Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

El objetivo general del siguiente experimento es detectar el virus de la influenza A utilizando un chip microfluídico. Primero, haga pasar la muestra con tampón de lisis a través del canal de SPE para lisar el virus y extraer el ARN; cargue el reactivo de RT-PCR con el ARN extraído y haga pasar la muestra a través del canal de transcripción inversa para convertir el ARN viral en ADNc. A continuación, haga pasar la mezcla al canal de PCR con el fin de amplificar el ADN. Los resultados obtenidos muestran el tamaño y la concentración del amplicón en función de la señal de fluorescencia proveniente de la electroforesis capilar.

La principal ventaja de esta tecnología es que acepta la muestra directa del paciente e integra la extracción, purificación, transcripción inversa y amplificación de ácidos nucleicos en un solo chip. Para crear dos placas, distribuya aproximadamente nueve gramos de gránulos XN X uniformemente en el centro de una placa metálica, coloque en una prensa calentada a 198 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, aplique presión lentamente hasta alcanzar 2,500 PSI durante otros cinco minutos. A continuación, coloque una placa sobre el molde de epoxi precalentado a 157 grados Celsius durante 10 minutos, y aplique presión lentamente hasta alcanzar 1000 PSI durante otros 10 minutos.

A continuación, utilizando guantes térmicos, retire la placa y el molde de la prensa caliente y luego extraiga la placa del molde antes de que se enfríe. Taladre tres orificios en el chip grabado, uno en la entrada, otro en el puerto de desecho y un tercero en la salida del canal microfluídico. Luego lave los chips con IPA, seguido de RNAs away y agua dianna's.

Seque las placas con aire para unirlas; primero precálente a 131 grados Celsius durante 10 minutos y luego presione a 350 PSI durante otros 10 minutos. Utilizando epoxi JB Weld, fije los nanoconectores por separado en los puertos de entrada, desecho y salida, y deje curar entre 15 y 24 horas. Según las instrucciones del fabricante, enjuague el canal de SPE con 50 microlitros de RNAs away seguidos de 100 microlitros de agua libre de nucleasas.

Ahora cargue el canal de SPE con cuatro microlitros de solución de inmovilización recién preparada para reticular la incubación de metacrilato durante 10 minutos en un horno de luz UV; elimine la solución de inmovilización residual mediante vacío. Desagregue el pellet seco de microesferas golpeando suavemente el tubo con la tapa cerrada. A continuación, añada 100 microlitros de solución fresca preparada para columna de SPE y vortexee para homogeneizar.

Cargue cuatro microlitros de la solución de SPE en el mismo canal y realice un entrecruzamiento por irradiación UV durante 2,5 minutos por cada lado, obteniendo una columna de SPE polimerizada de color blanco opaco. Lave el canal con 500 microlitros de metanol al 100 % para eliminar los reactivos en exceso y los disolventes pirogénicos intrapoliméricos. Fije dos calentadores de película delgada en la parte inferior del chip utilizando cinta térmicamente conductiva.

Tenga en cuenta que los lados de los calentadores deben alinearse con el borde de los canales anchos durante el tiempo de Dene y, por separado, coloque cinco termopares en el chip a través de los canales laterales abiertos sin conexión de cada cinta de chip. Para fijar la posición de los termopares, agregue cuatro microlitros de 25 XRNA secure a 96 microlitros de etanol al 70 % en un tubo y a etanol al 100 % en un segundo tubo. Además, prepare 300 microlitros de tampón de canal y 316 microlitros de tampón de lisis.

Caliente las soluciones a 60 grados Celsius durante 15 minutos. Para activar el RNA secure y luego equilibrar el canal microfluídico. Pase el tampón del canal a través del canal SPE a un flujo de 0,8 mililitros por hora.

Ahora, caliente rápidamente la muestra de prueba de haba en VTM a 37 grados Celsius. Retire la muestra tan pronto como se haya descongelado. Centrifugue la muestra a 13.000 RPM durante 10 minutos.

Transfiera 100 microlitros del sobrenadante a 300 microlitros del tampón de lisis y agregue seis microlitros de portador de ARN a una concentración de un microgramo por microlitro; vortexee para mezclar. Luego, centrifugue durante cinco segundos y cargue todo el lisado en una jeringa de un centímetro cúbico con bloqueo de aguja. Pase el lisado a través del canal de SPE a un flujo de 0,8 mililitros por hora.

Luego, lave el canal de SPE con 100 microlitros de etanol al 70 %, seguido de 100 microlitros de etanol al 100 % a una velocidad de un mililitro por hora. Coloque una jeringa vacía en la marca de 0,5 mililitros y pase aire a través del canal para secarlo a una velocidad de un mililitro por hora. A continuación, pase 67,5 microlitros de agua libre de nucleasas a través del canal para eluir los ácidos nucleicos retenidos a 0,5 mililitros por hora y recoja 13,5 microlitros desde el nano puerto en el puerto de desecho.

Cargue 36,5 µL del master de R-T-P-C-R. Mezcle en el nano puerto en el puerto de desecho y mezcle con ARN molde para una reacción de R-T-P-C-R de 50 µL. Luego, cargue la mezcla de R-T-P-C-R en el canal de RT mediante vacío suave.

Cierre el nano puerto con un adaptador cerrado. Aplique 35 voltios al calentador uno. Mantenga los reactivos en el canal de temperatura ambiente durante 30 minutos después de que el calentador uno alcance el equilibrio a 50 grados Celsius.

Mantenga los reactivos en el canal RT durante 15 minutos después de que el calentador uno se equilibre a 95 grados Celsius. A continuación, aplique 27 voltios al calentador uno y 50 voltios al calentador dos para equilibrar el calentador uno a 60 grados Celsius y el calentador dos a 95 grados Celsius. Introduzca los reactivos en el canal PCR a 0,5 microlitros por minuto.

Aproximadamente 20 minutos después, cuando los reactivos se acerquen al final del canal serpenteante, recolecte los productos de PCR en la salida utilizando un pipeta y punta de tamaño adecuado para la prueba de ADN de alta sensibilidad de Agilent. Saque el kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent del refrigerador 30 minutos antes de la prueba. Encienda el bioanalizador y abra el software 2,100 experto.

Cargue un microlitro de los productos de PCR para la prueba y siga el protocolo de Agilent. Analice y registre los datos en este flujo de trabajo. La muestra nasofaríngea del paciente se mezcla con tampón de lisis y se aplica al chip.

Se realiza la corrida del chip y los productos de PCR del virus de la influenza aparecen en rojo utilizando un chip comercial de electroforesis capilar. Debido a las diferentes cantidades del virus de la influenza en la muestra de cada paciente, la concentración final del producto de PCR variará. Un buen resultado debe presentar bajo nivel de ruido y picos escalonados bien definidos a 35 y 10, 380 pares de bases, así como un pico único de producto en el tamaño diseñado de 107 pares de bases para la muestra positiva.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar y operar el chip microfluídico para detectar el virus de la influenza A.