GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

El objetivo general del siguiente experimento es obtener una proteína de interés altamente purificada y de longitud completa. Esto se logra produciendo un baculovirus recombinante, que se utiliza para infectar células de insecto SF9 con el fin de obtener una versión soluble y altamente expresada de la proteína de interés con dos marcadores. Luego se realiza una purificación por afinidad en dos pasos, caracterizada por la purificación de la proteína marcada con glutatión S-transferasa, seguida de cromatografía de afinidad por metales.

El resultado de la purificación es una proteína con etiqueta de histidina altamente pura. A continuación, las muestras de proteína purificadas se dializan para garantizar bajas concentraciones de sal en el tampón de almacenamiento. Los resultados obtenidos muestran la solubilidad de la expresión, la cantidad y la calidad de la proteína, basados en la tinción total de proteínas en un gel SDS-PAGE.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando tuvimos dificultades para purificar proteínas grandes e inestables, como PAL B dos y BOC dos. Por lo tanto, la ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la purificación de afinidad en un solo paso es que, en nuestro protocolo de purificación de afinidad en dos pasos, la proteína obtenida es altamente pura y generalmente libre de productos de degradación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de proteínas, como las funciones bioquímicas de proteínas recombinantes purificadas.

Este protocolo comienza con la producción del virus recombinante bao, seguido de la selección del virus BA más eficiente según se describe en el protocolo escrito para la infección. Prepare un recipiente de cultivo con agitador que contenga entre 0,75 y 1,0 × 10⁶ células SF9 en 500 mililitros de medio, con una relación de uno a 150 entre el virus y el medio. Coloque el agitador bajo una campana de cultivo celular e infecte las células agregando el volumen necesario de suspensión del virus baula en la suspensión celular a través de uno de los brazos del agitador.

Deje crecer las células infectadas en suspensión a 27 grados Celsius y recoga las células cuando se alcance la expresión máxima de la proteína, lo cual se determina al elegir el virus macular más eficiente. Después de recolectar las células, lisee las células SF9 que expresan la proteína de interés en aproximadamente 20 mililitros de tampón de unión GST, suplementado con inhibidores de proteasas en un baño de hielo y agua. Homogenice la solución 20 veces con un homogenizador Dounce, luego sométala a sonicación durante tres ciclos de 32 segundos y a continuación homogenícela nuevamente 20 veces. A continuación, centrifugue el lisado celular a 18.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y conserve el sobrenadante. Incube el lisado celular soluble con un mililitro de perlas de GST previamente lavadas durante una hora a cuatro grados Celsius con rotación suave.

El tiempo de incubación debe optimizarse según la estabilidad del precursor y la eficiencia de unión tras la fijación. Centrifugar brevemente a 700 RPM y eliminar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas. Lavar las proteínas unidas a GST con tampón de lavado para GST.

Repita este proceso dos veces tras el último lavado. Retire tanto sobrenadante como sea posible. A continuación, incube las perlas con cinco milimoles de ATP y cloruro de magnesio 15 milimolar en 10 mililitros de tampón de unión GST durante una hora a cuatro grados Celsius para evitar la unión no específica de proteínas de choque térmico tras la incubación.

Lave las perlas tres veces con tampón de lavado de GST. Después de centrifugar las perlas de GST y eliminar el sobrenadante, lave las perlas de GST con tampón P cinco. A continuación, divida las perlas de GST en fracciones de 100 microlitros y agregue cuatro a ocho unidades de enzima de precisión diluidas en 100 microlitros de tampón P cinco.

Incube las perlas de GST con la enzima durante tres horas hasta toda la noche a cuatro grados Celsius con rotación suave. El tiempo de incubación debe optimizarse según el peso molecular y la estabilidad de la proteína tras el corte. Centrifugue brevemente y recoja el sobrenadante.

Agregue 100 microlitros de tampón P cinco a las perlas. Luego repita, centrifugue y recopile el sobrenadante dos veces. Recupere todas las fracciones.

Divida el EIT en tres fracciones de un mililitro e incube cada una con 100 microlitros de perlas secas de resina de afinidad metálica Talon previamente lavadas durante una hora con rotación, dividiendo la elución en varias fracciones, lo que aumenta la eficiencia de unión y lavado. Luego, lave la resina durante cinco minutos con tampón P 30 a cuatro grados Celsius con rotación suave. Después de repetir el lavado dos veces, reúna las perlas en un único tubo para eluir la proteína purificada.

Añada el tampón P 500 a la resina TALON con proteína unida. Añada un tampón en una relación volumen a volumen de uno a uno. Incube la suspensión durante cinco minutos con rotación.

Repita este paso dos veces. Mantenga cada fracción eluida separada para el almacenamiento de la proteína purificada. Dialice la proteína frente a un tampón de almacenamiento apropiado dos veces durante una hora a cuatro grados Celsius bajo agitación.

Es importante verificar la precipitación de la proteína purificada durante la diálisis. Prepare alícuotas pequeñas de la proteína purificada y congélelas en hielo seco durante 30 minutos. Almacene las alícuotas a menos 80 grados Celsius y evite múltiples ciclos de descongelación y congelación.

Analice el proceso de purificación cargando aproximadamente de 20 a 40 microlitros de cada fracción en un gel de electroforesis SDS-PAGE. Después de correr el gel, tiéndalo con azul de Kumasi u otro colorante para proteínas para su visualización. Los lisados celulares solubles y totales procedentes de células SF9 infectadas con el virus valo recombinante REC14 o infectadas simuladamente como control, se analizaron mediante tinción con azul de Kumasi, lo que permitió confirmar la expresión de la proteína GST-RE14-His durante el proceso de purificación. Se analizaron muchas muestras para seguir la eficiencia del método, mediante el análisis de estas muestras con azul de Kumasi.

La tinción muestra que durante el primer paso de purificación, GST Rec 14 se unió correctamente a las perlas de GST con un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kilodaltonos debido a la fusión de rec 14 con GST tras la escisión de precisión con G-S-T-G-S-T, mientras que el rec 14 hiss libre migra alrededor de 37 kilodaltonos. Aunque la GST escindida puede visualizarse en las perlas de GST, a pesar de una fracción de GST libre de REC 14 que aún permaneció unida a las perlas de GST, se logró un enriquecimiento notable de REC 14 hiss. Este paso podría mejorarse aumentando el tiempo de incubación de la proteína con la proteasa de precisión. El análisis de REC 14 hiss unido a perlas Talon en comparación con las proteínas eluidas tras el paso de purificación de GST muestra que una fracción considerable de REC 14 hiss se une a las perlas Talon.

Después de varios lavados, se eluyó y recogió el rec 14 hiss, y se realizaron tres ilusiones. El análisis reveló una alta pureza del rec 14 hiss y la mayor concentración de rec 14 hiss en la primera comparación de fracciones eluidas con las perlas de talón tras la ilustración de la eficiencia de la ilusión mediante Ellucian. Dado que apenas se puede detectar rec 14 hiss unido a las perlas.

Estas muestras también se sometieron a un análisis sanguíneo por Western con anticuerpos anti-GST y anti-hiss para seguir el seguimiento de REC 14. A lo largo del procedimiento, el revelado con anti-GST muestra que algunas GS TRE 14 y GST solo estaban presentes en las proteínas mencionadas procedentes del paso de purificación GST, y que los contaminantes fueron eliminados mediante el paso de purificación por afinidad con la etiqueta hiss. Este revelado revela que GST había sido eficientemente eliminado de re 14 mediante el tratamiento de precisión y el paso de purificación con la etiqueta hiss.

La prueba antirruído tiene como objetivo detectar re 14. Esta prueba confirma que GST Rec 14 hiss y REC 14 hiss no fueron completamente escindidos ni eliminados de las perlas de GST. Además, a una alta concentración, REC 14 parece agregarse.

En resumen, los resultados presentados demuestran la eficiencia de la purificación por GST hiss para la purificación de S palm B rec 14. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar una proteína recombinante altamente purificada. Una vez dominado.

Esta técnica puede realizarse en 12 horas tras la degeneración del ácido ly soluble si se lleva a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente y estrictamente a cuatro grados Celsius para evitar la degradación de proteínas tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como ensayos de precipitación por coprecipitación o espectrometría de masas, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, tales como la identificación de proteínas asociadas o las modificaciones postraduccionales de la proteína de interés.

Aunque utilizamos este método para ADN, la estrategia de proteínas de reparación podría modificarse para estudiar la función de proteínas en otras áreas de investigación.