Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Generar macrófagos derivados de la médula ósea para el análisis de polarización. Los huesos del fémur y la tibia se aíslan de ratones y se recogen las células de la médula ósea. A continuación, las células se cultivan en un medio que contiene factores de crecimiento para inducir la formación de macrófagos.

Después de siete días de cultivo, los macrófagos derivados de la médula ósea se tratan con diversos estímulos y macrófagos polarizados. Las respuestas de activación se analizan mediante citometría de flujo, PCR en tiempo real y se obtienen los resultados del análisis blos de Western que muestran una alta pureza de macrófagos derivados de la médula ósea con respuestas de activación polarizadas a M1 o M dos. Los estímulos mienten.

La implicación de esta técnica es la orientación hacia la terapia o el diagnóstico de la diversidad de enfermedades asociadas, incluida la resistencia a la insulina y las CRO, ya que los macrófagos infiltrantes T son un actor importante en este contexto, la demostración visual de este método es fundamental ya que la aceleración de las células de la médula ósea es algo difícil y el rendimiento es crítico para obtener una preparación celular de estudio suficiente para inducir la formación de macrófagos trabajando en una campana estéril. Comience este protocolo con huesos de fémur y tibia aislados de ratones de seis a ocho semanas de edad en una placa de cultivo de tejidos. Enjuague los huesos en PBS y luego use unas tijeras para cortar ambos extremos de los huesos, teniendo cuidado de no quitar demasiado mientras sostiene el hueso con pinzas.

Inserte una aguja de calibre 21 en 23 con una jeringa de 10 mililitros que contenga PBS frío con FBS activado al 2% de calentamiento en un extremo del hueso. Presione el émbolo para enjuagar la médula y colocarla en una nueva placa de cultivo de tejidos. A continuación, pase la médula a través de la misma aguja de cuatro a seis veces para disociar las células.

Luego, vierta las células en un colador de células de 70 micras para eliminar los grupos de células, el hueso, el cabello y otras células o tejidos. Recoja el flujo en un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez que la solución haya pasado a través del filtro, agregue tres volúmenes de cloruro de amonio al 0,8% al flujo e incube en hielo durante 10 minutos.

Para eliminar los glóbulos rojos después de la incubación, gire las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, vuelva a suspender el pellet de celda en 20 a 50 mililitros de PBS frío con 2% FBS. Cuente las células con un hemocitómetro.

Gire las celdas a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de verter el supinado. Proceda a inducir la formación de BMDM como se describe en la siguiente sección del protocolo Para inducir la formación de BMDM Resus, suspenda las células aisladas de la médula ósea en un medio de crecimiento de BMDM a una concentración de dos veces.

Centre las seis células por mililitro de semilla una o dos veces 10 a las seis células de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis o 12 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados. La siembra a esta concentración facilitará el desprendimiento para la citometría de flujo después de tres días. Cambie a un medio de crecimiento BMDM fresco el día siete.

La formación de DMO madura se evalúa mediante análisis de citometría de flujo y anticuerpos conjugados con fluorol para detectar células que expresan CD, 11, B y F, cuatro, 80. Después de verificar la formación de BMDM maduro, el cambio a fresco es el medio de eco do modificado de Cove con 10% de FBS y LPS o LPS e interferón gamma para la activación de M1 o IL cuatro o IL 13 para la activación de M dos. Incubar las células a 37 grados centígrados después de 24 horas.

Recoja los m MDM estimulados separándolos de la placa. Para ello, retira el medio de las células y lávate con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, añada tripsina tibia al 0,05% que contenga 0,48 milimolares, EDTA incube a 37 grados centígrados durante no más de 10 minutos para evitar la pérdida de proteínas de superficie debido a la digestión excesiva.

A continuación, lave las células dos veces con PBS que contenga un 10% de FBS y transfiéralas a tubos de muestra de 1,2 mililitros. Utilice anticuerpos para detectar la expresión de antígenos de superficie celular, incluidos CD 11, BF, cuatro, 80, CD, 11, C, CD, 2, 0, 6, CD, 69, CD, 80 o CD 86 en varios puntos temporales. Uso de procedimientos estándar de tinción por citometría de flujo mediante PCR cuantitativa.

Determinar los niveles de expresión de IL uno, beta, TNF, alfa e IL seis para evaluar la activación de M1 o IL 10, IL 13, arginasa uno y PPAR gamma para evaluar la activación de M dos. Por último, realizar Western blot para evaluar la activación de las vías de señalización celular implicadas en la activación de los macrófagos M1 o M dos para evaluar la pureza de la BMDM madura. Después de la inducción, se realizó un análisis citométrico de flujo utilizando anticuerpos contra CD 11 BF 4 80, CD 11 C y CD 2 0 6 B. Los MDM se comprimieron primero en FSC y SSC para eliminar DRI y conjugados.

Los MDMs maduros b se definieron como CD 11 B positivo F 4 80 subpoblaciones positivas, que se observan en la parte superior derecha de este gráfico y comprometieron del 95 al 99% de la población cerrada para evaluar la polarización de los macrófagos. Se realizaron análisis adicionales. La primera compuerta se realizó para identificar los macrófagos infiltrados en el tejido, que son CD, 11 B positivo, F y 80 células positivas.

Entre ellos, los macrófagos M1, que son CD 11 C positivos y CD 2 0 6 negativos, aparecen en el cuadrante dos, mientras que los macrófagos M dos, que son CD 11 C negativos y CD 2 0 6 positivos, aparecen en el cuadrante cuatro. Para evaluar la activación de los macrófagos, las células se incubaron con LPS para inducir la activación de M1 o IL cuatro para la activación de M dos. Tras la activación, el tamaño de los macrófagos aumentó, como lo demuestra el cambio de FSCA de M1 o M dos macrófagos a las 24 horas después de la estimulación en comparación con M cero sin tratar.

También se analizaron los marcadores de superficie relacionados con la activación de macrófagos después de la estimulación. Los marcadores de respuesta temprana CD 69 se evaluaron cinco o 24 horas después de la estimulación, los marcadores CD 80 y CD 86 se analizaron a las 48 horas después de la estimulación. Como se muestra aquí, se observó un aumento de la abundancia de CD 69, CD 80 y CD 86 de superficie en macrófagos estimulados para evaluar la activación clásica y alternativa de los macrófagos.

Se recogieron los estimulados con LPS o IL cuatro durante 24 horas y se extrajo el ARN total para su análisis mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se muestra aquí. Se detectó una expresión elevada de arginasa one y PPAR gamma en macrófagos M dos en comparación con la expresión de macrófagos no tratados de citocinas proinflamatorias. En el análisis de Western blot, como se muestra aquí, se utilizaron interleucina una beta TNF alfa aumentada en macrófagos M1 para evaluar la activación de la vía NF kappa B por anticuerpos LPS contra P 65 y P 65 relacionados con fosfo.

Se observa una banda más fuerte contra el P 65 fosforilado con el tratamiento con LPS. En conjunto, estos datos indican macrófagos derivados de la médula ósea con respuestas de activación polarizadas a estímulos M1 o M dos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar macrófagos derivados de la médula ósea, seguido de un análisis de activación polarizada.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar evaluar la pureza de los macrófagos diferenciados antes de probar su respuesta. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un método como la transfección transitoria de genes o SHRA para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo están involucrados los genes en la regulación de la activación de macrófagos?