Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

El objetivo general del siguiente experimento es detectar el virus de la gripe A utilizando un chip microfluídico. Primero, pase la muestra con tampón de lisis a través del canal SPE para licitar el virus y extraer el ARN, cargue el reactivo R-T-P-C-R con ARN extraído y ejecute el canal de transcripción inversa para convertir el ARN viral en CDNA. A continuación, se pasa la mezcla por el canal de PCR para amplificar el ADN, se obtienen resultados que muestran el tamaño y la concentración del amplicón en función de la señal de fluorescencia de la electroforesis capilar.

La principal ventaja de esta tecnología es que acepta la muestra bruta del paciente e integra la extracción, purificación, transcripción inversa y amplificación de ácidos nucleicos en un solo chip Para crear dos placas, distribuya aproximadamente nueve gramos de gránulos XN X de manera uniforme en el centro de una placa de metal, colóquelos en una prensa calentada a 198 grados centígrados durante cinco minutos. Luego aplique presión lentamente a 2, 500 PSI durante otros cinco minutos. Ahora, coloque una placa en el molde de epoxi, precaliente a 157 grados centígrados durante 10 minutos y aplique presión lentamente a 1000 PSI durante otros 10 minutos.

A continuación, con guantes térmicos, retire la placa y el molde de la prensa caliente y, a continuación, retire la placa del molde antes de que se enfríe. Taladre tres orificios en el chip en relieve, uno en la entrada, otro en el puerto de desagüe y otro en la salida del canal microfluídico. A continuación, lave las patatas fritas con IPA seguidas de ARN y agua de dianna.

Seque las papas fritas con aire para unirlas, primero precaliente a 131 grados centígrados durante 10 minutos y luego presione a 350 PSI durante otros 10 minutos. Con JB Weld Epoxy, conecte los puertos nano en los desechos de entrada y los puertos de salida curen por separado durante 15 a 24 horas. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, enjuague el canal SPE con 50 microlitros de ARN y luego con 100 microlitros de agua libre de nucleasa.

Ahora cargue el canal SPE con cuatro microlitros de solución de injerto recién preparada para reticular la incubación de metacrilato durante 10 minutos en un horno UV, retire la solución de injerto residual con un vacío. Rompa el gránulo de microesferas seco golpeando el tubo con la tapa cerrada. A continuación, añada 100 microlitros de solución de columna SPE recién preparada y vórtice para mezclar.

Cargue cuatro microlitros de la solución de SPE en el mismo canal de reticulación mediante irradiación UV durante 2,5 minutos en cada lado, lo que da como resultado una columna de SPE polimerizada de color blanco opaco. Lave el canal con 500 microlitros de metanol al 100% para enjuagar el exceso de reactivos y disolventes pirogénicos intrapolímeros. Fije dos calentadores de película delgada a la parte inferior del chip con cinta termoconductora.

Tenga en cuenta que los lados de los calentadores deben estar alineados con el borde de los canales anchos durante la duración de Dene y arrodillarse por separado, coloque cinco termopares en el chip a través de los canales laterales abiertos sin salida de cada cinta de chip. Para fijar la ubicación de los termopares, agregue cuatro microlitros de 25 XRNA secure a 96 microlitros de etanol al 70% en un tubo y al 100% de etanol en un segundo tubo. Además, prepare 300 microlitros de tampón de canal y 316 microlitros de tampón de lisis.

Calienta las soluciones a 60 grados centígrados durante 15 minutos. Para activar el ARN asegurar, luego para equilibrar el canal microfluídico. Ejecute el tampón de canal a través del canal SPE a un caudal de 0,8 mililitros por hora.

Ahora muestra rápida de prueba de habas en VTM a 37 grados centígrados. Retire la muestra tan pronto como se descongele. Centrifugar la muestra a 13.000 rpm durante 10 minutos.

Transfiera 100 microlitros del sobrenadante a 300 microlitros del tampón de lisis y agregue seis microlitros de un microgramo por portador de microlitro, vórtice de ARN para mezclar. A continuación, gire durante cinco segundos y cargue todo el lisado en una jeringa CC con cerradura de señuelo. Haga pasar el lisado a través del canal SPE a un caudal de 0,8 mililitros por hora.

A continuación, lavar el canal SPE con 100 microlitros de etanol al 70%, seguidos de 100 microlitros de etanol al 100% a un mililitro por hora. Coloque una jeringa vacía en la marca de 0,5 mililitros y empuje el aire a través del canal para secarla a un mililitro por hora. Ahora haga correr 67,5 microlitros de agua libre de nucleasas a través del canal para eluir los ácidos nucleicos unidos a 0,5 mililitros por hora y recoja 13,5 microlitros del nano puerto en el puerto de residuos.

Carga 36,5 microlitros del maestro R-T-P-C-R. Mezcle en el puerto nano en el puerto de desechos y mezcle con ARN patrón para una reacción R-T-P-C-R de 50 microlitros. A continuación, cargue la mezcla R-T-P-C-R en el canal RT mediante un vacío suave.

Selle el puerto nano con un accesorio cerrado. Aplique 35 voltios al calentador uno. Mantenga los reactivos en el canal RT durante 30 minutos después de que el calentador uno se equilibre a 50 grados Celsius.

Mantenga los reactivos en el canal RT durante 15 minutos después de que el calentador uno se equilibre a 95 grados Celsius. A continuación, aplique 27 voltios al calentador uno y 50 voltios al calentador, dos para equilibrar el calentador, uno a 60 grados centígrados y el calentador dos a 95 grados centígrados. Empuje los reactivos en el canal de PCR a 0,5 microlitros por minuto.

Unos 20 minutos más tarde, cuando los reactivos se acerquen al final del canal serpentino, recoja los productos de PCR en la salida con una pipeta y una punta del tamaño adecuado para la prueba de ADN de alta sensibilidad de Agilent. Retire el kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent del refrigerador 30 minutos antes de la prueba. Encienda el bioanalizador y abra el software 2, 100 expert.

Cargue un microlitro de los productos PCR para la prueba y siga el protocolo Agilent. Analice y registre los datos en este flujo de trabajo. La muestra nasal faríngea del paciente se mezcla con tampón de lisis y se aplica al chip.

El chip se ejecuta y los productos de PCR del virus de la influenza se enrojecen utilizando un chip de electroforesis capilar comercial. Debido a las diferentes cantidades de virus de la influenza en la muestra de cada paciente, la concentración final del producto de PCR variará. Un buen resultado debe tener un bajo nivel de ruido para despejar los picos de la escalera en 35 y 10, el par de bases 380 y un solo pico de producto en el tamaño de producto diseñado de 107 pares de bases para la muestra positiva.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar y ejecutar el chip de microfluido para detectar el virus de la influenza A.