Name: Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a realizar inyección estereotáxica de vectores virales en la médula espinal de ratón para manipulación genética condicional. Este método permite expresión génica espacialmente restringida en la asta dorsal lumbar.

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Damos las gracias a A. Bakhos Tannous, Ph.D., Director de Desarrollo y Producción del vector en el Centro de Neurociencia del Hospital General de Massachusetts en Charlestown, Massachusetts, para que nos proporciona el vector rAAV-EGFP, Whang y Juan de asistencia técnica. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01 NS050408 (a JS) del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares.

El procedimiento quirúrgico descrito ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Columbia. 1. Preparación de equipos y suspensión de partículas de virus <ol><li> Limpiar y desinfectar el equipo, esterilizar los instrumentos quirúrgicos y los picos de primera categoría V que se utilizan para fijar L1 vértebra. </li><li> Tire y pipetas de cristal biselado. Nosotros usamos pipetas que tienen un diámetro de punta de 40 micras y están biselados en un ángulo de 20 °. Esterilice las pipetas de vidrio. </li><li> Establecer el marco estereotáxico, montar el inyector microjeringa sobre el manipulador y conectar el inyector al controlador. </li><li> Conecte una de las pipetas de vidrio a la microjeringa utilizando el kit de conexión de compresión. </li><li> Retire el émbolo de la microjeringa y llene la jeringa con aceite mineral. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftol) se puede añadir al aceite mineral para aumentar su visibility. Vuelva a insertar el émbolo y empujar a todo el camino hasta la punta. Con cuidado, evitar la creación de una burbuja de aire. </li><li> Preparar la suspensión de partículas de virus en una cabina de bioseguridad. Descongelar el virus congelado en hielo y, justo antes de su uso, diluir con agua estéril salina tamponada con fosfato a la concentración de partículas deseado. </li><li> Inserte la microjeringa en el soporte del inyector. </li><li> Verter de 5 l de la suspensión de virus en una hoja de plástico, por ejemplo Parafilm. Baje la punta de la pipeta de vidrio en la gota y tire del émbolo para llenar la microjeringa. Crear una pequeña burbuja de aire en la punta de la pipeta para evitar que se obstruya. </li></ol> 2. Laminectomía <ol><li> Prepare el área de la cirugía, limpiando banco y almohada eléctrica con desinfectante. </li><li> Se anestesia el ratón. Usamos anestesia por inhalación con isoflurano (3% durante inducción, 2% -3% durante el mantenimiento). </li><li> Coloque lubricante en cada ojo para proteger los ojos se sequen durante laoperación. </li><li> Afeitar el pelo de la espalda baja para el cuello del ratón y desinfectar la piel con alternancia de toallitas de un antiséptico tópico como la clorhexidina o povidona yodada y 70% de etanol. Aislar el sitio preparado asépticamente con paño quirúrgico y se infiltran en el sitio de la incisión con bupivacaína (0,25%, diluido 1:10 con solución salina fisiológica). </li><li> Incisión en la piel en el extremo caudal de la caja torácica a lo largo de la línea media (2-3 cm) y separar la fascia que cubre la columna vertebral. </li><li> Debido a que la médula espinal deja de crecer antes durante el desarrollo postnatal de la columna vertebral, segmento vertebral L4 se encuentra debajo de la primera vértebra lumbar (L1). Vértebra L1 se encuentra caudal a la vértebra que sostiene el último par de costillas. Identificar y exponer vértebra L1 mediante la eliminación de los pequeños músculos de la columna vertebral y los ligamentos adheridos a la superficie dorsal. </li><li> Levante ligeramente y mantén presionado L1 vértebra con una pinza Adson. Use unas pinzas laminectomía dedicados a eliminar el dorsal Portion de la vértebra (columna vertebral y de la lámina) y exponer la médula espinal. Evitar daños en la médula espinal. </li><li> Transferir el ratón sobre la placa de calentamiento en el marco estereotáxico. Controlar la temperatura del ratón durante la operación posterior. </li></ol> 3. Inyección <ol><li> Fijar vértebra L1 con puntas de primera clase V. Las espigas deben estabilizar la columna vertebral de modo que la vértebra no se mueve durante la respiración. </li><li> Llevar la microjeringa más cerca de modo que la punta de la pipeta está por encima del sitio de laminectomía. Baje el émbolo hasta que vea la suspensión de virus que sale de la pipeta. Retire la gota con una punta de algodón estéril. </li><li> Coloque la punta de la pipeta en la parte rostral más de la médula espinal expuesta. Centro de la pipeta por encima del surco mediano posterior, a continuación, mover la punta 500 m lateralmente. Baje la punta a la superficie de la médula y punción de la duramadre o, si usted está trabajando con una pipeta de vidrio unbeveled, use una cánula de acero biselado para perforar el dura. Baje la punta de la pipeta de vidrio 300 micras en la médula espinal. </li><li> Inyectar 1 l de suspensión de virus a una tasa de 200 NL / min. </li><li> Al final de la inyección, espere al menos 2 min antes de retraer lentamente la pipeta. </li><li> Repetir los pasos desde 3,3 hasta 3,5 en la porción caudal más-de la médula espinal expuesta para conseguir una distribución completa del vector viral en L4 segmento espinal. Los dos sitios de inyección se encuentran rostral y caudal del segmento L4 para evitar el daño tisular en la región diana. </li></ol> 4. Cierre de la herida <ol><li> Release vértebra L1 de las abrazaderas de primera clase V y quitar el ratón del marco estereotáxico. </li><li> Sutura de la fascia con vicryl 5.0. La fascia cerrado proporciona cobertura para el sitio de laminectomía. </li><li> Cierre la piel con suturas de nylon o grapas quirúrgicas. </li></ol> 5. Cuidado Postoperatorio <ol><li> Transferir el ratón en una jaula de recuperación con ropa de cama blanda, nonparticular. Colócalo en tél laterales para respirar cómodo. Supervisar el animal hasta que esté completamente alerta, ambulante y empieza a beber. </li><li> Nos proporcionar analgesia posquirúrgica durante 72 h con inyecciones subcutáneas diarias de carprofeno (5,0 mg / kg). </li><li> Monitorear la recuperación postquirúrgica mediante la inspección diaria durante los primeros 3 días, luego cada dos días o 3 días a la semana hasta que el experimento está completo. </li><li> Eliminar las suturas de la piel o las grapas 7 a 10 días después de la operación, cuando la curación de heridas es completa. </li><li> Sacrificar al animal después de la finalización del experimento. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

La inyección del vector estereotáxica permite dirigir las neuronas de médula espinal para aplicaciones tales como mapeo de la red neuronal basada en virus transsynaptic propagación 6,7 o disección optogenético 8, guiado de los axones durante la regeneración de lesiones 9,10, o la terapia génica para la prevención o el tratamiento de la neurodegeneración 11, 12. Los vectores virales han sido utilizados para la manipulación de genes en la médula espinal para estudiar las vías so...

Las tecnologías avanzadas de manipulación de genes en el ratón condicional permitir que los enfoques multifacéticos para la exploración de las vías sinápticas y las conexiones funcionales en el sistema nervioso central. Los transgenes pueden ser reguladas por efectores de moléculas pequeñas tales como doxiciclina que actúan sobre un transactivador controlado por tetraciclina, que puede ser diseñado para funcionar como un represor o un activador de la transcripción de genes, o tamoxifeno reconociendo un ligando mutado dominio de unión del receptor de estrógeno 1 . Modificación irreversible transgén se consigue comúnmente por el ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinasas. Cre (recombinación causas) y FLP (enzima flipasa recombinación) catalizan la escisión, la inversión o translocación de fragmentos de ADN que están flanqueadas por loxP (locus de cruce sobre x, P1) o frontales (objetivo flipasa reconocimiento) los sitios, respectivamente 1. Las aplicaciones incluyen la activación de genes o el silenciamiento y inducible por ácido ribonucleico (ARN) interferencia <sup&gt; 2. Expresión condicional de reporteros fluorescentes o enzimáticos, tales como β-galactosidasa o fosfatasa alcalina se puede utilizar para etiquetar las neuronas y examinar su organización tópica y conectividad 3. Proyectos a gran escala de mutagénesis en América del Norte ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) y Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) están produciendo bibliotecas de clones de embriones de ratón con células madre objetivos condicionales de genes y trampas que eventualmente se cubren todo el genoma del ratón. Los ratones generados a partir de estos clones se pueden cruzar con un número creciente de líneas de ratón que expresan recombinasas de ADN bajo promotores o loci específicos para una población particular de neuronas para la manipulación selectiva de genes ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Sin embargo, la restricción de manipulación génica para diferentes poblaciones de neuronas o regiones particulares de interés no puede lograrse mediante modificación genética dirigida solo si un promotor específico para la población de neuronas de interés no se conoce o no se expresan por todas las neuronas en la región de interés. En la médula espinal, los diseños experimentales pueden requerir restricción espacial de la manipulación genética de uno o dos segmentos craneocaudal. Inyección estereotáxica de un vector viral que expresa Cre o Flp permite limitar la recombinación de genes para las regiones en la médula espinal de ratones en los que los fragmentos de ADN están flanqueados por sitios FRT o loxP, los llamados alelos floxed o flrted. A diferencia de la reordenación del ADN constitutiva, que sería el resultado de cruzamiento de los animales con ratones que expresan recombinasa, esta estrategia también proporciona un control temporal sobre la activación de genes o el silenciamiento. Los vectores virales que codifican floxed o coqueteó transgenes ofrecen una opción inversa de la manipulación genética en ratones que expresan el corresponding aguas abajo de un promotor de recombinasa específica de neuronas. Varios vectores recombinantes con afinidad a las neuronas están disponibles 4. De alta capacidad (gutless) adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple y lentivirus son comúnmente utilizados vectores neurotrópicos. Selección del virus apropiado para una pregunta de investigación es una parte crucial del diseño experimental. Tamaño del transgén, vía de administración, la especificidad de la infección a las neuronas frente a las células gliales, infección de eficacia, los efectos secundarios inflamatorios y tóxicos necesitan ser considerados 4. Aquí se describe la inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal de la médula espinal, una técnica que se emplea para la regulación génica condicional en nuestra investigación sobre la neurobiología del dolor. El cuerno dorsal recibe impulsos aferentes primarios de neuronas somatosensoriales incluyendo las neuronas nociceptivas. Interneuronas locales procesar la información antes de transmitirla neuronas de proyección deel cuerno dorsal al cerebro 5. Se demuestra que la infección de las neuronas del asta dorsal a nivel espinal segmentaria L4 con un neurotrópico recombinante adeno-associated virus (rAAV) que expresa aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo un promotor de citomegalovirus constitutivamente activo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Placa base Espinal </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeños animales instrumento estereotáxico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Ratón anestesia cabeza titular </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Soportes ajustables de base </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V muesca picos </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura pequeño sistema de control de animales </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps laminectomía </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (uno) con SYS-Micro4 Controller </td><td> World Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microjeringa 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN accesorio de compresión, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Inyección intraparenquimatosa de un vector viral permite la manipulación génica condicional en distintas poblaciones de neuronas o regiones particulares del sistema nervioso central. Se demuestra una técnica de inyección estereotáxica que permite la expresión del gen objetivo o el silenciamiento en el cuerno dorsal de la médula espinal de ratón. El procedimiento quirúrgico es breve. Se requiere laminectomía de una sola vértebra, proporcionando para la recuperación rápida del animal y de la motilidad irreprochable de la columna vertebral. Inyección controlada de un volumen pequeño vector suspensión a baja velocidad y el uso de una microjeringa con cánula de cristal biselado minimizar la lesión del tejido. La respuesta inmune local al vector depende de las propiedades intrínsecas del virus empleados, en nuestra experiencia, es menor y de corta duración cuando un recombinante de virus adeno-asociado se utiliza. Un gen informador tal como la proteína verde fluorescente mejorada facilita la distribución de seguimiento espacial del vector, y la eficacia y la especificidad celularficidad de la transfección.

El éxito de los rendimientos de transfección de expresión génica robusto en las neuronas del asta dorsal de inyección (Figura 1), evitando que el cuerno dorsal del lado contralateral, el cuerno ventral y los ganglios de la raíz dorsal. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transfección de neuronas del asta dorsal. (A) Expresión de la EGFP reportero fluorescente (verde) en el cuerno izquierdo dorsal de la médula esp...

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

El objetivo general de este procedimiento es lograr una expresión génica espacialmente restringida en la médula espinal de ratón mediante la inyección estereotáctica de un vector viral en el cuerno dorsal lumbar. El primer paso del procedimiento consiste en localizar y exponer la vértebra lumbar. El segundo paso es eliminar la porción dorsal de la vértebra con el fin de revelar la médula espinal.Un procedimiento denominado laminectomía. A continuación, se coloca una pipeta de vidrio conectada a una bomba de microjeringa sobre el cuerno dorsal y se introduce en la médula espinal. El último paso consiste en inyectar lentamente la suspensión del vector.Dos semanas después, la transfección de neuronas de la asta dorsal se demuestra mediante la expresión de la proteína verde fluorescente, lo que permite rastrear la distribución del virus. Este método ayuda a esclarecer la función de las neuronas en parte de la vía sensorial. Lo utilizamos en estudios que se centran específicamente en el desarrollo del dolor inflamatorio o neuropático.La demostración visual es fundamental para aprender cómo posicionar al ratón en el marco estereotáctico. Es esencial para el éxito del procedimiento que la

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Porlan, E., et al. Modificación genética estable y eficiente de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de efectos autónomos y no autónomos de células madre neurales. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la modificación genética estable de células madre neurales (NSC) en la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) mediante la inyección estereotáxica de un gen terapéutico portador de virus en un modelo de ratón. El virus ingresa a las NSC, se somete a transcripción inversa,...

Inyección estereotáxica de virus para la modificación genética estable en un modelo de ratón

Fuente: Chen, S., et al., Cirugía estereotáxica para la manipulación genética en células estriatales de cerebros de ratones neonatales. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un vector viral que codifica la recombinasa Cre y la proteína de fluorescencia verde o GFP en el cuerpo estriado de un cachorro de ratón modificado genéticamente para lograr la manipulación génica mediante la extirpación de un casete STOP flanqueado por loxP, activando la proteína de...

Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

Fuente: Tadokoro, T., et al. Administración del vector del virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra una técnica de inyección subpial para la administración de genes a la médula espinal en ratones. El procedimiento consiste en exponer la duramadre, perforar la piamadre e inyectar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que lleva un gen que expresa proteínas fluorescentes en el espacio subpial. Después de la inyección y la recuperación,...

Entrega de genes subpiales en la médula espinal del ratón para evaluar la expresión génica

Fuente: Pereira, M. et. al., Reprogramación directa in vivo de células gliales residentes en interneuronas mediante inyección intracerebral de vectores virales. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado en la corteza cerebral de un ratón transgénico para administrar genes reporteros fluorescentes y de reprogramación neuronal dependientes de Cre en células gliales.

Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, envasado y entrega de retro y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la inyección viral estereotáxica para una edición precisa de genes neuronales en el cerebro del ratón. El protocolo garantiza la administración precisa del virus a la circunvolución dentada, lo que permite el etiquetado fluorescente y la eliminación de genes mediada por CRISPR para estudiar los circuitos...

Inyección viral estereotáxica para la edición de genes neuronales dirigidos en el cerebro del ratón

Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las...

Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.

Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.

Apuntando al tracto corticoespinal en ratas neonatas con un vector viral doble utilizando cirugía combinada de cerebro y columna vertebral

Una inyección intratecal lumbar representa una vía de administración traslacionalmente relevante para administrar terapia génica al sistema nervioso central. Este protocolo estandarizado integral para inyecciones intratecales lumbares en ratones y ratas neonatales, juveniles y adultos tiene como objetivo guiar a los investigadores en la adopción de esta técnica para estudios preclínicos de terapia génica.

Inyección intratecal lumbar de vectores de terapia génica para el sistema nervioso central dirigida en ratones y ratas

Aprende a realizar inyección estereotáxica de vectores virales en la médula espinal de ratón para manipulación genética condicional. Este método permite expresión génica espacialmente restringida en la asta dorsal lumbar.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

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