Name: Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Aprende a silenciar ITSN-1s en pulmones de ratones mediante inyecciones retroorbitales repetidas de complejos siRNA/liposomas catiónicos. Este método seguro reduce los niveles de proteína y ARNm en un 75% durante 24 días.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Subvenciones R01HL089462 a SP.

1. Los liposomas catiónicos Preparación <ol><li> Autoclave un matraz limpio para ser utilizado para la preparación lipososmes. </li><li> Preparar soluciones madre: <ol class="lalpha"><li> - Disolver 200 mg de bromuro de dimetil dioctadecil amonio (Doab) en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. </li><li> - Disolver 200 mg de colesterol en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. </li><li> - Preparar y esterilizar en autoclave para esterilizar el 5% de glucosa en 100 ml de ARN / ADN-asa agua destilada libre. </li></ol></li><li> Enjuagar el matraz con cloroformo. Añadir 5-10 ml al matraz, remolino, y dejar que repose durante unos minutos. Mantener el matraz cubierto con papel de aluminio en todo momento. Vacíe el cloroformo del matraz. </li><li> Preparación de liposomas: <ol class="lalpha"><li> - Añadir 315 l de Doab solución madre en el matraz de fondo redondo. </li><li> - Añadir 200 l de solución madre de colesterol al matraz. </li><li> - Añadir 9,5 ml de cloroformo al matraz unand mezcla por turbulencia. </li></ol></li><li> Ajuste el rotavapor a 37 ° C, 100 revoluciones por minuto (rpm) o más (100-120 rpm). El rotavapor se debe conectar a un control de vacío de la bomba de agua con un tubo de succión conectado correctamente. </li><li> Conecte el tanque de gas argón y el rotavapor. </li><li> Coloque el matraz al rotavapor y ajustar la configuración óptima antes de bajar en el baño de agua. Abra la primera válvula para el argón completamente en sentido antihorario. Siempre abrir y cerrar la válvula de primera. La segunda válvula controla la presión de argón que sopla en al matraz. La presión debe ser siempre suave. </li><li> Baje el rotavapor en el baño de agua, suficiente para el frasco de tocar el agua sin estar completamente sumergida y encienda la velocidad. </li><li> Espere hasta que todas las cloroformo se evapora, a unos 10 min. A continuación, detenga la máquina. </li><li> Apague la velocidad rotavapor y las válvulas del tanque de argón. Ahora el matraz debe ser eliminado. </li><li> Añadir 2 ml de glucosa al 5% a the matraz para disolver los lípidos. </li><li> Raspe el fondo del frasco a fondo con 1 ml punta de la pipeta para disolver los lípidos. Después de rascarse, eliminar cualquier resto de grasa de la punta de 1 ml en el frasco, si es necesario, con un segundo punta. </li><li> Incubar la solución obtenida en el baño de agua 42 ° C, mientras que lentamente agitación (15 rpm) al matraz. </li><li> Llene el tanque de ultrasonidos con agua fría. Someter a ultrasonidos la solución durante al menos 20-30 minutos con el matraz mantenido y la parte inferior apenas tocando el agua. </li><li> Calentar el matraz en el baño de agua del evaporador rotatorio durante 20 min a 42 ° C, a velocidad cero, con el fondo redondo se sumerge en agua, esta vez. </li><li> Filtrar los liposomas a través de un 0,47 micras y, posteriormente, filtros de jeringa de 0,22 micrones. </li><li> El uso de un pequeño extrusor, filtrar los liposomas a través de una membrana de 50 nm para generar una población homogénea de vesículas de liposomas unilamelares. </li><li> La transferencia de los liposomas a un tubo Eppendorf y colocarlo en hielo. </li></ol><html> 2. Preparar los liposomas: siRNA ITSN-1 Complejos <ol><li> Resuspender el ratón en-blanco ITSN ARNsi en tampón de ARNsi que contiene 20 mM de HEPES y cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, a una concentración final de 2 mg / l. Guárdelo en hielo antes de la mezcla. </li><li> Preparación de los liposomas: ITSN complejos de siRNA en una proporción de 8 nmol de liposomas: 2 mu g de ARN (o 400 nmol de liposomas: 100 g ARNsi ITSN). En el presente estudio, se añadieron 50 l de ITSN siRNA de la solución madre (50 mM) a 100 l de liposomas recién preparadas usando un ARN / ADN-asa libre de Eppendorf tubo. Tenga en cuenta que la concentración de ITSN ARNsi es muy importante, ya que un máximo de 150 l de mezcla puede ser inyectada bilateralmente y retro-orbital en el ratón a la vez. </li><li> Mantenga la mezcla en hielo mientras se espera para inyectar a los ratones. </li></ol> 3. Ratón inyección en la vena retro-orbital (ángulo interno de la órbita del ojo) jove_content &quot;&gt; Todos los experimentos con ratones se aprobaron y se realizan de acuerdo con las directrices de la Universidad Rush Institucional Cuidado de Animales y el empleo. <ol><li> Se anestesia el ratón por inyección intra-peritoneal de un mg / kg de ketamina peso 50 corporal y 5 mg / kg de xilazina peso corporal (mezcla disponible comercialmente). Dependiendo del peso de los animales y la edad, ajuste el volumen y la concentración de los anestésicos. Los ratones utilizados en el estudio son los ratones CD1 ratones machos, de 6-8 semanas de edad y pesan alrededor de 25 gramos. Las jeringas son de tuberculina de 1 ml tipo con la aguja puesta. </li><li> Mantenga orejas de ratón con una mano y gire el ratón sobre un lado para exponer el ángulo interno del ojo. Apunte medial de la plica semilunar, evite tocar el globo ocular. </li><li> Acérquese a la carúncula lagrimal del ojo que sostiene la jeringa que contiene la mezcla en un ángulo de 45 grados en los tres ejes. </li><li> Inyecte lentamente la mezcla y dejar que el ratón para recuperarse con el lado inyectado arriba. Si un líquido grandeformas de gotas en el lugar de inserción de la aguja, retraer la aguja, la succión de nuevo la gota en la jeringa y vuelva a intentarlo. Las inyecciones repetidas se hacen mejor por la alternancia de los ojos, para permitir la recuperación perfecta. Si no está seguro, esta técnica se puede comprobar mediante la inyección de colorante azul (50 l, 0,5% de cristal violeta en metanol) y la exposición de los pulmones de los ratones para observar la vasculatura azul. </li><li> Los ratones en este estudio se inyectaron cada día 3 ª durante 3 semanas sin víctimas mortales o efectos adversos. </li></ol> 4. Ratón de perfusión pulmonar y recogida de tejidos para estudios bioquímicos <ol start="0"><li> Establecer la bomba peristáltica para funcionar a 1,5 ml / min. </li><li> Preparar el entorno: ventilador, mesa de operaciones, instrumentos, hisopos de algodón estériles, q-tips, cuerdas, vasos, agua destilada, salina equilibrada de Hank, trazador. </li><li> Se anestesia el ratón mediante inyección intraperitoneal de la mezcla anestésica (100 mg / kg de ketamina peso corporal y 10 mg / kg de xilazina peso corporal). </li&gt; <li> A nivel del cuello, eliminar las glándulas salivales y exponer la tráquea. </li><li> Comience con la laparotomía, cortar el diafragma, y ​​seguir con la toracotomía, la exposición de los pulmones y el corazón. </li><li> Retire el timo. </li><li> Con el microscopio óptico para una mayor precisión, cateterización de la arteria pulmonar. </li><li> Haga traqueotomía y entubar el ratón usando el traqueostoma. Ajuste el ventilador a una velocidad de 150 golpes / min y el volumen de carrera de 150 l. </li><li> Como salida, abra la aurícula izquierda. </li><li> Perfundir la vasculatura pulmonar del ratón libre de sangre durante 5 min, usando la bomba peristáltica y solución de Hank calentado a 37 ° C. </li><li> Perfundir el trazador (8 nm de oro-albúmina 16) para 10 min adicionales a la misma velocidad de flujo. </li><li> Enjuague el trazador no unido por 5 min de perfusión pulmonar con solución de Hank. </li><li> Siga con la fijación in situ de los pulmones por 10 min de perfusión de 4% (peso / vol) de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído y ácido tánico al 1% en 0,1 TUBOStampón, pH 7,2. </li><li> Recoge los pulmones, retire el exceso de tejido, cortar pequeños bloques (3/3 mm), y colocarlos en un vial de centelleo de marcado que contiene 2 ml de la mezcla de fijador. </li></ol> Los ratones caducarán completamente anestesiada durante el procedimiento. 5. Ratón pulmón Procesamiento de tejido de EM <ol><li> Preparar soluciones madre: 1% Palade OsO4, acetato de veronal y tampón Kellenberger. <ol class="lalpha"><li> - 1% Palade-OSO tampón 4 contiene: 1 ml de caldo de veronal de etilo, 1,25 ml de 4% OSO 4, 1 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, y agua destilada hasta 5 ml de volumen final. </li><li> - Acetato de solución madre de veronal se obtiene por disolución de 1,15 g de acetato de sodio andydrous y 2,94 g de barbital en 100 ml de agua destilada. </li><li> Solución-Kellenberger contiene 2 ml de acetato de stock veronal, 2,8 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, 0,05 g de acetato de uranilo, y 5,1 mlde agua destilada, pH = 6. </li></ol></li><li> Lavar los bloques de pulmón en 0,1 M de cacodilato de sodio tampón, pH = 7,4, 3 veces brevemente. </li><li> Fijar las muestras en el 4% (peso / vol) de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído en 0,1 TUBOS tampón, pH 7,2, durante 1 hora, a temperatura ambiente. </li><li> Post-arreglar con un 1% Palade-osmio durante 1 hora en la capilla, en el hielo, en la oscuridad. </li><li> Lavar una vez con tampón Kellenberger. </li><li> Incubar las muestras en tampón de Kellenberger durante 2 horas a toda la noche, a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar una vez en etanol al 50%. </li><li> Deshidratar con serie graduada de etanol, 5 min / cada uno: 70%, 95%, luego 2 x 15 min 100% de etanol. </li><li> Cambiar a óxido de propileno 100%, 2 x 15 min. </li><li> Eliminar el óxido de propileno y añadir una mezcla de óxido de propileno 50% y 50% Epon 812, incubar durante la noche, en una rueda giratoria, a temperatura ambiente. </li><li> La mañana siguiente, retire la mezcla y añadir Epon fresca 812, al menos por 4-5 horas en el volante. </li><li> Utilizando moldes cónicos duplicado, llenosmedio camino con fresca 100% Epon 812, añadir especímenes seleccionados y colocarlos a los bordes. </li><li> Mueva los moldes a la incubadora a 60 ° C y dejarlos curar durante 48-72 horas. </li><li> Cuando se polimeriza, envía los bloques de estar delgado (60-70 nm de espesor) seccionado. </li></ol>

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<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con base en estudios anteriores publicados por otros 9 y nosotros 1, 18 hemos desarrollado esta metodología para el largo plazo derribar de ITSN-1 in vivo mediante la administración intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 días consecutivos) de siRNA / liposoma. Este enfoque experimental es eficaz, se puede utilizar de forma segura y en repetidas ocasiones y que se puede extender fácilmente para estudiar la implicación de un gen que codifica cualquier proteína de interés en el endot...

ARNsi desnudo no puede penetrar la membrana celular, siendo cargado negativamente, y es fácilmente degradado por enzimas en la sangre, tejidos y células. Incluso con recientemente modificaciones estructurales para mejorar la estabilidad, la acumulación de siRNA en el sitio diana después de la administración es extremadamente baja y requiere un vehículo intracelular eficiente 5. Los liposomas catiónicos surgieron como seguras ácidos nucleicos portadores con el potencial de transferir grandes piezas de ADN / ARN en las células mediante la encapsulación y la protección de los ácidos nucleicos a partir de la degradación enzimática 6. También, los liposomas catiónicos espontáneamente interactúan con el ADN / ARN, promoviendo así la transferencia de genes a las células 2. Más recientemente, los liposomas se han aplicado para entregar vacunas y fármacos de bajo peso molecular 7. Entrega liposomal de microARN-7-plásmido que expresa supera factor de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa inhibidor de la resistencia en las células de cáncer de pulmón 8. Cuando el objetivo es laendotelio vascular, la administración intravenosa es esencial, ya que los complejos son poco probable que cruzar la barrera endotelial y extravasación en el intersticio 9. En comparación a otros órganos, ECs de la microvasculatura del pulmón tener el mayor absorción y ávidamente internalizar liposomas catiónicos y complejos de ADN / ARN, seguido por los ganglios linfáticos y los parches de Peyer 9. La entrega por vía intravenosa en modelos de roedores de ARNsi a través de inyecciones en la vena retro-orbital o de la cola ha sido probado ser inofensivas incluso en altas concentraciones, tales como 50 mg / kg 10. En la literatura publicada la composición de los liposomas catiónicos es diferente, basada en la formulación de lípidos y su relación equimolar 11, 12. Hay una amplia gama de aplicaciones potenciales utilizando liposomas catiónicos para la entrega de genes in vivo, ya sea dirigiéndose down-regulation/over-expression de las proteínas, la entrega de vacunas o terapias anti-tumorales 13-15. Es importante recordares que la eficiencia de ADN / ARN-interacción membrana celular está regulada por el acoplamiento de forma entre los complejos generados y lípidos de membrana. Esto sugiere que la adaptación de la composición de los lípidos de los perfiles de la membrana celular específicos puede ser beneficioso y el resultado en altas tasas de transfección en un tipo de célula particular 6.

<table><tbody><tr><td>Bromuro de dimetil dioctadecilo amonio (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>LiposoEstabilizador rápido (mini-extrusora)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato, 19 mm de diámetro, 50 nm de poro</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Sales equilibradas de Hank</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Ratón siRNAITSN - en el objetivo </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF digital con cabezal</td><td></td>de bomba RHOO</tr><tr><td>Ventilador</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>Descatalogado por el fabricante</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de incrustación</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm trazador</td><td></td> de oro-albúmina <td>Preparado en el laboratorio como in16</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Equipado con 2 Avestin 1 ml jeringas estancas al gas (cat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">SiRNA modificado, in vivo</td></tr><tr><td colspan="4">Parte de IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 March, Germany</td></tr><tr><td colspan="4">Reemplazado por Embed812, cat. # 14120</td></tr></tbody></table>

silenciar a largo plazo de intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un sirna específico a través de liposomas catiónicos. evaluación de efectos desmontables de microscopía electrónica

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Estudios anteriores mostraron que desmontables de ITSN-1s (KD ITSN), una proteína implicada en la regulación endocítica permeabilidad vascular pulmonar y células endoteliales (EC) la supervivencia, la muerte celular apoptótica inducida, un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de cultivo celular con prolongada ITSN-1s inhibición 1. Utilizando liposomas catiónicos como vehículos, exploramos el silenciamiento de genes ITSN-1 en los pulmones de ratones mediante la administración sistémica de siRNA dirigidos ITSN-1 gen (ITSN siRNA). Los liposomas catiónicos ofrecen varias ventajas para la salida del siRNA: caja fuerte con dosificación repetida, no inmunogénico, no tóxico, y fácil de producir 2. Los liposomas rendimiento y la actividad biológica dependen de su tamaño, carga, composición de lípidos, la estabilidad, la dosis y la vía de administración 3 Aquí, eficiente y ITSN KD específica en los pulmones del ratón se ha obtenido mediante una combinación bromuro de amonio y dimetil dioctadecil colesterol. La administración intravenosade ITSN siRNA / complejos de liposomas catiónicos transitoriamente derribaron proteína ITSN-1 y mRNA en los pulmones de ratones en el día 3, que se recuperó después de 3 días adicionales. Tomando ventaja de los liposomas catiónicos como un portador seguro repetible, el estudio extendió durante 24 días. Por lo tanto, el tratamiento retro-orbital con complejos recién generados se administró cada 3 días, induciendo ITSN KD sostenida a lo largo del estudio 4. Tejidos de ratón recogidos en varios puntos de tiempo post-siRNA ITSN fueron sometidos a análisis de microscopía electrónica (EM) para evaluar los efectos de la crónica KD ITSN, en el endotelio pulmonar. De alta resolución de imágenes EM nos permitió evaluar los cambios morfológicos causados ​​por KDITSN en el lecho vascular pulmonar (es decir, la interrupción de la barrera endotelial, disminución del número de caveolae y la regulación positiva de las vías de transporte alternativos), las características no detectables por microscopía de luz. En general estos resultados establecieron un importantetante papel de ITSN-1 en la función de EC y la homeostasis de pulmón, mientras que ilustra la eficacia de la entrega de siRNA-liposomas in vivo.

Los niveles de proteína ITSN-1s y el ARNm se controlaron a varios puntos de tiempo después de siRNA entrega ITSN por Western blot y PCR convencional y cuantitativo como en 4. Los niveles de proteína ITSN-1s y ARNm en siRNA ITSN pulmones tratados con ratón fueron aproximadamente 75% más baja por referencia a los controles durante la caída continua de ITSN-1s durante 21 días. Sin ITSN-1s, dynamin-2, una importante interacción socio de jugador ITSN-1s y esencial en el desprendimiento de cav...

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos del silenciamiento a largo plazo de la expresión de intersectina 1 en la estructura y función de los pulmones de ratón. Esto se logra primero preparando complejos específicos de liposomas dúplex INA para dirigirse a la vasculatura pulmonar de ratón como segundo paso. Los complejos de liposomas INA se administran mediante inyección retroorbital, y este procedimiento se repite cada 72 horas durante 24 días consecutivos para lograr una inhibición eficiente de la expresión de intersectina 1.A continuación, se toma muestra del tejido pulmonar de ratones inyectados para realizar análisis bioquímicos y estudios por microscopía electrónica con el fin de evaluar los niveles de la proteína y del ARNm de intersectina 1 y llevar a cabo análisis morfológicos extensos de los pulmones. Los resultados obtenidos mediante inmunotransferencia de lisados pulmonares con anticuerpos específicos contra la intersectina 1 y mediante análisis de Q-R-T-P-C-R muestran una reducción específica y eficiente de la intersectina 1 durante 24 días consecutivos. La principal ventaja de esta técnica frente a metodologías existentes como los ribozimas

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Biology

Biología

El retículo endoplasmático juega un papel clave en la biogénesis de proteínas y en la homeostasis del calcio. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar el papel de los canales de Ca2 + de fugas y para caracterizar sus mecanismos de regulación putativo. Este sistema consiste en el silenciamiento de genes mediada por siRNA y de células vivas imágenes de Ca2 +.

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Los microRNAs desempeñan un papel crucial en el cerebro y son objetivos potenciales para modelar la neurodegeneración. Sin embargo, perturbar los niveles de miARN es un desafío debido a la corta longitud del miARN y la inaccesibilidad del tejido cerebral. Este video presenta un método para el diseño de antagomir y la administración específica del cerebro utilizando un neuropéptido en ratones.

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB.  La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Inhibición de tejidos específicos microRNA es una tecnología que está poco desarrollada en el campo de microARN. Adjunto, describimos un protocolo para inhibir con éxito la familia de microRNA miR-181 en mioblastos células del corazón. Nanovector tecnología se utiliza para entregar un microRNA esponja que demuestra importantes en vivo cardio-específica miR-181 familia inhibición.

En Vivo Nanovector entrega de una esponja de microARN específicos de corazón

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

Aprende a silenciar ITSN-1s en pulmones de ratones mediante inyecciones retroorbitales repetidas de complejos siRNA/liposomas catiónicos. Este método seguro reduce los niveles de proteína y ARNm en un 75% durante 24 días.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

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