GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

El objetivo general del siguiente experimento es obtener una proteína de longitud completa altamente purificada de interés. Esto se logra mediante la producción de un virus bao recombinante, que se utiliza para infectar células de insecto SF nueve con el fin de obtener una versión altamente expresada y soluble de la proteína de interés. A continuación, se lleva a cabo una purificación de afinidad en dos etapas, caracterizada por la purificación de glutatión, proteína marcada con seros, seguida de cromatografía de afinidad de metales.

El resultado de la purificación es una proteína marcada con histidina de alta pureza. A continuación, las muestras de proteínas purificadas se dializan para garantizar bajas concentraciones de sal en el tampón de almacenamiento. Se obtienen resultados que muestran la expresión solubilidad, cantidad y calidad de la proteína a partir de la tinción de proteína entera de un gel de página SDS.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando tuvimos problemas para purificar proteínas grandes e inestables como PAL B dos y BOC dos. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la purificación de afinidad en un solo paso, es que en nuestro protocolo de purificación de afinidad en dos pasos, la proteína obtenida es altamente pura y generalmente libre de productos de degradación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de proteínas, como las funciones bioquímicas de las proteínas recombinantes purificadas.

Este protocolo comienza con la producción del virus bao recombinante, seguido de la selección del virus BA más eficiente, tal como se describe en el protocolo de texto para la infección. Prepare un recipiente de cultivo giratorio que contenga entre 0,75 y 1,0 veces 10 por las seis células SF nueve en 500 mililitros de medio con una proporción de uno a 150 entre el virus y el medio. Coloque el spinner debajo de una campana de cultivo celular e infecte las células agregando el volumen necesario de suspensión del virus baula en la suspensión celular a través de un brazo del spinner.

Deje que las células infectadas crezcan en suspensión a 27 grados centígrados y coseche las células cuando se alcance la máxima expresión proteica, que se determina al elegir el virus macular más eficiente. Después de recolectar las células, nueve células SF que expresan la proteína de interés en aproximadamente 20 mililitros de tampón de unión a GST, suplementadas con inhibidores de la proteasa en un baño de agua helada. Bajar la solución 20 veces con un homogeneizador descendente, luego sonicar durante tres ciclos 32 antes de volver a bailar 20 veces a continuación, centrifugar el lisado celular a 18.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y mantener el sobrenadante, incubar el lisado celular soluble con un mililitro de perlas GST prelavadas durante una hora a cuatro grados Celsius bajo una rotación suave.

El tiempo de incubación debe optimizarse de acuerdo con la estabilidad del pro y la eficiencia de unión después de la unión. Centrifugado rápido a 700 RPM y elimine el sobrenadante que contiene proteínas no unidas. Lave las proteínas unidas a GST con tampón de lavado GST.

Repite este proceso dos veces después del último lavado. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante. A continuación, incubar las perlas con cinco milimolares A TP y 15 milimolares de cloruro de magnesio en 10 mililitros de tampón de unión a GST durante una hora a cuatro grados centígrados para evitar la unión inespecífica de las proteínas de choque térmico después de la incubación.

Lave las cuentas tres veces con tampón de lavado GST. Después de centrifugar las perlas de GST y eliminar el sobrenadante, lave las perlas de GST con tampón P five. A continuación, divida las perlas de GST, infracciones de 100 microlitros y agregue de cuatro a ocho unidades de enzima de precisión diluida en 100 microlitros de tampón P cinco.

Incube las perlas de GST con enzima durante tres horas o toda la noche a cuatro grados centígrados bajo una rotación suave. El tiempo de incubación debe optimizarse de acuerdo con el peso molecular, así como con la estabilidad de la proteína después de la escisión. Gira rápidamente y recoge el sobrenadante.

Agregue 100 microlitros de tampón P cinco a las cuentas. A continuación, repita, gire y recoja el sobrenadante dos veces. Tira de todas las fracciones.

Divida el EIT en tres fracciones de un mililitro e incube cada una con 100 microlitros de perlas secas de resina de afinidad metálica talon prelavadas durante una hora en rotación, dividiendo la elución en varias fracciones, aumentando la eficiencia de unión y lavado. A continuación, lavar la resina durante cinco minutos con tampón P 30 a cuatro grados centígrados con una rotación suave. Después de repetir el lavado dos veces, tire de las perlas en un solo tubo para eluir la proteína purificada.

Añada tampón P 500 a la resina de garra unida a proteínas. Agregue una relación de búfer a cordón de volumen de uno a uno. Volumen. Incubar la suspensión durante cinco minutos en rotación.

Repita este paso dos veces. Mantener cada fracción eludida separada para el almacenamiento de la proteína purificada. Diálisis la proteína contra un tampón de almacenamiento adecuado dos veces durante una hora a cuatro grados centígrados bajo agitación.

Es importante comprobar la precipitación de la proteína purificada durante la diálisis. Haga pequeñas alícuotas de la proteína purificada y congele en hielo seco durante 30 minutos. Almacene las alícuotas a menos 80 grados centígrados y evite muchos ciclos de congelación de descongelación.

Analice el proceso de purificación cargando aproximadamente de 20 a 40 microlitros de cada fracción en un gel de página SDS. Después de ejecutar la tinción en gel con azul de kumasi o tinción de proteínas para su visualización, los lisados celulares solubles y totales de células SF nueve infectadas con el virus valo recombinante REC 14 o simuladas infectadas como control se analizaron mediante tinción con azul de Kumasi, lo que permitió confirmar la expresión de la proteína GST re 14 his durante el proceso de purificación. Se analizaron muchas muestras para seguir la eficiencia del método de análisis de estas muestras por kumasi Blue.

La tinción muestra que durante el primer paso de purificación, GST Rec 14 se unió correctamente a las perlas de GST con un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kilodaltons debido a la fusión de rec 14 con GST después de la escisión de precisión con G-S-T-G-S-T, el silbido libre de rec 14 migra alrededor de 37 kilodaltons. Si bien el GST escindido se puede visualizar en las cuentas del GST, a pesar de que una parte del REC 14 libre de GST aún permanecía unida a las cuentas del GST, se logró un enriquecimiento notable del silbido del REC 14. Este paso podría mejorarse aumentando el tiempo de incubación de la proteína con un análisis de proteasa de precisión del silbido de REC 14 unido a las perlas de Talon en comparación con las proteínas aludidas después del paso de purificación de GST muestra que una gran fracción del silbido de REC 14 está unido a las perlas de garra.

Después de varios lavados, se eludió y se recogió el silbido de REC 14, se realizaron tres ilusiones. El análisis reveló una alta pureza de silbido rec 14 y la mayor concentración de silbido rec 14 en la primera comparación elluciana de fracciones eludidas con las cuentas de garra después de que Ellucian ilustra la eficiencia de la ilusión. Dado que poco rec 14 silbido se puede detectar como ligado en las cuentas.

Estas muestras también se sometieron a análisis de sangre occidentales con anticuerpos anti GST y anti hiss para seguir REC 14. A lo largo del procedimiento, la transferencia anti GST muestra que algunas GS TRE 14 y GST solas estaban presentes en las proteínas aludidas de la etapa de purificación de GST y que los contaminantes se eliminaron mediante la etapa de purificación de afinidad de la etiqueta silbada. Esta mancha revela que el GST se había eliminado eficazmente de re 14 mediante el tratamiento de precisión y el paso de purificación de silbido ttag.

El anti silbido tiene como objetivo detectar re 14. Esta mancha confirma que el silbido de GST Rec 14 y el silbido de REC 14 no se escindieron ni eliminaron completamente de las cuentas de GST. Además, a una alta concentración, REC 14 parece agregarse.

En resumen, los resultados presentados demuestran la eficiencia de la purificación de GST para la purificación de S palm B rec 14. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo recuperar una energía altamente embellecida. Proteína combinante Una vez dominada.

Esta técnica se puede realizar en 12 horas después de la degeneración del ácido soluble si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápida y estrictamente a cuatro grados centígrados para evitar la degradación de las proteínas después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de precipitación de código o la espectrometría de masas, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de proteínas asociadas o la modificación postraduccional de la proteína de interés.

Aunque utilizamos este método para el ADN, las proteínas de reparación podrían modificarse para estudiar la función de las proteínas en otras áreas de investigación.