Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es crear gradientes adhesivos y solubles para estudiar la migración celular. Esto se logra primero pasivando una superficie para prevenir la adhesión celular no específica. El segundo paso consiste en fabricar sellos mediante impresión por contacto microscópico.

A continuación, la superficie tratada se diseña con líneas de estreptavidina mediante impresión por microcontacto. La estreptavidina también puede imprimirse en forma de puntos utilizando litografía con pluma de inmersión unida a la parte inferior de un dispositivo microfluídico. La superficie modificada actuará como base para un gradiente adhesivo de biotina RGD.

El paso final consiste en cargar las células sobre la superficie con la señal adhesiva en presencia de un gradiente soluble de quimioatractivo. Finalmente, se utiliza microscopía de células vivas para mostrar la migración celular en respuesta a señales adhesivas y solubles. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el ensayo de transwell o de cámara vacía y una configuración microfluídica convencional, es que el sistema desintegrado de patrones superficiales del dispositivo microfluídico permite observar simultáneamente las respuestas celulares a señales adhesivas espacialmente controladas, a un gradiente adhesivo y a un gradiente soluble.

Bueno, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la migración celular, como la importancia de la adhesión celular y la causa del desplazamiento entre receptores quimiotácticos, tales como receptores con actividad de quinasa, receptores acoplados a proteínas G y receptores de adhesión como RIN. Para empezar, limpie los cubreobjetos sumergiéndolos en una gradilla dentro de etanol al 100 % y colocando la gradilla en un baño ultrasónico de agua durante 30 minutos. Seque los cubreobjetos de vidrio al aire.

A continuación, someta los cubreobjetos de vidrio a sonicación durante 30 minutos en hidróxido de sodio uno molar. Posteriormente, enjuague las superficies de vidrio inclinando cuidadosamente el portacubos en un vaso de precipitados lleno con un litro y medio de agua milicúbica. Repita el proceso de enjuague tres veces, utilizando agua milicúbica fresca cada vez.

Después del tercer enjuague, seque las laminillas de vidrio en una estufa a 60 grados Celsius durante aproximadamente media hora. Coloque la mitad de las laminillas de vidrio limpias individualmente en una cámara húmeda hecha de una placa de 24 pocillos, parcialmente llenada con agua. Los pocillos se llenan con agua y las laminillas de vidrio se colocan encima de los pocillos para la acción; se utiliza un copolímero de polilisina y polietilenglicol en el que el 20 % de las moléculas de PEG están injertadas con biotina.

Abreviado como PLL Peg biotina, coloque 15 microlitros de PLL Peg biotina en PBS sobre cada cubreobjeto de vidrio. Tome la otra mitad de los cubreobjetos de vidrio limpios restantes y forme cuidadosamente un sándwich con la solución de PEG. Deje los cubreobjetos durante una hora en la cámara húmeda.

Después de una hora, se separan suavemente las cubreobjetos una de otra sin raspar la superficie recubierta con PEG y se lavan con agua UE. El agua debe deslizarse fácilmente sobre el lado tratado con PEG. Si es necesario.

Deje secar al aire las laminillas de vidrio sobre una toalla de papel con la superficie tratada hacia arriba. Almacene las laminillas de vidrio en un desecador al vacío hasta su uso posterior. El molde de silicio necesario para este procedimiento se fabrica mediante fotolitografía para vaciar el sello de A-P-D-M-S sobre el elastómero de PDMS en el molde de silicio dentro de una placa de Petri hasta una altura de aproximadamente un centímetro, y luego cure la mezcla del molde y el PDMS en un horno a 70 grados Celsius durante una hora.

Posteriormente, el sello de PDMS se retira del molde de silicio y se corta al tamaño adecuado para imprimir patrones de proteínas utilizando la técnica de impresión por contacto microscópico. Primero, limpie y haga los sellos de PDMS más hidrofílicos tratando el lado con el patrón en un limpiador de UV y ozono durante una hora y media. Inmediatamente después del tratamiento con ozono, coloque y extienda 10 microlitros de avidina despojada sobre los sellos de PDMS. Si las pistas deben ser visibles bajo el microscopio fluorescente, utilice avidina despojada conjugada a un fluoróforo, como avidina marcada con Alexa Fluor 350.

Deje durante una hora en una cámara húmeda. Retire el exceso de strep din del sello con un tejido, papel y aire. Seque el sello durante aproximadamente un minuto.

Presione ligeramente el sello sobre la laminilla de vidrio recubierta con biotina en el pínulo de PLL. Si se utilizó estreptavidina fluorescente, examine el patrón bajo un microscopio de fluorescencia epiescopia. Los patrones de proteínas también pueden imprimirse utilizando litografía con pluma de inmersión.

Primero mezcle una parte de un miligramo por mililitro de streptavidin o avidina desprovista de etiqueta Fluor tres 50 con 10 partes de glicerol y cargue cinco microlitros de la mezcla sobre el cantiléver. Ajuste la velocidad de impresión. Tiempo de contacto del cantiléver sobre la superficie o una distancia vertical del cantiléver respecto a la superficie para reducir el tamaño del punto.

Cerca de cinco micrómetros inician el proceso de impresión según se describe en el manual de operación del almacén del instrumento de litografía con pluma de inmersión. Todas las superficies impresas se colocan en un desecador. Se utiliza un dispositivo microfluídico disponible comercialmente para crear gradientes superficiales.

Adhiera estas cubreobjetos de vidrio recubiertas o impresas con tritina al lado adhesivo del dispositivo para asegurar que no haya fugas durante varias horas. Selle los bordes del dispositivo con una capa delgada de vaselina calentada y con una segunda capa de una mezcla de una parte de vaselina por una parte de cera de parafina. Llene el canal del dispositivo con seis microlitros de PBS para crear dos gradientes opuestos.

Llene los dos depósitos, uno con 70 microlitros de biotina, cuatro fluoresceína y el otro con 70 microlitros de biotina conjugada con péptido biotinilado arginina glicina ácido aspártico o RGD, e incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. El enjuague de biotina, RGD y biotina fitsy del dispositivo microfluídico es el aspecto más difícil de este procedimiento, ya que existe el riesgo de atrapar burbujas de aire y perturbar las pistas impresas por contacto microscópico. Para asegurar el éxito, la biotina y el PBS deben eliminarse cuidadosa y lentamente.

Retire las soluciones de biotina y enjuague cuidadosamente la superficie dos veces con PBS mientras permanezca unida al dispositivo microfluídico. Marque la dirección del gradiente adhesivo antes de cargar células marcadas con fluorescencia en el dispositivo microfluídico. Cuente las células y divídalas en dos tubos con igual número de células.

Lave y resuspenda. Suspenda un tubo de células con medio que contenga el quimioatractivo, como DMEM de baja glucosa con 10 %FBS, y lave el otro tubo de células con medio sin el quimioatractivo, como DMEM con 0 %FBS. La concentración final de células en cada tubo debe ser cinco veces 10 a la quinta células por mililitro.

Retire todas las soluciones del dispositivo microfluídico y colóquelo sobre el microscopio precalentado. Introduzca en un reservorio 70 microlitros de células resuspendidas en DMEM con 0 % de suero bovino fetal. Introduzca 70 microlitros de células resuspendidas en DMEM con 10 % de suero bovino fetal en otro reservorio.

Cubra ligeramente con cinta los depósitos para evitar la evaporación. Asegúrese de que el canal del dispositivo microfluídico esté en el campo de visión y de que las células estén enfocadas. Seleccione los parámetros de adquisición de imágenes, como los tiempos de exposición y los filtros fluorescentes.

Secuencia de imágenes de campo brillante y fluorescencia que muestra células y trayectorias, así como puntos temporales y duración de la grabación al iniciar el programa de adquisición de imágenes. Este video demuestra un método para la obtención de imágenes de células vivas que migran en un entorno con gradientes adhesivos y solubles competitivos. Las trayectorias adhesivas que contienen estreptavidina fluorescente y RGD biotinilado se crearon mediante impresión por microcontacto o litografía con pluma de inmersión.

Un microcontacto de impresión exitoso se indica mediante el perfil de línea de la intensidad de fluorescencia a través de las pistas, donde las pistas adhesivas y las regiones antifouling pueden distinguirse claramente. Los puntos impresos con litografía de pluma de inmersión aparecen redondeados, no en forma de lágrima, lo que indica un proceso de impresión exitoso. En este ejemplo, los puntos se imprimieron en una línea con separación de filas y columnas ajustada entre 10 y 15 micrómetros.

Esta distancia es suficiente para evitar que los puntos se fusionen entre sí, pero permite observar múltiples puntos en un solo campo de visión. Con la mayoría de los ajustes del microscopio, se creó un gradiente de señales adhesivas en la pista impresa mediante un dispositivo de microfluídica sencillo. Al cargar biotina con cuatro fluoresceína y biotina RGD en los lados opuestos de un panel de cámara de microfluídica.

Un muestra 60 imágenes en mosaico tomadas con una longitud total de imagen de 3072 micrómetros. En el panel B, se midió la intensidad de fluorescencia a lo largo de toda la extensión del mosaico. Se ajustaron líneas de tendencia lineales a la intensidad de fluorescencia para indicar el gradiente de RGD en el canal.

Después de eliminar la biotina, la solución de biotina RGD, se puede utilizar la misma cámara para introducir un gradiente soluble. El panel A muestra la intensidad fluorescente del colorante fluoresceína cerca de los depósitos llenos de PBS y fluoresceína y a lo largo del canal en T igual a cero. El panel B muestra la intensidad fluorescente de las señales solubles.

Después de una incubación de 16 horas, los resultados comparables indican que el gradiente fue estable durante al menos 16 horas. Él, una migración celular en una cámara microfluídica con gradientes opuestos se observó mediante este método y aquí se muestra una película representativa. El gradiente adhesivo fue RGD inmovilizado sobre pistas de estreptavidina y el gradiente soluble fue de cero a 10 %FBS.

Las imágenes se tomaron cada 15 minutos durante un total de 20 horas. La transición de imágenes mostrada es de ocho cuadros por segundo. Esta segunda película muestra una sola célula heli que migra hacia la fuente de suero bovino fetal (FBS).

La transición de la imagen mostrada es de ocho cuadros por segundo. La línea azul que representa la trayectoria celular se obtuvo mediante un software de seguimiento celular. Este último gráfico muestra las trayectorias celulares a partir de las imágenes de la primera película.

Las trayectorias celulares que migraron hacia la mayor concentración de FPS soluble se muestran en rojo; las trayectorias celulares que migraron hacia mayores concentraciones de RGD adherente se muestran en negro. Estas trayectorias mostraron que más células HeLa migraron hacia la fuente del quimioatractivo que hacia mayores concentraciones de RGD adherente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar la evaporación de PBS o medio en el dispositivo microfluídico durante la preparación del gradiente adhesivo y la adquisición de imágenes en condiciones de cultivo; utilice cinta adhesiva si es necesario para cubrir todas las entradas del dispositivo microfluídico tras completar este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la transfección y la microscopía en solución híbrida para responder preguntas adicionales, como la biomecánica del citoesqueleto mediada por proteínas, las proteínas de adhesión focal y los receptores durante la migración celular.