Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos del silenciamiento a largo plazo de la expresión de intersectina 1 en la estructura y función de los pulmones de ratón. Esto se logra primero preparando complejos específicos de liposomas dúplex INA para dirigirse a la vasculatura pulmonar de ratón como segundo paso. Los complejos de liposomas INA se administran mediante inyección retroorbital, y este procedimiento se repite cada 72 horas durante 24 días consecutivos para lograr una inhibición eficiente de la expresión de intersectina 1.

A continuación, se toma muestra del tejido pulmonar de ratones inyectados para realizar análisis bioquímicos y estudios por microscopía electrónica con el fin de evaluar los niveles de la proteína y del ARNm de intersectina 1 y llevar a cabo análisis morfológicos extensos de los pulmones. Los resultados obtenidos mediante inmunotransferencia de lisados pulmonares con anticuerpos específicos contra la intersectina 1 y mediante análisis de Q-R-T-P-C-R muestran una reducción específica y eficiente de la intersectina 1 durante 24 días consecutivos. La principal ventaja de esta técnica frente a metodologías existentes como los ribozimas o los lentivirus es que la administración pulmonar de liposomas catiónicos es reproducible, segura, no tóxica y altamente eficaz en el endotelio pulmonar.

La idea de este método surgió cuando decidimos evaluar los efectos de la intersección de N hacia abajo in vivo y cuando otros métodos de administración de ARN de interferencia no funcionaron. Para preparar liposomas ónicos, agregue 315 microlitros de una solución stock de bromuro de dimetil diodo desal amonio, o DOAB, a un matraz de fondo redondo, seguido de 200 microlitros de solución stock de colesterol y 9,5 mililitros de cloroformo mezclados mediante agitación suave. Conecte el matraz al rotovapor establecido a 37 grados Celsius y 100 o más rotaciones por minuto.

Abra completamente la primera válvula del argón girándola en sentido horario. Siempre abra y cierre esta válvula primero. La segunda válvula controla la presión del argón que fluye hacia el matraz.

Ábralo parcialmente para garantizar una presión suave. Una vez que el hielo seco comience a gotear sobre el tubo que conecta el tanque de gas de Argonne con el evaporador rotatorio, baje el evaporador rotatorio hasta el baño de agua hasta que el matraz toque el agua sin quedar completamente sumergido. Gire el regulador de velocidad hasta 100 a 120 RPM. Cuando todo el cloroformo en el matraz haya evaporado, detenga la máquina.

Gire la velocidad del rotoevaporador a cero y cierre las válvulas del tanque de argón. Retire el matraz. Añada dos mililitros de una solución de glucosa al 5 % al matraz para resuspender los lípidos.

Utilizando una punta de pipeta de un mililitro, rasque completamente el fondo del matraz para disolver todos los lípidos. Incube la solución obtenida en un baño de agua a 42 grados Celsius durante una hora, agitando lentamente el matraz en vórtex. Soneque la solución durante al menos 20 a 30 minutos, sosteniendo el matraz en posición vertical y con el fondo apenas tocando el agua fría en el baño de ultrasonidos.

A continuación, caliente el matraz en el baño de agua del rotovapor durante 20 minutos a 42 grados Celsius y velocidad cero, con el fondo redondo sumergido en el agua. Filtre los liposomas a través de un filtro de jeringa de 0,47 micrómetros, seguido de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Utilizando un extrusor pequeño, filtre los liposomas a través de una membrana de 50 nanómetros para generar una población homogénea de vesículas liposomales unilamelares.

Transfiera los liposomas a un tubo eppendorf y colóquelos en hielo. Prepare los complejos de ARNi con liposomas en una proporción de ocho moles de liposomas por dos microgramos de ARN. En este ejemplo, 50 microlitros de I-A-I-T-S-N.

A partir de una solución stock de 50 micromolares, se añade a 100 microlitros de liposomas recién preparados utilizando un tubo EOR libre de A-R-N-A-D-N-A. Mantenga la mezcla en hielo hasta la inyección en los ratones. Los ratones utilizados en este estudio tienen entre cuatro y seis semanas de edad y pesan aproximadamente 25 gramos.

Confirme con un pellizco en el dedo del pie que el animal está completamente anestesiado antes de la inyección. Las jeringas utilizadas son jeringas tuberculínicas de un mililitro con la aguja fijada con una mano. Sujete las orejas del ratón y coloque al ratón de lado para exponer el ángulo interno del ojo.

Apunte medialmente hacia los semilunares de PIKA y evite tocar el globo ocular. Acérquese al carúnculo lagrimal del ojo con la jeringa cargada en un ángulo de 45 grados en los tres ejes. Inyecte lentamente la mezcla, devuelva el ratón a su jaula y permita que se recupere con el lado inyectado hacia arriba.

Arriba. El ratón se trata con SIR NA dirigido al gen ITSN uno cada 72 horas durante 24 días. Para comenzar este procedimiento, verifique que el ratón esté completamente anestesiado mediante la ausencia del reflejo de retirada. Comience con una laparotomía y extirpe el diafragma.

Luego realice una toracotomía para exponer los pulmones y el corazón. Retire el timo utilizando un microscopio StereoZoom para mayor precisión. Canule la arteria pulmonar.

A continuación, realice una traqueostomía e intubule el ratón utilizando el estoma traqueal. Configure el ventilador a una frecuencia de 150 movimientos por minuto y un volumen corriente de 150 microlitros. Como salida, abra la aurícula izquierda utilizando una bomba peristáltica ajustada a 1,5 mililitros por minuto y solución de Hank's calentada a 37 grados Celsius.

Recorra la vasculatura pulmonar de ratón libre de sangre durante cinco minutos, seguido de una perfusión con el trazador durante 10 minutos. Después de eliminar el trazador no unido, realice la fijación *in situ* de los pulmones mediante una perfusión de 10 minutos con formaldehído al 4 %, glutaraldehído al 2,5 % y ácido tánico al 1 %. Recoja los pulmones y elimine el tejido excesivo.

Corte los pulmones en pequeños bloques y transfiéralos a un frasco de centelleo etiquetado que contenga dos mililitros de una mezcla fijadora. Para comenzar el procesamiento del tejido pulmonar para microscopía electrónica, primero lave los bloques pulmonares brevemente tres veces en tampón de citato de sodio 0,1 molar.

A continuación, fije los especímenes en aldehído al 4% y glutaraldehído al 2,5% en tampón 0,1 M de piperacina (Pipee) durante una hora a temperatura ambiente. Postfije con osmio al 1% durante una hora en la campana, sobre hielo y en la oscuridad, tras un enjuague con tampón de Callen burger. Incube los especímenes en tampón de Callen burger durante dos horas hasta toda la noche a temperatura ambiente. Enjuague una vez con etanol al 50% y luego deshidrate con una serie graduada de etanol.

Etileno al 70 % durante cinco minutos, etanol al 95 % durante cinco minutos y luego dos veces en etanol al 100 % durante 15 minutos cada vez. Después, cambiar a óxido de propileno al 100 %. Dos incubaciones de 15 minutos cada una.

Retire el óxido de propileno y agregue una mezcla de 50% de óxido de propileno y 50% de epon. Incube durante la noche con rotación en una rueda a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, retire la mezcla y agregue epon fresco. Incube durante al menos cuatro a cinco horas en la rueda.

Agregue los especímenes seleccionados a moldes doblemente cónicos que estén llenos hasta la mitad con Epon 100 % fresco ocho 12. Colóquelos en los bordes, mueva los moldes a un incubador a 60 grados Celsius y deje que cure durante 48 a 72 horas. La inhibición crónica de la expresión de ITSN uno s durante 21 días consecutivos mediante la administración repetida de complejos de liposomas de siRNA de I TSN uno s da como resultado niveles significativamente más bajos de la proteína I TSN uno en pulmones de ratón, como se muestra en estos resultados representativos aquí; lisados pulmonares de un control no tratado y de ratones tratados se inmunotransfirieron con anticuerpos contra I TSN uno y actina en varios puntos temporales posteriores a la administración de irna, según se indica.

El análisis densitométrico de películas representativas de inmunoensayos de alta señal para CL y la R-T-P-C-R cuantitativa del ARNm de I TSN one s confirman además que el tratamiento con complejos de liposomas de ARNip para I TSN one s reduce eficazmente la proteína I TSN one s en pulmones de ratón. La disminución en los niveles de intersectina uno conduce a una endocitosis deficiente, a la alteración del transporte endotelial, a la ruptura de la barrera interendotelial y al edema pulmonar. Estas micrografías electrónicas representativas de tejido pulmonar muestran uniones interendoteliales abiertas, o IJs, marcadas a lo largo de su longitud por partículas de albúmina marcadas con oro de ocho nanómetros.

El panel A uno es una ampliación del panel A; las puntas de flecha indican tres o cuatro partículas de albúmina marcadas con oro situadas cerca unas de otras en el mismo plano, lo que sugiere una abertura amplia del IEJ. También se observan partículas de oro asociadas a la salida abluminal de las IJ, indicada por las flechas en los paneles A uno y B. Nótese asimismo el número limitado de CVE A y la dilatación del espacio pericapilar indicada por el asterisco en el panel, un descenso agudo de la expresión de intersectina, y la activación de vías de transporte alternativas para compensar la endocitosis deficiente.

Estas imágenes de ME muestran anillos membranosos en los paneles A y A', túbulos pleomórficos en el panel B y endosomas agrandados fusionados con cve LA típicas en el panel C, que participan activamente en la captación y el transporte de albúmina marcada con oro. También se observa una marcada dilatación del espacio perivascular y un edema proteínaceo. La inhibición prolongada de la expresión de intersectina durante 24 días reduce el edema pulmonar en ratones al restaurar parcialmente la integridad de la barrera interendotelial.

Los estudios morfológicos por microscopía electrónica mostraron que el trazador de albúmina con oro de ocho nanómetros no pudo atravesar la IEJ en este punto temporal, y en cambio formó residuos de filtración en la entrada luminal de la unión, indicados por la flecha. Sin embargo, los espacios perivasculares o PVS mostraron cierta dilatación y edema leve, lo que sugiere que las uniones son impermeables a partículas de este tamaño, pero aún así presentan cuerpos multivesiculares o MVB permeables en estrecha proximidad a la membrana plasmática, algunos de cuyos pequeños vesículos internos están marcados con partículas de albúmina con oro de ocho nanómetros. Esta tabla muestra el número de estructuras endocíticas trans-cito en el endotelio pulmonar de ratones control y deficientes.

Un hallazgo significativo es la disminución de caveolas en el endotelio pulmonar de ratones deficientes en ITSN1. La inhibición crónica de la expresión de intersectina 1 provocó la activación de vías citoplasmáticas endocíticas alternativas y una reducción parcial del número de caveolas, así como del número de anillos membranosos o túbulos marcados por partículas de albúmina dorada. En el endotelio pulmonar de ratones deficientes crónicamente en ITPN1, el número de caveolas también aumentó 14 veces en comparación con los controles.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la aplicación de lisados de pulmón de ratón mediante Eliza, con el fin de estimar cuantitativamente el transporte transendotelial de diferentes trazadores hnic. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo entregar específicamente complejos de liposomas ónicos y SRNA al endotelio pulmonar de ratón para silenciar la proteína de interés y evaluar su función.