Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

El objetivo general de este procedimiento es registrar actividades eléctricas de neuronas en una preparación intacta del cerebro de un pez. Esto se logra primero anestesiando un pez transgénico meca de cuatro a seis meses de edad en MS 2 22, y luego diseccionando su cerebro. A continuación, se contacta una de las neuronas de interés marcadas con GFP mediante un electrodo de registro y se registran sus actividades eléctricas mediante la técnica de parche suelto o de parche de célula íntegra.

En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en la frecuencia de disparo de los potenciales de acción o cambios en el potencial de membrana en respuesta a diferentes tratamientos en el cerebro intacto. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la electropatología de células en cultivo o preparaciones de cortes cerebrales, es que podemos caracterizar las propiedades eléctricas de las neuronas en una preparación de cerebro completo con circuitos neuronales intactos. Aunque esta técnica aporta información sobre la neuroendocrinología reproductiva, también puede aplicarse a otros sistemas neurobiológicos utilizando peces transparentes, como cuando las neuronas controlan la motivación y los comportamientos afectivos.

Esta demostración utiliza peces meca transgénicos en los cuales las neuronas de GnRH tres están genéticamente marcadas con GFP. Para comenzar, anestesie un adulto de maka sumergiéndolo en cinco mililitros de MS 222. Un par de minutos después de que cesen los movimientos branquiales, transfiera el pez a una placa de Petri de 60 milímetros con solución salina para peces. Ahora use tijeras para decapitar al pez en el extremo caudal del ala.

Transfiera la cabeza a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro, medio llenada con solución salina para peces y forrada con yl guard. El recipiente debe tener una depresión central en la que se colocará y fijará la cabeza con alfileres para insectos, con la cara dorsal hacia arriba, utilizando tijeras finas. Corte cuidadosamente la parte dorsal del cráneo a lo largo de su perímetro.

Luego, retire suavemente el cráneo con pinzas, exponiendo la parte dorsal del cerebro, incluyendo la parte anterior de la médula espinal. Ahora, levante suavemente la médula espinal con pinzas de punta fina y corte los nervios conectivos bilaterales utilizando tijeras de punta fina. Esto incluye cortar los nervios craneales, los nervios espinales, los nervios ópticos del lado ventral y los nervios olfatorios anteriores.

Coloque el cerebro completamente diseccionado en una nueva placa de Petri llena con solución salina fresca para peces bajo un microscopio. Verifique cuidadosamente que todo el cerebro y la glándula pituitaria estén intactos y no estén cortados ni perforados. Descarte los cerebros dañados e inicie nuevamente utilizando una aguja.

Coloque una pequeña gota de pegamento de acción rápida, como cianoacrilato, en el centro de la cámara de registro. Extienda la gota de pegamento sobre un centímetro cuadrado. Luego, transfiera rápidamente el cerebro al pegamento.

Fíjelo con el lado ventral hacia arriba. Ahora llene la cámara de registro con aproximadamente un mililitro de solución salina para peces, suficiente para cubrir el cerebro. Utilizando la pinza de punta fina, retire cuidadosamente las meninges que cubren la superficie del área de registro del cerebro, avanzando hacia adelante.

Perfunda continuamente el cerebro con solución salina para peces aireada a una velocidad de al menos 200 microlitros por minuto. Prepare de seis a diez microelectrodos de vidrio de seis a diez megaohmios y rellénelos aproximadamente hasta la mitad con solución de registro para parche líquido. Utilizando un microscopio fluorescente erguido equipado con una cámara CCD refrigerada, localice las neuronas del nervio terminal que expresan GFP y que producen gn RH tres, comenzando con el objetivo de 10x.

Luego cambie al objetivo de 40 x y localice las neuronas en la superficie ventral de los bulbos olfatorios o cerca de esta, justo por delante del cefalón. Ahora cambie a un monitor de video que muestre imágenes en tiempo real del microscopio. El grupo de neuronas contiene entre ocho y diez neuronas GnRH.

Coloque la microelectrodo en la cámara de registro con la punta del electrodo por encima del neurona objetivo. Aplique una ligera presión positiva constante para que la microelectrodo no se obstruya. Acérquese suavemente al neurona objetivo con la punta del electrodo, y verifique y supervise la resistencia del electrodo mediante el software Axo graft.

Al utilizar la prueba de sellado en modo de fijación de voltaje, cuando la punta del electrodo está sobre la superficie de la neurona, la resistencia del electrodo cambia ligeramente en este punto. Libere la presión positiva para formar un sellado de baja resistencia; si es necesario, aplique una ligera presión negativa. El paso más crítico para un buen registro consiste en seleccionar un brazo neuronal limpio, lo que puede ayudarle a lograr un sellado ideal entre el electrodo y la misma membrana.

Ahora cambie al modo de fijación de corriente. Abra el programa Chart de PowerLab y comience a registrar continuamente el voltaje de membrana sin ninguna entrada de corriente; ajuste la escala de voltaje y la velocidad de registro si es necesario. Registre la actividad eléctrica basal en solución salina normal para peces durante aproximadamente cinco minutos antes de aplicar cualquier tratamiento. La perfusión por baño de fármacos, hormonas, péptidos, etc., debe añadirse a la preparación del cerebro, fluyendo a 200 microlitros por minuto.

Luego, utilice solución salina normal para peces para un período de lavado después de localizar una celda; verifique y supervise la resistencia del electrodo en modo de fijación de voltaje. Cuando la punta del electrodo esté sobre la superficie de la neurona y la resistencia del electrodo cambie ligeramente, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para formar un sello de alta resistencia sobre la neurona.

Aplique succión bucal suave. Rompa la membrana celular parcheada. La resistencia caerá instantáneamente a unos 120-250 megaohmios cuando se rompa la membrana.

Ahora cambie al modo de fijación de corriente y registre continuamente el voltaje de la membrana mediante una gráfica sin ninguna entrada de corriente. Nuevamente, ajuste la escala de voltaje y la velocidad de registro según sea necesario. Después de realizar un registro basal de la actividad eléctrica en solución salina normal para peces durante aproximadamente cinco minutos, aplique los tratamientos seguidos de un período de lavado. Las actividades eléctricas espontáneas de las neuronas GNRH tres del nervio terminal moca se registraron en modo de fijación de corriente.

La frecuencia de disparo típica es de 0,5 a seis hertz. Los potenciales generalmente se disparan en un patrón tónico o rítmico con un intervalo entre picos bastante regular, y el potencial de membrana promedio entre picos es de aproximadamente menos 48 milivoltios. Este enfoque experimental también es exitoso para registrar neuronas GNRH marcadas con GFP localizadas en el prosencéfalo de adultos transgénicos.

Actividad eléctrica de neuronas de pez cebra en el cerebro intacto extraído de un transgénico. El pez cebra fue registrado de manera similar a la descrita para un DACA mediante parche suelto. Las mismas técnicas permitieron también el registro de células completas.

A diferencia de las neuronas de GnRH del nervio terminal meca, el patrón de actividad espontánea, disparo de potenciales de acción de las neuronas de GnRH del pez cebra en el área preóptica, cefalón ventral e hipotálamo es a menudo irregular. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora para una grabación de 15 minutos si se realiza correctamente. Buena suerte.