, una región del lóbulo temporal medial que es fundamental para el aprendizaje, la memoria y la función ejecutiva. 1,2 De ahí que nuestros estudios se centran en el análisis de la expresión génica específica neuronal las poblaciones en diferentes subregiones del hipocampo. La técnica de microdisección por captura láser (LCM), introducida en 1996 por Emmert-Buck, et al., 3 ha permitido avances significativos en el análisis de expresión génica de células individuales y poblaciones enriquecidas de células de tejidos heterogéneos tales como el cerebro de los mamíferos que contiene miles de tipos de células funcionales. 4 Usamos LCM y un modelo de rata bien establecido de la lesión cerebral traumática (TBI) para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la patogénesis de la lesión cerebral traumática. Después de TBI de percusión de fluido, los cerebros se retiran en tiempos predeterminados después de la lesión, se congelaron inmediatamente en hielo seco,y preparado para seccionar en un criostato. Los cerebros de ratas puede ser embebido en OCT y se seccionaron inmediatamente, o almacenarse durante varios meses a -80 ° C antes de seccionamiento de microdisección de captura por láser. Adicionalmente, usamos LCM para estudiar los efectos de la lesión cerebral traumática en los ritmos circadianos. Para ello, capturar las neuronas de los núcleos supraquiasmáticos que contienen el reloj maestro de la cerebro de los mamíferos. Aquí, se demuestra el uso de LCM para obtener neuronas individuales identificadas (lesionado y degenerativo, fluoro-Jade-positivo, o no lesionado, fluoro-Jade negativo-) y poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo para su posterior análisis de expresión génica mediante PCR en tiempo real y / o microarrays de todo el genoma. Estos estudios LCM habilitados han revelado que la vulnerabilidad selectiva de las regiones anatómicamente diferentes del hipocampo de rata se reflejan en los diferentes perfiles de expresión génica de diferentes poblaciones de neuronas obtenidas por LCM de estas regiones distintas. Los resultados de nuestros estudios de una sola célula, en suse comparan los perfiles de transcripción de morir y adyacente sobrevivir las neuronas del hipocampo, sugieren la existencia de un reostato de la supervivencia celular que regula la muerte celular y la supervivencia después de TBI.

En nuestro estudio LCM primero, hemos sido capaces de demostrar que las subregiones funcionalmente distintos (CA1 y CA3) de hipocampo de la rata tienen perfiles de expresión génica que reflejan su vulnerabilidad a la lesión cerebral traumática. 8 Figura 1A-1C muestra la captura de láser de neuronas piramidales del hipocampo (CA1- CA3), las neuronas del gyrus dentado y las neuronas del SCN antes de, y después de LCM. Limpie las capturas de piramidal, gránulos o neuronas SCN, respectivamente, se muestran en las tapas de macro. Figura 2A-2B ilustra morir, Jade fluoro-positivas las neuronas piramidales y sobrevivir, Jade fluoro-neuronas piramidales negativas antes y después de la LCM. La captura limpia de los moribundos o neuronas supervivientes se muestra mediante la visualización de las células capturadas en las tapas de LCM. Después de LCM, el ARN total se puede utilizar para una gran variedad de estudios moleculares, incluyendo cuantitativa en tiempo real el análisis de PCR de la expresión génica utilizando TaqMan o SYBR química verde (figura 3A), pequeña focused arrays con sondas de PCR SYBR Green (Figura 3B) o todo el genoma estudios de microarrays (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Microdisección mediante captura con láser de franjas de poblaciones de células definidas del cerebro de rata. Congeladas 10 micras secciones coronales de cerebro de rata se fijaron en etanol, se tiñeron con una tinción de Nissl (cresil violeta) y preparado para LCM. Se muestran imágenes del hipocampo de la rata y en el núcleo supraquiasmático, antes y después de LCM y las células capturadas como visualizado en las tapas de macro. A. neuronas piramidales de los subcampos CA1-CA3 de hipocampo de la rata. Gránulo células B. En el giro dentado del hipocampo. C. Bilateral núcleo supraquiasmático situada a cada lado del tercer ventrículoy situado por encima del quiasma óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Microdisección láser captura de neuronas individuales de hipocampo de rata. A. Se muestran degeneración, fluoro-Jade-positivas (teñidas) neuronas CA3 del hipocampo y sobrevivir B., fluoro-Jade-negativo (sin teñir) CA3 neuronas antes y después de la LCM. Las células capturadas se visualizan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. La expresión de genes de ARN total aislado de las neuronas láser capturados. A. cuantitativos de PCR en tiempo real los datos de expresión de genes del reloj circadiano en SCN. B. Mapa de calor de la expresión génica en morir y sobrevivir a las neuronas del hipocampo que muestran la expresión de genes relacionados con la apoptosis utilizando arrays de PCR se centraron . C. Agilent todo el genoma análisis de microarray de la expresión génica en hipocampo CA1-CA3 las neuronas de las ratas que recibieron lesión simulada, TBI o TBI además de un recombinante de virus adeno-asociado siRNA desmontables diseñados para expresión de genes inducida por lesión cerebral (óxido nítrico neuronal sintetasa y glutatión peroxidasa-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo obtener poblaciones enriquecidas de neuronas del hipocampo y neuronas individuales a partir de secciones de tejido congelado mediante microdisección por captura láser para su posterior análisis de expresión génica. Esto se logra mediante la anestesia inicial, una rata en una cámara anestésica. A continuación, se intuba a la rata, se ventila mecánicamente y se coloca en un soporte de cabeza estereotáxico para preparar a la rata Para la lesión cerebral por percusión fluida, se realiza una craneotomía.El segundo paso es administrar la lesión cerebral por percusión fluida. A continuación, las secciones coronales del cerebro se cortan en un criostato y se tiñen con fluorescente, un marcador de neuronas en degeneración, o violeta real, una tinción de misil. El paso final es realizar una microdisección de captura láser y recolectar neuronas individuales o grupos de neuronas.En última instancia, el ARN total se aísla de las células capturadas, se analiza la calidad y se cuantifica mediante un bioanalizador Agilent y se utiliza en aplicaciones posteriores como la PCR cuantitativa en tiempo real y el análisis de microarrays centrados en vías o de todo el genoma. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes como la micro disección manual, es que podemos obtener poblaciones enriquecidas de neuronas u otros tipos de células cerebrales como células gliales o inmunomoduladoras, o neuronas individuales a partir de secciones de tejido. Esto nos permite realizar análisis de expresión génica en distintos tipos de células identificadas en el cerebro y en otros tejidos heterogéneos compuestos por múltiples tipos de células, lo que no permitirá demostrar este procedimiento.Debbie Boone, investigadora asociada sénior en nuestro laboratorio. Primero recupere el tejido cerebral obtenido de ratas con percusión de fluidos, lesión cerebral traumática o lesión simulada del congelador a menos 80 grados Celsius, y transfiéralo a menos 22 grados Celsius. Criostato durante 10 minutos para llevar el cerebro a la temperatura de sección mientras el cerebro se descongela.Limpie el criostato con una descarga de ARN que contenga etanol y limpie los cepillos con etanol. Después de los 10 minutos transcurridos, retire el cerebro del tubo y colóquelo con el lado ventral hacia arriba sobre un trozo de gasa en la etapa de criostato, use una hoja de afeitar nueva y corte el cerebro para extraer la porción posterior del cerebro. Justo rostral al cerebelo y la porción anterior al quiasma óptico.Llene un molde criogénico con medio de montaje OCT y coloque el cerebro en el molde con la parte anterior hacia abajo. Deje que el tejido cerebral se congele en el medio de montaje hasta que se vuelva blanco. Esto debería tomar aproximadamente 10 minutos.Ahora congele el disco de muestra en el cerebro con OCT. A continuación, retira el molde. Inserte el disco con el cerebro conectado en la cabeza de la muestra y apriete los tornillos.Inserte una hoja desechable de perfil bajo en el portacuchillos y apriete la palanca hacia abajo. Comience a cortar el cerebro a 20 micras para eliminar la capa exterior de OCT. Una vez que se alcance la región del hipocampo, ajuste el dial de micras a 10.Recoja las secciones seriales coronales colocando un portaobjetos de vidrio o un vaso adicional. Deslízalo sobre la sección de pañuelos. Coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción libre de ARN a menos 20 grados centígrados hasta que se complete el corte.Antes de proceder a teñir las secciones, limpie todos los recipientes de tinción y los cilindros graduados con ese y enjuague con agua mili Q. Asegúrese de que todas las soluciones se hayan preparado con agua libre de ARN y que la tinción de violeta crestal y jade fluorado haya pasado antes por un filtro de 0,2 micras. Use secciones de cerebro de Thor a temperatura ambiente durante 30 segundos y fíjelas en etanol al 75% durante un minuto.A continuación, proceda a la contratinción adecuada para LCM de franjas de neuronas o neuronas individuales para LCM de franjas de neuronas después de la fijación, enjuague los portaobjetos en ARN con agua libre durante un minuto y tinte con 1% de violeta cresta durante un minuto. Enjuague con agua libre de ARN tres veces durante un minuto cada una, deshidrate con etanol al 95% dos veces durante 30 segundos cada una. A continuación, etanol al 100% dos veces durante 30 segundos y xileno dos veces durante tres minutos cada uno.Después de teñir, seque al aire todas las secciones en una campana extractora durante 15 minutos y luego proceda a LCM.Here. Se realiza LCM. Usando un microscopio de células P dos E con un láser de diodo infrarrojo, primero ajuste el joystick central a la posición vertical.A continuación, gire y bloquee el objetivo de Forex en su posición. Coloque un portaobjetos con secciones del hipocampo teñidas en el centro de la platina del microscopio y ajústelo manualmente hasta que la región del hipocampo esté a la vista. Utilice el curso y encuentre ajustes de enfoque.Para enfocar la sección, active el mandril de vacío presionando el botón de vacío en el controlador. A continuación, gire y bloquee el objetivo 10 x en su lugar. Vuelve a concentrarte con el rumbo y los ajustes finos.Cargue las tapas de sus tapas LCM macro en las tapas, su módulo de casete y coloque una tapa en la posición de la línea de carga. Gire el brazo de colocación de la tapa y colóquelo alrededor de la tapa. A continuación, levante el brazo de colocación de la tapa para quitar las tapas de la tapa del módulo de casete.Gire el brazo de colocación de la tapa sobre la corredera y luego bájelo sobre la corredera para colocar la tapa en la corredera. Ajuste el enfoque fino y mueva el joystick para verificar si las celdas están dentro del círculo negro en la tapa. Todas las celdas a capturar deben estar dentro de este círculo negro.Ahora configure los parámetros del láser. Primero presione el botón de habilitación láser en el controlador. El punto objetivo del láser será visible de color rosa.en el campo de visión en el monitor de la computadora. Establezca el tamaño del punto láser en pequeño para enfocar el láser y ajuste la potencia y la duración a 65 a 75 milivatios durante uno o dos milisegundos, según sea necesario para una captura celular óptima. Para probar el láser, use el joystick para mover el punto láser a un área donde no haya celdas para recoger.Dispare el láser con el interruptor de pulgar. Luego, use el joystick para alejar el punto láser del punto de polímero derretido y verifique si hay un anillo oscuro visible alrededor de un área clara donde se disparó el láser. Para capturar células, use el joystick para mover el punto láser sobre el área de células para capturar y disparar el láser.Con el interruptor de pulgar, mueva el joystick mientras dispara el láser para capturar un área grande de celdas. Después de disparar todas las celdas de interés, levante el brazo de colocación de la tapa. Las células capturadas se separarán de la sección de tejido y se adherirán a la tapa.Su gorra, el tejido restante y las células faltantes serán visibles en el campo de visión. Las celdas de la tapa también se pueden ver colocando la tapa en una parte vacía de la diapositiva. Levante el brazo de colocación de tapas y gírelo hasta la estación de descarga de tapas.Baje la tapa en la estación y gire el brazo de colocación de la tapa a su posición anterior. Deslice la tapa de su herramienta de inserción a lo largo de la plataforma y sobre la tapa. Levante la herramienta con la tapa colocada desde la plataforma.Toque ligeramente la tapa con la parte adhesiva de una nota adhesiva para limpiar el tejido no deseado. Coloque la tapa en un tubo libre de ARN de 0,5 mililitros lleno de 100 microlitros de tampón de lisis obtenido del kit de microaislamiento acuoso RN. Inmediatamente vórtice la tapa durante 30 segundos para mentir.Las células incuban las muestras a 42 grados centígrados durante 30 minutos y se congelan a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. El procedimiento de tinción para la LCM de neuronas individuales lesionadas después de la fijación es similar al procedimiento para franjas de neuronas. Sin embargo, algunos tiempos de incubación difieren y las secciones se mantienen con fluoruro durante cuatro minutos antes del enjuague y la deshidratación, consulte la parte del texto del protocolo para obtener detalles después de la tinción.Nuevamente, seque al aire todas las secciones en una campana extractora durante 15 minutos. Antes de proceder a LCM para capturar la carga de celdas individuales, capture las tapas HS LCM en la tapa o el módulo de casete utilizando el mismo procedimiento que para la tapa macro LCM. Nuevamente, establezca el tamaño del punto láser en pequeño para enfocar el láser, pero esta vez ajuste la potencia y la duración del láser a 65 a 75 milivatios durante 0,45 a 0,5 milisegundos para una captura celular óptima de celdas individuales.Gire el brazo de colocación de la tapa sobre la corredera y baje el brazo hacia la corredera. Para colocar la tapa sobre el portaobjetos, la superficie de la tapa HS de captura se coloca elevada de la muestra. Durante el LCM, use el joystick para mover el láser sobre celdas positivas de ayuda de flúor individuales.Todas las células que se capturan deben estar dentro del pequeño anillo negro en la tapa, dispare el láser usando el interruptor de pulgar. Cuando todas las células dentro del área del círculo negro se han disparado con el levantamiento láser, el brazo de colocación de la tapa, las células capturadas se separarán de la sección de tejido y se adherirán a la tapa hs de captura. Ahora coloque otro portaobjetos en la platina del microscopio y recoja las células positivas de fluorescencia hasta que el tapón HS esté lleno.A continuación, coloque la tapa en un tubo libre de ARN de 0,5 mililitros lleno de 40 a 50 microlitros de lisis, tampón y vórtice e incubadoras antes de volver a congelar a menos 80 grados centígrados. Si no es así, realice inmediatamente el aislamiento de ARN de acuerdo con las instrucciones de la parte de texto del protocolo. Las siguientes imágenes muestran la microdisección de captura láser de franjas de poblaciones celulares específicas del cerebro de rata congeladas en secciones coronales de 10 micras del cerebro de rata.Se prepararon de acuerdo con este protocolo y se tiñeron con violeta crestal y tinción de misil. Esta imagen muestra neuronas parametálicas de los subcampos ca uno a ca tres del hipocampo de la rata. Aquí, se han capturado células granulosas en el giro dentado del hipocampo.Por último, mostramos franjas de neuronas capturadas de los núcleos bilaterales de supra quiasma situados a ambos lados del tercer ventrículo y por encima del quiasma óptico. El SCN contiene el reloj circadiano maestro que controla los ritmos circadianos en todo el cuerpo. Las siguientes imágenes muestran la microdisección por captura láser de neuronas individuales del hipocampo de rata.Aquí se muestran tres neuronas en el hipocampo positivo con fluoruro en degeneración, tres neuronas que sobreviven a la ayuda fluro negativa, tres neuronas antes y después de LCM, se muestran las células capturadas y se visualizan en la tapa de LCM. Las siguientes imágenes mostraron el análisis de la expresión génica del ARN total, aislado de neuronas capturadas con láser. Esta imagen muestra datos cuantitativos de PCR en tiempo real de la expresión génica del reloj circadiano en el SCN.Este mapa de calor de la expresión génica en neuronas del hipocampo moribundas y supervivientes muestra el perfil de expresión de genes relacionados con la apoptosis mediante matrices de PCR enfocadas. Finalmente, mostramos un ejemplo de un mapa de calor generado a partir de un análisis de microarrays ENT de genoma completo de la expresión génica en una a tres neuronas de ratas que recibieron una lesión simulada TBI o TBI más un virus siRNA adenoasociado reclinado diseñado para reducir la expresión de óxido nítrico neuronal, sintasia o glutatión peroxidasa, uno. ambos son genes inducidos por una lesión cerebral después de su desarrollo. Estas técnicas allanaron el camino para los científicos en muchos campos de investigación, incluidas las lesiones cerebrales y el cáncer, que utilizan modelos animales de estos trastornos para realizar perfiles genómicos, proteómicos y metabólicos de poblaciones celulares específicas.Por ejemplo, actualmente estamos utilizando estas técnicas para capturar con láser poblaciones celulares específicas de la corteza prefrontal y las áreas cerebrales del núcleo accumbens que se sabe que están involucradas en la adicción.

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Investigación

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Neurociencia

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