Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos del knockdown a largo plazo, de la intersección de la expresión de uno en la estructura y función de los pulmones de ratón. Esto se logra preparando primero complejos específicos de liposomas dúplex INA para dirigirse a la vasculatura pulmonar del ratón como segundo paso. Los complejos de liposomas INA se administran por inyección retroorbitaria, y esto se repite cada 72 horas durante 24 días consecutivos para lograr una inhibición eficiente de la expresión de una S que se cruza.

A continuación, se toman muestras de tejido pulmonar de ratones inyectados para análisis bioquímicos y encuestas EM con el fin de evaluar la intersección en los niveles de proteínas y ARNm y realizar análisis morfológicos exhaustivos de los pulmones. Los resultados obtenidos por Western blot de lisados pulmonares con intersección específica en un solo anticuerpo y análisis Q-R-T-P-C-R muestran una intersección específica y eficiente en un solo down durante 24 días consecutivos. La principal ventaja de esta técnica sobre la metodología existente como los rymers o los lentivirus, es que la administración pulmonar de liposomas ónicos es reproducible, segura, no tóxica y altamente efectiva en el endotelio pulmonar.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando decidimos evaluar los efectos de la intersección de N in vivo y cuando otros métodos de administración de ARNN no funcionaban. Para preparar liposomas ónicos, agregue 315 microlitros de una solución madre de bromuro de amonio dimetildiod desal, o DOAB, a un matraz de fondo redondo, seguido de 200 microlitros de solución madre de colesterol y 9,5 mililitros de cloroformo mezclados por remolino. Conecte el matraz al conjunto de vapor rotoscópico a 37 grados centígrados y 100 o más rotaciones por minuto.

Abra completamente la primera válvula para el argón girándola en el sentido de las agujas del reloj. Abra y cierre siempre esta válvula. Primero. La segunda válvula controla la presión del argón que sopla en el matraz.

Ábralo parcialmente para asegurar una presión suave. Una vez que el hielo seco comience a gotear sobre el tubo que conecta el tanque de gas Argonne con el vapor roto, baje el vapor rotoscópico en el baño de agua hasta que el matraz toque el agua sin sumergirse por completo. Gire el dial de velocidad hasta 100 a 120 RPM Cuando todo el cloroformo del matraz se haya evaporado, detenga la máquina.

Gire la velocidad del vapor roto, marque a cero y cierre las válvulas del tanque de argón. Retira el flak. Agregue dos mililitros de una solución de glucosa al 5% al matraz para resuspender los lípidos.

Con una punta de pipeta de un mililitro, rasque bien el fondo del matraz para disolver todos los lípidos. Incubar la solución obtenida en un baño de agua a 42 grados centígrados durante una hora mientras se agita lentamente el matraz. Sonicar la solución durante al menos 20 a 30 minutos con el matraz levantado y el fondo apenas tocando el agua fría en el sonicato va.

A continuación, caliente el matraz en el baño de agua del rotovapor durante 20 minutos a 42 grados centígrados a velocidad cero con el fondo redondo sumergido en agua. Filtre los liposomas a través de un filtro de jeringa de 0,47 micras, seguido de un filtro de jeringa de 0,22 micras. Usando un pequeño extrusor, filtre los liposomas a través de una membrana de 50 nanómetros para generar una población homogénea de vesículas liposomas unilaminares.

Transfiera los liposomas a un tubo de einor y colóquelos en hielo. Preparar los complejos de liposomas irna ITSN en una proporción de ocho moles de liposomas por dos microgramos de ARN. En este ejemplo, 50 microlitros de I-A-I-T-S-N.

De una solución madre de 50 micromolares se añade a 100 microlitros de liposomas recién preparados utilizando un tubo EOR libre de A-R-N-A-D-N-A. Mantenga la mezcla en hielo hasta que se inyecte en ratones. Los ratones utilizados en este estudio tienen entre cuatro y seis semanas de edad y pesan alrededor de 25 gramos.

Confirme con el pellizco del dedo del pie que el animal está completamente anestesiado antes de la inyección. Las jeringas utilizadas son jeringas de tuberculina de un mililitro con la aguja unida con una mano. Sostenga las orejas del mouse y gírelo hacia abajo de lado para exponer el ángulo interno del ojo.

Apunte medialmente a los semilunares PIKA y evite tocar el globo ocular. Acérquese al lagrimal del ojo con la jeringa cargada en un ángulo de 45 grados en los tres ejes. Inyecte lentamente la mezcla, devuelva el ratón a su jaula y deje que se recupere con el lado inyectado.

El ratón es tratado con SIR NA dirigido al ITSN un gen cada 72 horas durante 24 días. Para comenzar este procedimiento, verifique que el ratón esté completamente anestesiado por la falta del reflejo de retirada. Comience con una laparotomía y extirpe el diafragma.

A continuación, realice una toracotomía exponiendo los pulmones y el corazón. Retire el timo con un microscopio StereoZoom para una mayor precisión. Cateterizar la arteria pulmonar.

A continuación, realice una traqueotomía e intube al ratón utilizando las traqueostomías. Ajuste el ventilador a una velocidad de 150 golpes por minuto y un volumen de carrera de 150 microlitros. Como salida, abra el trítumo izquierdo con una bomba peristáltica configurada a 1,5 mililitros por minuto y la solución de Hank se calentó a 37 grados centígrados.

Examine la vasculatura pulmonar del ratón libre de sangre durante cinco minutos, seguido de perfusión con el marcador durante 10 minutos. Después de lavar el trazador no unido, realice la fijación in situ de los pulmones mediante una perfusión de 10 minutos de 4% de formaldehído, 2,5% de aldehído gluar y 1% de ácido tánico. Recoger los pulmones y eliminar el exceso de tejido.

Corte los pulmones en bloques pequeños y transfiéralos a un frasco de centelleo etiquetado que contenga dos mililitros de una mezcla fijadora. Comenzar a procesar el tejido pulmonar para microscopía electrónica. En primer lugar, lave los bloques pulmonares con tampón Cate de sodio 0,1 molar brevemente tres veces.

A continuación, fije las muestras en 4% de aldehído y 2,5% de glutaraldehído en tampón de 0,1 pipas durante una hora a temperatura ambiente postfijo con 1% de osmio pilatos durante una hora en el capó sobre hielo en la oscuridad después de enjuagar una vez con tampón de hamburguesas Callen. Incube las muestras en el tampón de hamburguesas Callen durante dos horas o toda la noche a temperatura ambiente. Enjuague una vez en etanol al 50% y luego deshidrate con la serie graduada de etanol.

70%etanol durante cinco minutos, 95%etanol durante cinco minutos y luego dos veces en etanol 100% durante 15 minutos cada uno. Después de eso, cambie a 100% óxido de propileno. Para dos incubaciones de 15 minutos.

Retire el óxido de propileno y agregue una mezcla de 50% de óxido de propileno y 50% de epon. Ocho 12 incuban durante la noche girando en una rueda a temperatura ambiente a la mañana siguiente, retiran la mezcla y añaden epon fresco. Ocho 12 durante al menos cuatro o cinco horas al volante.

Agregue los especímenes seleccionados en moldes cónicos dobles que se llenan hasta la mitad con 100% Epon eight 12 fresco. Colócalos en los bordes, mueve los moldes a una incubadora a 60 grados centígrados y déjalos curar de 48 a 72 horas. La inhibición crónica de la expresión de ITSN one s durante 21 días consecutivos mediante la administración repetida de complejos de liposomas siRNA I TSN one s da como resultado niveles significativamente más bajos de la proteína I TSN one en pulmones de ratón, como se muestra en estos resultados representativos aquí, los lisados pulmonares de un control no tratado y de ratones tratados se eliminaron con anticuerpos contra I TSN one y actina en varios puntos de tiempo después de la administración de irna como se indica.

El análisis demétrico de películas representativas de CL de alta transferencia y R-T-P-C-R cuantitativo del ARNm de I TSN one s confirman aún más que el tratamiento con complejos de liposomas de siRNA I TSN one s regula eficientemente la proteína I TSN one s en pulmones de ratón. La disminución de la intersección en un nivel conduce a una endocitosis deficiente y al transporte endotelial T, a la interrupción de la barrera interendotelial y al edema pulmonar. Estas micrografías electrónicas representativas del tejido pulmonar muestran uniones interendoteliales abiertas o IJ marcadas en toda su longitud por partículas de albúmina de oro de ocho nanómetros.

El panel A uno es una ampliación del panel A, las puntas de flecha apuntan a tres o cuatro partículas de albúmina de oro ubicadas cerca una de la otra en el mismo plano. En indicativo de la amplia apertura de la IEJ. Las partículas de oro también se asocian con la salida abluminal de los IJs indicada por las flechas en los paneles A uno y B.Nótese también el número limitado de CVE A y la dilatación del espacio capilar périco indicada por el asterisco en el panel, una regulación negativa aguda de la intersección en una expresión, vías de transporte alternativas reguladas al alza para compensar la endocitosis deficiente.

Estas imágenes EM muestran anillos membranosos en los paneles A y A, túbulos pleomórficos en el panel B y endosomas agrandados fusionados con cve LA típico en el panel C, activamente involucrados en la absorción y transporte de albúmina de oro. También se observa una dilatación severa del espacio perivascular y edema proteico. La inhibición prolongada de la intersección en una expresión durante 24 días reduce el edema pulmonar en ratones al restaurar parcialmente la integridad de la barrera interendotelial.

Los estudios morfológicos EM mostraron que el trazador de albúmina de oro de ocho nanómetros no pudo penetrar en el IEJ en este punto de tiempo, y en su lugar formó residuos de filtración en el introito luminal de la unión indicada por la punta de flecha. Sin embargo, los espacios perivasculares o PVS mostraron cierta dilatación y edema leve, lo que sugiere que las uniones son impermeables a este tamaño de partículas, pero aún así, los cuerpos multivesiculares permeables o MVB en las proximidades de la membrana plasmática tienen algunas de sus pequeñas vesículas internas marcadas por partículas de albúmina de oro de ocho nanómetros. Esta tabla muestra el número de estructuras transcitológicas endocíticas en el control y el endotelial pulmonar de ratón deficiente.

Un hallazgo significativo es la disminución de calvi, un número en el ITSN un endotelio pulmonar de ratón deficiente. La inhibición crónica de la intersección de la expresión de uno causó la activación de vías citocíticas endocíticas alternativas y parcialmente cavi un número, el número de anillos membranosos o túbulos marcados por partículas de albúmina de oro. En 1944, el endotelio pulmonar de ratón con deficiencia crónica también aumentó 14 veces en comparación con los controles.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Eliza aplicado a un lisado pulmonar de ratón con el fin de estimar cuantitativamente el transporte transendotelial de diferentes trazadores hnic. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo administrar específicamente complejos de liposoma ónico, ARN, al endotelio pulmonar del ratón para eliminar la proteína de interés y evaluar su función.