Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es crear gradientes adhesivos y solubles para estudiar la migración celular. Esto se logra mediante un primer pasivado, una superficie para evitar la adhesión inespecífica de las células. El segundo paso es fabricar sellos a partir de la impresión por microcontacto.

A continuación, la superficie se modela con líneas ávidas de estreptococos mediante impresión por microcontacto. El din atado también se puede imprimir como puntos utilizando litografía con bolígrafo de inmersión adjunta a la parte inferior de un dispositivo microfluídico. La superficie modificada actuará como base para un gradiente adhesivo de biotina RGD.

El paso final es cargar las células en la superficie con la señal adhesiva en presencia de un gradiente de quimioatrayente soluble. En última instancia, la microscopía de células vivas se utiliza para mostrar la migración celular en respuesta a señales adhesivas y solubles. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de cámara vacía o transpozo y una configuración microfluídica convencional, es que el sistema desintegrado del dispositivo microfluídico de patrón de superficie permite la observación de las respuestas de las células a las señales adhesivas y al gradiente adhesivo controlados espacialmente y a un gradiente soluble al mismo tiempo.

Bueno, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la migración celular, como la importancia de la adhesión celular y causar un accidente cerebrovascular entre los receptores de quimioterapia Texas, como los receptores acoplados a la proteína G de quinasa vista y los receptores de adhesión como los resbalones de cubierta de vidrio RIN To Eat. En primer lugar, limpie los cubreobjetos sumergiéndolos en una rejilla en etanol 100% y colocando la rejilla en un baño de agua de patinaje durante 30 minutos. Seque la cubierta de vidrio que se desliza en el aire.

A continuación, sonique la cubierta de vidrio se desliza durante 30 minutos en un molar de hidróxido de sodio. A continuación, enjuague las superficies de vidrio inclinando con cuidado la rejilla en un vaso de precipitados lleno de un litro y medio de agua en milicubos. Repita el proceso de enjuague tres veces con agua fresca en cubitos de milicubo cada vez.

Después del tercer enjuague, la cubierta de vidrio se desliza en un horno a 60 grados centígrados durante aproximadamente media hora. Coloque la mitad de los cubreobjetos de vidrio limpios individualmente en una cámara húmeda que esté hecha de una placa de 24 pocillos, parcialmente llena de agua. Los pozos se llenan con agua y los cubreobjetos de vidrio se colocan encima de los pocillos para la ación, se utiliza un copolímero de polilisina y polietilenglicol en el que el 20% de las moléculas de clavija se injertan en biotina.

Abreviado como biotina PLL Peg, gota 15 microlitros de biotina PLL Peg en PBS en cada cubreobjetos de vidrio. Tome la otra mitad de los cubreobjetos de vidrio limpios restantes y coloque con cuidado la solución de PEG. Deje los cubreobjetos durante una hora en la cámara húmeda.

Después de una hora de deslizamiento, la cubierta intercalada se desliza suavemente entre sí sin raspar la superficie recubierta de PEG y enjuáguelas con agua UE. El agua debe deslizarse fácilmente por el lado tratado con la clavija. Si es necesario.

Seque al aire la cubierta de vidrio sobre una toalla de papel con la superficie tratada hacia arriba, almacene. La cubierta de vidrio se desliza en una desecación al vacío hasta su uso posterior. El maestro de silicio requerido para este procedimiento se fabrica mediante fotolitografía para fundir el sello A-P-D-M-S para el elastómero PDMS en el maestro de silicio dentro de una placa de Petri a aproximadamente un centímetro de altura y curar la mezcla de maestro y PDMS en un horno a 70 grados centígrados durante una hora.

Posteriormente, el sello PDMS se retira del maestro de silicio y se corta a medida para imprimir patrones de proteínas utilizando la técnica de impresión por microcontacto primero limpio y para hacer que los sellos PDMS sean más hidrófilos tratando el lado del patrón en un limpiador UV y ozono durante una hora y media inmediatamente después del lugar de tratamiento con ozono. Y esparce 10 microlitros de adin despojado sobre los sellos PDMS. Si las huellas deben ser visibles bajo el microscopio fluorescente, use Aden rayado que esté conjugado con un fluoro cuatro, como ávido rayado y LOR tres 50.

Dejar actuar durante una hora en una cámara húmeda. Elimine el exceso de estreptococos del sello con un pañuelo de papel, papel y aire. Seca el sello durante aproximadamente un minuto.

Presione ligeramente el sello en el cubreobjetos de vidrio recubierto de biotina PLL peg. Si se utilizó estreptococo fluorescente, examine el patrón con un microscopio de epifluorescencia. Los patrones de proteínas también se pueden imprimir mediante litografía con bolígrafo de inmersión.

Primero mezcle una parte de un miligramo por mililitro, pelar o pelar avidan elif Fluor three 50 con 10 partes de glicerol y cargue cinco microlitros de la mezcla en el voladizo. Ajusta la velocidad de impresión. Tiempo de contacto del voladizo en la superficie o una distancia vertical del voladizo a la superficie para reducir el tamaño del punto.

Aproximadamente cinco micrómetros comienzan el proceso de impresión como se describe en el manual de operación de la tienda de instrumentos de litografía con bolígrafo de inmersión. Todas las superficies impresas en un desecado. Se utiliza un dispositivo microfluídico disponible en el mercado para crear gradientes superficiales.

Adherir esta cubierta de vidrio recubierta de tritina o estampada se desliza sobre el lado adhesivo del dispositivo para garantizar que no haya fugas durante varias horas. Selle los bordes del dispositivo con la capa delgada de vaselina calentada y con una segunda capa de una mezcla de una parte de vaselina por una parte de cera de parafina. Llene el canal del dispositivo con seis microlitros de PBS para crear dos gradientes opuestos.

Llene los dos depósitos, uno con 70 microlitros de biotina, cuatro fluoresceína y el otro con 70 microlitros de biotina conjugada con péptido biotinilado, arginina, glicina, ácido espártico o RGD, incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. El enjuague de la biotina, el RGD y la biotina del dispositivo microfluídico es el aspecto más difícil de este procedimiento porque existe el riesgo de atrapar burbujas de aire y perturbar las pistas impresas de microcontacto. Para garantizar el éxito, la biotina y el PBS deben eliminarse con cuidado y lentamente.

Retire las soluciones de biotina y enjuague cuidadosamente la superficie dos veces con PBS mientras aún está conectada al dispositivo microfluídico. Marque la dirección del gradiente adhesivo antes de cargar las células marcadas con fluorescencia en el dispositivo de microfluídica. Cuenta las celdas y divídelas en dos tubos con números de celdas iguales.

Lavar y resus. Suspenda un tubo de células con medios que contengan el atrayente de quimioterapia, como DMEM de glucosa baja con lavado al 10% de FBS y el otro tubo de células en el medio. Sin el atrayente de quimioterapia como DMEM con 0% de FBS, la concentración final de células en cada tubo debe ser cinco veces 10 de la quinta célula por mililitro.

Retire todas las soluciones del dispositivo microfluídico y colóquelo en el microscopio precalentado. Carga por etapas: 70 microlitros de celdas resuspendidas en 0%F-B-S-D-M-E-M en un depósito. Cargue 70 microlitros de celdas resuspendidas en 10%F-B-S-D-M-E-M en otro depósito.

Cinta adhesiva suelta sobre los depósitos para evitar la evaporación. Asegúrese de que el canal del dispositivo microfluídico esté en el campo de visión y que las células estén enfocadas. Seleccione los parámetros de adquisición de imágenes, como los tiempos de exposición y los filtros fluorescentes.

La secuencia de imágenes de campo claro y fluorescencia que las células y las pistas, así como los puntos de tiempo y la duración de la grabación inician el programa de adquisición de imágenes. Este video muestra un método para obtener imágenes de células vivas de células que migran en un entorno con gradientes adhesivos y solubles que compiten entre sí. Las pistas adhesivas que contienen tiras fluorescentes y RGD biotiniladas se crearon con impresión por microcontacto o litografía con bolígrafo de inmersión.

El éxito de la impresión por microcontacto se indica mediante el perfil de línea de la intensidad de fluorescencia a través de las pistas, donde se pueden distinguir claramente las pistas adhesivas y las regiones antiincrustantes. Los puntos impresos con litografía con bolígrafo de inmersión aparecen redondeados, no en forma de lágrima, lo que indica un proceso de impresión exitoso. En este ejemplo, los puntos se imprimieron en una línea con una separación de filas y columnas establecida en 10 a 15 micrómetros.

Esta distancia es suficiente para evitar que los puntos se fusionen entre sí, pero permite la visualización de varios puntos en un solo campo de visión. Con la mayoría de los ajustes de microscopio, se creó un Grady de señales adhesivas en la pista impresa con el simple dispositivo de microfluídica. Mediante la carga de biotina, cuatro fluoresceína y biotina RGD en los lados opuestos de un panel de cámara microfluídica.

A muestra 60 imágenes de mosaico tomadas con una longitud total de imagen de 3072 micrómetros. En el panel B, la intensidad de fluorescencia se midió a lo largo de todo el mosaico. Se ajustaron líneas de tendencia lineales a la intensidad de fluorescencia para indicar el gradiente RGD en el canal.

Después de eliminar la biotina, la solución de biotina RGD, se puede utilizar la misma cámara para introducir un gradiente soluble. El panel A muestra la intensidad fluorescente del colorante de fluoresceína cerca de los depósitos llenos de PBS y fluoresceína y a través del canal en T igual a cero. El panel B muestra la intensidad fluorescente de las señales solubles.

Después de una incubación de 16 horas, los resultados comparables indican que el gradiente se mantuvo estable durante al menos 16 horas. Él, se observó una migración celular en una cámara microfluídica con gradientes opuestos utilizando este método y aquí se muestra una película representativa. El gradiente adhesivo fue RGD inmovilizado en pistas de estreptococo avidan y el gradiente soluble fue de cero a 10% FBS.

Las imágenes se tomaron cada 15 minutos durante un total de 20 horas. La transición de la imagen que se muestra es de ocho fotogramas por segundo. Esta segunda película es de una sola célula helicoidal migrando hacia la fuente FBS.

La transición de la imagen que se muestra es de ocho fotogramas por segundo. La línea azul que representa la trayectoria de la célula se obtuvo a través de un software de seguimiento de células. Este último gráfico muestra las trayectorias de las células de las imágenes de la primera película.

Las trayectorias de las células que migraron hacia la mayor concentración de FPS soluble se muestran en negro, las trayectorias de los glóbulos rojos que migraron hacia concentraciones más altas de RGD adherente. Estas trayectorias mostraron que más células hela migraron hacia la fuente del atrayente de quimioterapia que hacia concentraciones más altas de RGD adherente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que para evitar la evaporación de PBS o medios en el dispositivo microfluídico durante la preparación del gradiente adhesivo y las imágenes del estilo de vida, use cinta adhesiva si es necesario para cubrir todas las entradas del dispositivo microfluídico.

Se pueden realizar otros métodos, como la transfección y la microscopía de solución híbrida, para responder a preguntas adicionales como la biomecánica del citoesqueleto que actúa mediante proteínas, proteínas de adhesión focal y receptores durante la migración celular.