Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón
18 de marzo de 2013
Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.
El objetivo general de este procedimiento es lograr una expresión génica espacialmente restringida en la médula espinal del ratón mediante la inyección estereotáctica de un vector viral en el asta dorsal lumbar. El primer paso del procedimiento es localizar y exponer la vértebra lumbar. El segundo paso es extirpar la porción dorsal de la vértebra para revelar la médula espinal.
Procedimiento que se denomina laminectomía. A continuación, se coloca una pipeta de vidrio conectada a una microbomba de jeringa sobre el asta dorsal y se baja hasta la médula espinal. El paso final es inyectar lentamente la suspensión vectorial.
Dos semanas después, se demuestra la transfección de las neuronas del asta dorsal mediante la expresión de la proteína fluorescente verde, que permite rastrear la distribución del virus. Este método ayuda a dilucidar la función de las neuronas en algunas de las vías sensoriales. Lo utilizamos en estudios que se centran específicamente en el desarrollo de dolor inflamatorio o neuropático.
La demostración visual es fundamental para aprender a colocar el ratón en el marco estereotáctico. Es esencial para el éxito del procedimiento que la columna vertebral se fije correctamente porque la laminectomía es una técnica muy delicada. Martin Mole, un estudiante graduado de mi laboratorio, hará una demostración del procedimiento.
John Wang, un asistente de investigación, lo ayudará uno o dos días antes del procedimiento. Pipetas de vidrio Pul para obtener un diámetro de punta de 40 micrómetros y biselar la punta en un ángulo de 20 grados el día de la cirugía. Comience el procedimiento desinfectando el equipo quirúrgico y preparando las herramientas quirúrgicas estériles para configurar el marco estereotáxico.
Monte el inyector de microjeringa en el manipulador y conecte el dispositivo. Fije una de las pipetas de vidrio a la microjeringa mediante el accesorio de compresión. Ahora retire el émbolo de la micro jeringa.
Llene la jeringa con el aceite mineral, luego vuelva a insertar el émbolo y empújelo hasta la punta. Con cuidado: Evite crear burbujas de aire. A continuación, inserte la microjeringa en el soporte del inyector.
A continuación, retire el virus del congelador y prepare la suspensión de partículas de virus justo antes de usarla diluyéndola con solución salina estéril tamponada con fosfato hasta la concentración de partículas deseada. Pipetear cinco microlitros de la suspensión del virus en un pequeño trozo de parámetro. A continuación, baje la punta de la pipeta de vidrio en la gota y tire del émbolo para llenar la microjeringa.
Al final. Cree una pequeña burbuja de aire en la punta de la pipeta para evitar que se obstruya. En este paso, prepare el área de la cirugía limpiando el banco en la almohadilla térmica con desinfectante.
A continuación, anestesiar al ratón mediante la inhalación de flúor. A continuación, aplique lubricante en cada ojo para protegerlos del secado durante la operación Después, afeite el pelaje desde la parte inferior de la espalda hasta el cuello del ratón. Desinfectar la piel con toallitas alternas de un antiséptico tópico, como clorhexidina o povidona yodada, y etanol al 70%.
A continuación, infiltrar el sitio de la incisión con bupivacaína al 0,25% diluido de uno a 10 con solución salina fisiológica. Posteriormente se incide la piel en el extremo de la caja torácica, de dos a tres centímetros a lo largo de la línea media y se separa la fascia que cubre la columna vertebral. Identifique la vértebra L uno, que se encuentra mimada a la vértebra, sosteniendo el último par de costillas y expóngala eliminando los pequeños músculos y ligamentos espinales unidos a su superficie dorsal.
A continuación, levante ligeramente y sujete la vértebra L uno con un par de aditivos y pinzas. A continuación, utilice una pinza de laminectomía específica para extirpar la parte dorsal de la vértebra, incluida la apófisis espinosa y la lámina para exponer la médula espinal. Evite dañar la duramadre o la médula espinal durante este procedimiento.
A continuación, transfiera el ratón a una placa calefactora en el marco estereotáxico y controle la temperatura del ratón durante la operación posterior. Ahora use los picos de la muesca en V para estabilizar la columna vertebral para que la vértebra no se mueva durante la respiración. A continuación, acerque la microjeringa de modo que la punta de la pipeta quede por encima del sitio de la laminectomía.
Baje el émbolo hasta que vea que la suspensión del virus sale de la pipeta. Retire la gota con una gasa estéril. A continuación, coloque la punta de la pipeta en la porción más rostral de la médula espinal expuesta.
Centre la pipeta por encima del surco mediano posterior y mueva la punta 500 micrómetros lateralmente. Después de eso, baje la punta a la superficie del cordón y perfore la duramadre. Posteriormente, baje la punta del vaso, pipetee 300 micrómetros en la médula espinal.
Inyecte un microlitro de suspensión de virus a una velocidad de 200 nanolitros por minuto. Al final de la inyección, espere al menos dos minutos antes de retraer lentamente la pipeta. Repita el procedimiento de inyección en la porción más mimada de la médula espinal expuesta para lograr la distribución completa del vector viral en el segmento espinal L cuatro.
Los dos sitios de inyección están ubicados en el segmento rostral y en el segmento L cuatro. Para evitar daños en los tejidos en la región diana después de la liberación de la inyección, la vértebra L uno de la muesca en V se sujeta y retira el ratón del marco estereotáxico. A continuación, sutura la fascia con cinco oh Vicryl.
La fascia cerrada proporciona cobertura para el sitio de la laminectomía. A continuación, cierre la piel con suturas de nailon o grapas quirúrgicas. Proporcionar analgesia postquirúrgica durante 72 horas con inyecciones subcutáneas diarias de carprofeno a cinco miligramos por kilogramo.
Transfiera el mouse a una jaula de recuperación con ropa de cama suave y no particular. Coloque el mouse a un lado para respirar cómodamente. A continuación, vigile al animal hasta que esté completamente alerta.
Ambulancia y empieza a beber. Monitorizar la recuperación postquirúrgica mediante inspección diaria durante los tres primeros días. Luego, cada dos días o tres días a la semana hasta que se complete el experimento.
De siete a 10 días después de la operación, cuando se completa la cicatrización de la herida. Retire las suturas o grapas de la piel. Esta figura muestra la expresión de la proteína reportera fluorescente verde mejorada o EGFP en el asta dorsal izquierda de la médula espinal L cuatro.
Dos semanas después de la inyección estereotáxica de las neuronas R-A-A-V-E-G-F-P se inmunotinción para los núcleos neuronales de la proteína que se muestra en punta de flecha roja. Señale las células gliales transfectadas dispersas en la columna dorsal. Aproximadamente el 80% de las neuronas del asta dorsal medial estaban infectadas con la práctica.
El procedimiento se puede completar en 30 a 40 minutos, y recuerde mantener las condiciones estériles durante el procedimiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar inyecciones de chimal intra pino en la dosis de la médula espinal del ratón. Estamos utilizando la técnica para la manipulación de genes, pero puede adaptarla para otros fines, como la aplicación intraespinal de fármacos.
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Descripción general
Este estudio demuestra un método para lograr una expresión génica restringida espacialmente en la médula espinal de ratón mediante la inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal lumbar. Esta técnica permite la manipulación génica dirigida, particularmente en áreas de contacto sináptico entre aferentes somatosensoriales primarios y neuronas del sistema nervioso central.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Terapia Génica
- Investigación de la Médula Espinal
Antecedentes
- Los vectores virales se utilizan para la manipulación génica.
- El asta dorsal lumbar es un sitio importante para las interacciones sinápticas.
- La expresión génica condicional puede ayudar a comprender los mecanismos neuronales.
- La inyección estereotáxica es un método preciso para dirigirse a regiones cerebrales específicas.
Objetivo del estudio
- Lograr una expresión génica dirigida en la médula espinal.
- Explorar los efectos de la manipulación génica sobre la función de la médula espinal.
- Proporcionar un marco metodológico para investigaciones futuras.
Métodos Utilizados
- Localizar y exponer la vértebra lumbar.
- Realizar una laminectomía para acceder a la médula espinal.
- Utilizar una pipeta de vidrio conectada a una bomba de microjeringa.
- Inyectar la suspensión del vector viral en el asta dorsal.
Resultados Principales
- Inyección exitosa del vector viral en el cuerno dorsal lumbar.
- Expresión génica condicional observada en neuronas diana.
- El método demostró efectividad para la manipulación restringida espacialmente.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de trastornos relacionados con la médula espinal.
Conclusiones
- El método permite una manipulación génica precisa en la médula espinal.
- Puede utilizarse para investigar el papel de genes específicos en la función neural.
- Este enfoque podría mejorar nuestra comprensión de la fisiología de la médula espinal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración estereotáxica de vectores virales permite una manipulación génica precisa y espacialmente restringida en el asta dorsal de la médula espinal del ratón, una región clave para la investigación del procesamiento sensorial y de las vías del dolor. Este enfoque apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en el descubrimiento en neurociencia, al permitir la expresión o silenciamiento génico condicional en poblaciones neuronales definidas. El método proporciona una plataforma reproducible para vincular dianas genéticas con fenotipos funcionales en modelos preclínicos del dolor, lo que orienta las decisiones de avance o abandono en la selección de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al permitir la expresión génica condicional en poblaciones específicas de neuronas de la médula espinal.
- Valor operativo: Proporciona un enfoque quirúrgico estandarizado para lograr un targeting consistente de la asta dorsal lumbar entre estudios.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica de la función génica en las vías del dolor, ayudando en la evaluación de la confianza en el blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera métricas cuantificables de transfección (por ejemplo, expresión de EGFP) para evaluar la eficiencia de entrega del vector y la especificidad celular.
- Valor operativo: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para ensayos posteriores de compuestos o moduladores en modelos de dolor.
- Escalabilidad: El procedimiento breve (30–40 minutos) y la recuperación rápida del animal favorecen una mayor capacidad de procesamiento en flujos de trabajo de descubrimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela directamente los mecanismos del dolor inflamatorio y neuropático, alineándose con las prioridades del área terapéutica.
- Continuidad traslacional: Relaciona la modulación del objetivo en la médula espinal con fenotipos conductuales del dolor, apoyando la validación preclínica.
- Avance ajustado al riesgo: Permite reducir el riesgo mecanicista al aislar efectos específicos de genes en un circuito relevante para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre un blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica, especialmente para blancos del sistema nervioso central implicados en el procesamiento sensorial.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la manipulación génica restringida espacialmente en regiones definidas de la médula espinal.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas (por ejemplo, intensidad de fluorescencia, tasas de transfección específicas para cada célula) para evaluar el rendimiento del vector y el efecto biológico.
- Análisis: Permite correlacionar la eficiencia de transfección con resultados funcionales, aportando información para evaluaciones de respuesta a la dosis y de interacción con el blanco.
- Investigación Traducional: Conecta la manipulación génica en la médula espinal con fenotipos relacionados con el dolor, apoyando estudios preclínicos alineados con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma quirúrgica reutilizable adaptable a diversos vectores virales, promotores o transgenes en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al reducir los efectos fuera del blanco y aumentar la precisión anatómica en estudios de manipulación génica.
- Valor operativo: Fomenta la reproducibilidad mediante coordenadas estereotáxicas estandarizadas, parámetros de inyección y cuidados posoperatorios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al proporcionar claridad mecanicista sobre la función del blanco en las vías del dolor.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en fenotipos validados de la médula espinal.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica en roedores, técnicas microquirúrgicas y ejecución de procedimientos asépticos.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo marco estereotáxico, bomba de microjeringa y pipetas de vidrio biseladas.
- Necesita la preparación estandarizada de vectores virales y la verificación del título para una dosificación consistente entre experimentos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes segmentos de la médula espinal, serotipos virales o cargas de transgenes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad quirúrgica y la respuesta del tejido, que deben controlarse mediante entrenamiento del operador y estandarización del protocolo.
