Name: Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a fabricar chips microfluídicos de termoplástico para detectar el virus influenza A mediante extracción de ácido nucleico, transcripción inversa y PCR integrados en un solo dispositivo.

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Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención R01 EB008268.

1. Chip de fabricación 12 <ol><li> Hacer dos placas de Zeonex 690R gránulos: distribuir 8-9 gramos gránulos Zeonex uniformemente en el centro de una placa de metal, precalentar en la prensa calentada a 198 ° C durante 5 min, y luego aplicar presión lentamente a 2.500 psi durante otros 5 min. Para completar este paso, se utilizó una prensa Carver caliente. </li><li> Graba en relieve el canal microfluídico en la placa con un molde de epoxi. Los detalles sobre la fabricación de moldes se describen en otra parte 12 (diseño de canal en la figura 2b): ponga una placa en el molde de epoxi; precalentarlos en la prensa calentada a 157 ° C durante 10 min y después aplicar presión lentamente a 1.000 psi durante otros 10 min . Retire la placa del molde a mano o con una pinza antes de que se enfríe. (Nota: use guantes térmicos durante este paso.) </li><li> Perforar los agujeros en el chip en relieve en la entrada, el puerto de residuos, y la salida del canal microfluídico. Se utilizó un diámetro de 1,25 mmeternos broca para hacer los tres agujeros. </li><li> Bond el chip en relieve con otra placa (en la parte superior): Lavar las patatas fritas con IPA, RNAse Away y agua desionizada en secuencia; aire seco y precalentar ellos en la prensa calentada a 131 ° C durante 10 min y después se presiona a 350 psi para otro 10 min. </li><li> Adjuntar Nanoports en la entrada, los residuos, y los puertos de salida por separado usando JB Weld Epoxy; curar durante 15 a 24 horas según las instrucciones del fabricante. </li><li> Enjuague el canal SPE con 50 l de RNasa lejos, seguidos con 100 ml de agua libre de nucleasas. </li><li> Cargar el canal SPE con 4 l de la solución de injerto (metacrilato de metilo con 3% w / v benzofenona) y luego reticular el metacrilato por incubación durante 10 min en un horno de radiación UV, en longitud de onda 365 nm UV y 2.000 2 mJ / cm. Retire la solución residual injerto con vacío. Se utilizó el vacío de la pared. Para obtener los mejores resultados, una solución fresca se debe utilizar. Por lo general es aceptable, sin embargo, para almacenar unsolución preparada a 4 ° C durante hasta una semana. </li><li> Hacer la solución columna SPE (todos los% v / v): 16% dimetacrilato de etileno, 24% de metacrilato de butilo, 42% de 1-dodecanol, 18% de ciclohexanol, y añadir 1% de 2-dimetilamino-4-(metil-fenilamino)-fenol como el foto-iniciador. </li><li> Sacar el mismo volumen de solución de sílice como microesferas de la solución columna SPE (para hacer una mezcla 1:1), y que se seque completamente a 70 ° C durante la noche en un horno de vacío. Romper la pastilla tocando en el tubo con la tapa cerrada. Añadir la solución de la columna SPE en el tubo de sílice de microesferas secas y vortex para mezclar. </li><li> Carga 4 l de la solución SPE en el mismo canal y después reticular por irradiación UV durante 2,5 min. A continuación, darle la vuelta al chip de una y otra para irradiar min 2,5. La columna SPE polimerizado debería ser un sólido de color blanco opaco. </li><li> Lavar el canal con 500 l de metanol al 100% para enjuagar el exceso de reactivos. Este lavado también elimina intra-po polímerodisolventes rogenic, creando así la estructura de poro abierto de la columna SPE cuando se seca en condiciones ambientales. </li><li> Acople dos calentadores de película delgada a la parte inferior del chip con cinta térmicamente conductor. Los lados de los calentadores deben estar alineadas con el borde de los canales anchos para la desnaturalización y el recocido por separado (véase la Figura 1). </li><li> Coloque cinco termopares en el chip a través de los muertos terminó abiertos los canales laterales de cada chip (véase la Figura 2b). Los termopares permanecer en estos canales mediante ajuste a presión. Cinta se utiliza para fijar aún más la ubicación de los termopares. </li></ol> 2. Método de extracción en fase sólida <ol><li> Preparar 96 l de etanol al 70% con agua tratada con DEPC y se autoclave (Millipore filtrada desionizada o-). </li><li> Añadir 4 l de 25X ARN Asegure a 96 l de 70% de etanol en un tubo, y duplicar la misma mezcla con 100% de etanol en un tubo separado. </li><li> Preparar 300l de tampón canal mezclando los siguientes: 75 l de 6 M de tiocianato de guanidina (GuSCN), 150 l de 2-propanol, 63 l de agua libre de nucleasa, y 12 l de ARN Aseguren 25X. </li><li> Preparar 312 l de tampón de lisis mediante la mezcla: 100 l de 6 M de GuSCN, 200 l de 2-propanol, y 12 mu l de ARN Aseguren 25X. </li><li> Calentar el etanol al 70%, etanol al 100%, tampón de canal y tampones de lisis a 60 º C durante 10-20 min para activar el seguro de ARN. </li><li> Para equilibrar el canal microfluídico, ejecute el buffer del canal a través del canal de SPE a un caudal de 0,8 ml / hr. </li><li> Rápida y descongelar la muestra en VTM a 37 ° C en baño de agua y retire inmediatamente la muestra del baño de agua tan pronto como se descongela. </li><li> Se centrifuga la muestra a 13.000 rpm durante 10 min, y transferir 100 l del sobrenadante en 300 l de tampón de lisis. Completar la mezcla mediante la adición de 6 l de 1 mg / ARN mu l portadoras. </li><li> Vortex para mezclar, y después de centrifugado5 segundos, cargue el lisado completo en una jeringa Luer-lok cc 1. </li><li> Ejecutar el lisado a través del canal de SPE a un caudal de 0,8 ml / hr. </li><li> Lavar el canal de SPE con 100 l de etanol al 70%, seguido por 100 l de etanol of100% a 1 ml / hr. (Hay un volumen de 50 l muertos en la punta de la jeringa que no será expulsado, por lo que en realidad sólo 50 l pasa por el canal.) </li><li> Coloque una jeringa vacía en la marca de 0,5 ml y empujar el aire a través del canal para que se seque a 1 ml / hr. </li><li> Ejecutar 67,5 l de agua libre de nucleasa a través del canal para eluir los ácidos nucleicos unidos a 0,5 ml / hr, y recoger 13,5 l de la NanoPort en el puerto de residuos. (La pérdida de fluido se debe al volumen de 54 l muerto en la punta de la jeringa y el canal de SPE.) </li></ol> 3. RT-PCR <ol><li> Preparar 36,5 l de la mezcla de RT-PCR maestro durante el paso de aire seco (2,12) utilizando los reactivos en un Qiagen OneStep RT-PCR kits. </li><li> Cargar RT-PCR reactivo en la NanoPort en el puerto de residuos, y se mezcla con el ARN para obtener el siguiente 50 l de reacción RT-PCR: 13,5 mu l de ARN se eluyó en agua libre de nucleasa, 4 l de RT-PCR de mezcla de enzimas, 10 l solución Q, 10 μl1X uno tope graduado, 2 l 25 mM MgCl 2, 1 uL 50 mM adelante primer 5&#39;-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA &#39;C-3, 1 l 50 mM primers revertir 5&#39;-AGG ACG TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;, 2 l dNTP, 0,75 l 1,0% w / v de BSA, 0,73 l PEG8000 y 5,02 l de agua libre de nucleasas. </li><li> Cargar la mezcla de RT-PCR en el canal RT por vacío suave (se utilizó el vacío de la pared) y sellar la NanoPort con un accesorio cerrado. </li><li> Aplicar 35 V al calentador 1. Mantener los reactivos en el canal TA durante 30 min después del calentador 1 se equilibra a 50 º C. Mantener los reactivos en el canal TA durante 15 min después del calentador 1 se equilibra a 95 º C. </li><li> Aplicar 27 V al calentador 1 y 50 V al calentador 2, esperar alrededor de tres minutos o hasta que el calentador 1 se equilibra a 60 y deg; C y el calentador 2 se equilibra a 95 º C. </li><li> Empuje los reactivos en el canal de PCR a 0,5 l / min. Se debe tomar alrededor de 20 min para los reactivos fluyan a través del canal de serpentina. </li><li> Cuando la muestra llega a la final del canal de serpentina, recoger los productos de PCR en la toma de corriente mediante una pipeta y la punta de tamaño apropiado. </li></ol> 4. Productos de detección de PCR <ol><li> Usamos un Agilent DNA de prueba de alta sensibilidad para detectar los productos. Para ejecutar esta prueba saque el kit de ADN Agilent alta sensibilidad del refrigerador 30 minutos antes de la prueba. </li><li> Encienda el Bioanalyzer y abra el software Expert 2100. </li><li> Cargar el 1 l de los productos de PCR en la prueba y siga el protocolo de Agilent ( <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">20Manual.pdf http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%</a> ). </li><li> Analizar y registrar los datos. </li></ol>

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<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

Los autores han declarado conflictos de intereses financieros.

El método de diagnóstico presentados aquí demuestran la capacidad de un sistema integrado de chip de plástico microfluídico para amplificar ARN influenza A partir de muestras de pacientes con alta especificidad y un bajo límite de detección 13 Se diseñó este chip para el punto de potencial de las pruebas de atención:. (A) la temperatura y fluídico el control se simplifica, (b) el chip es de bajo costo y adecuadas para la fabricación de alto rendimiento utilizando moldeo por inyección, y (c) el chip es desecha...

Millones de muertes han sido reportadas durante las tres pandemias de influenza en el siglo 20 1. Por otra parte, la pandemia de influenza más reciente fue declarada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), dos en 2009, y el 1 de agosto de 2010, 18.449 muertes fueron reportadas por la OMS 3. Esta pandemia ha demostrado una vez más la elevada carga de enfermedades infecciosas, y la necesidad de una detección rápida y exacta de la gripe a activar la confirmación de la enfermedad rápidamente, la respuesta de salud pública apropiada y un tratamiento efectivo 4. Hay varios métodos utilizados para el diagnóstico de la gripe, que incluyen inmunoensayos rápidos, pruebas de antígeno fluorescente directa (DFA) y los métodos de cultivo viral. Inmunoensayos rápidos dramáticamente carecen de sensibilidad 5-8, mientras que los otros dos métodos son de trabajo intensivo y requiere mucho tiempo 9. Las pruebas moleculares ofrecen múltiples ventajas, incluyendo un vuelco corto tiempo, Sensit altoividad, y una mayor especificidad. Varias entidades comerciales han estado trabajando para pruebas moleculares rápidas (también llamadas pruebas de ácido nucleico o NAT) para las enfermedades infecciosas, y varios tienen pruebas de influenza en sus tuberías. Sin embargo la mayoría de ellos requieren fuera de chip preparación de la muestra. Ninguna de las Enmiendas de Mejoras de Laboratorio Clínico (CLIA) renunciaron pruebas moleculares incorporar preparación de la muestra en el cartucho de ensayo o módulo. Lab-on-a-chip desempeña un papel importante en el desarrollo de dispositivos de prueba en el punto de atención. Después de la introducción de la primera chip de PCR en 1993 10, numerosos esfuerzos se han puesto en el desarrollo de chips de prueba de ácidos nucleicos. Sin embargo, sólo unos pocos de estos tienen preparación integrada muestra en bruto con la amplificación aguas abajo. Hemos demostrado anteriormente la miniaturización de una columna de extracción en fase sólida (SPE) en un chip microfluídico de plástico 11 y desarrollar lación y optimización de un flujo continuo de chip PCR 12. Este sentido, ampliar el trabajo previo para integrar la SPE con RT y PCR medidas en un solo chip para el diagnóstico clínico y demostrar su capacidad para amplificar los ácidos nucleicos de los pacientes nasofaríngeo (NP) hisopados y aspirados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 1-dodecanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 196118-50G </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 19516 </td></tr><tr><td> Benzofenona </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 239852-50G </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> Butil metacrilato </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 235865-100 ml </td></tr><tr><td> Carrier RNA </td&gt; <td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> Ciclohexanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> Dimetacrilato </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> Dimetacrilato de etilenglicol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 335681-100ML </td></tr><tr><td> Jeringa de vidrio 250 l </td><td> Hamilton, Reno, NV </td><td> 81127 </td></tr><tr><td> Tiocianato de guanidina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 50981 </td></tr><tr><td> Kit de ADN de alta sensibilidad </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Prensa caliente </td><td> Carver, Wabash, IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB Weld Epoxies </td><td> Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> Jeringas Luer-Lok </td><td> BD-Medical, Franklin Lakes, NJ </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> Cloruro de Magnesio </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> Metil metacrilato </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> NanoPort </td><td> Upchurch Scientific </td><td> N-333 a 01 </td></tr><tr><td> NanoPort montaje </td><td> Upchurch Scientific </td><td> F-120x </td></tr><tr><td> Nucleasa libre de agua </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td> Fuente de alimentación </td><td> VWR, Radnor, PA </td><td> 300V </td></tr><tr><td> Lejos RNAsa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 83931-250ML </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> Applied Biosystems, Foster City, CA </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> Las microesferas de sílice </td><td> Polysciences, Warrington, PA </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> Bomba de jeringa </td><td> Harvard Apparatus, Holliston, MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> Cinta térmicamente conductora </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> Par termoeléctrico </td><td> Omega Engineering, Stamford, CT </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> Calentadores de película fina </td><td> Minco, Minneapolis, MN </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> Crosslinker Ultravioleta </td><td> UPV, Upland, CA </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;td&gt; Zeon Chemicals, Louisville, KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Diagnósticos rápidos y eficaces desempeñan un papel importante en el control de enfermedades infecciosas al permitir la gestión eficaz del paciente y el tratamiento. Aquí, se presenta un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico con la capacidad de amplificar el virus en pacientes nasofaríngeas (NP) frotis y aspirados. Después de cargar la muestra del paciente, el dispositivo de microfluidos secuencialmente lleva a cabo en el chip lisis celular, la purificación del ARN y otra de concentración dentro de la extracción en fase sólida (SPE), transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en RT-PCR cámaras, respectivamente. Punto final de la detección se realizó usando un Bioanalyzer fuera de chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Por periféricos, se utilizó una bomba de jeringa de un solo reactivo para conducir y muestras, mientras que dos calentadores de película fina se utilizaron como fuentes de calor para la RT y PCR cámaras. El chip está diseñado para ser de una sola capa y adecuado para la fabricación de alto rendimiento para reducir la fabricatien tiempo y costo. El chip microfluídico proporciona una plataforma para analizar una amplia variedad de virus y bacterias, limitado sólo por cambios en el diseño de reactivos necesarios para detectar nuevos patógenos de interés.

<html> Un resultado típico se muestra en la Figura 3 para una gripe A muestra infectada lavado nasofaríngeo. Debido a las diferentes cantidades de virus de la gripe en cada muestra de paciente, la concentración final del producto de PCR puede variar. Un buen resultado debe tener bajo nivel de ruido, dos picos claros de escalera (35 y 10380 pb) y un pico de producto único en el tamaño del producto diseñado (107 pb) para la muestra positiva. Mientras que el pico del producto teóricamente debería estar ause...

Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar el virus de la influenza A utilizando un chip microfluídico. Primero, haga pasar la muestra con tampón de lisis a través del canal de SPE para lisar el virus y extraer el ARN; cargue el reactivo de RT-PCR con el ARN extraído y haga pasar la muestra a través del canal de transcripción inversa para convertir el ARN viral en ADNc. A continuación, haga pasar la mezcla al canal de PCR con el fin de amplificar el ADN. Los resultados obtenidos muestran el tamaño y la concentración del amplicón en función de la señal de fluorescencia proveniente de la electroforesis capilar.La principal ventaja de esta tecnología es que acepta la muestra directa del paciente e integra la extracción, purificación, transcripción inversa y amplificación de ácidos nucleicos en un solo chip. Para crear dos placas, distribuya aproximadamente nueve gramos de gránulos XN X uniformemente en el centro de una placa metálica, coloque en una prensa calentada a 198 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, aplique presión lentamente hasta alcanzar 2,500 PSI durante otros cinco minutos. A continuación, coloque una placa sobre el molde de epoxi precalentado a 157 grados Celsius durante 10 minutos, y aplique presión lentamente hasta alcanzar 1000 PSI durante otros 10 minutos.A continuación, utilizando guantes térmicos, retire la placa y el molde de la prensa caliente y luego extraiga la placa del molde antes de que se enfríe. Taladre tres orificios en el chip grabado, uno en la entrada, otro en el puerto de desecho y un tercero en la salida del canal microfluídico. Luego lave los chips con IPA, seguido de RNAs away y agua dianna's.Seque las placas con aire para unirlas; primero precálente a 131 grados Celsius durante 10 minutos y luego presione a 350 PSI durante otros 10 minutos. Utilizando epoxi JB Weld, fije los nanoconectores por separado en los puertos de entrada, desecho y salida, y deje curar entre 15 y 24 horas. Según las instrucciones del fabricante, enjuague el canal de SPE con 50 microlitros de RNAs away seguidos de 100 microlitros de agua libre de nucleasas.Ahora cargue el canal de SPE con cuatro microlitros de solución de inmovilización recién preparada para reticular la incubación de metacrilato durante 10 minutos en un horno de luz UV; elimine la solución de inmovilización residual mediante vacío. Desagregue el pellet seco de microesferas golpeando suavemente el tubo con la tapa cerrada. A continuación, añada 100 microlitros de solución fresca preparada para columna de SPE y vortexee para homogeneizar.Cargue cuatro microlitros de la solución de SPE en el mismo canal y realice un entrecruzamiento por irradiación UV durante 2,5 minutos por cada lado, obteniendo una columna de SPE polimerizada de color blanco opaco. Lave el canal con 500 microlitros de metanol al 100 % para eliminar los reactivos en exceso y los disolventes pirogénicos intrapoliméricos. Fije dos calentadores de película delgada en la parte inferior del chip utilizando cinta térmicamente conductiva.Tenga en cuenta que los lados de los calentadores deben alinearse con el borde de los canales anchos durante el tiempo de Dene y, por separado, coloque cinco termopares en el chip a través de los canales laterales abiertos sin conexión de cada cinta de chip. Para fijar la posición de los termopares, agregue cuatro microlitros de 25 XRNA secure a 96 microlitros de etanol al 70 % en un tubo y a etanol al 100 % en un segundo tubo. Además, prepare 300 microlitros de tampón de canal y 316 microlitros de tampón de lisis.Caliente las soluciones a 60 grados Celsius durante 15 minutos. Para activar el RNA secure y luego equilibrar el canal microfluídico. Pase el tampón del canal a través del canal SPE a un flujo de 0,8 mililitros por hora.Ahora, caliente rápidamente la muestra de prueba de haba en VTM a 37 grados Celsius. Retire la muestra tan pronto como se haya descongelado. Centrifugue la muestra a 13.000 RPM durante 10 minutos.Transfiera 100 microlitros del sobrenadante a 300 microlitros del tampón de lisis y agregue seis microlitros de portador de ARN a una concentración de un microgramo por microlitro; vortexee para mezclar. Luego, centrifugue durante cinco segundos y cargue todo el lisado en una jeringa de un centímetro cúbico con bloqueo de aguja. Pase el lisado a través del canal de SPE a un flujo de 0,8 mililitros por hora.Luego, lave el canal de SPE con 100 microlitros de etanol al 70 %, seguido de 100 microlitros de etanol al 100 % a una velocidad de un mililitro por hora. Coloque una jeringa vacía en la marca de 0,5 mililitros y pase aire a través del canal para secarlo a una velocidad de un mililitro por hora. A continuación, pase 67,5 microlitros de agua libre de nucleasas a través del canal para eluir los ácidos nucleicos retenidos a 0,5 mililitros por hora y recoja 13,5 microlitros desde el nano puerto en el puerto de desecho.Cargue 36,5 µL del master de R-T-P-C-R. Mezcle en el nano puerto en el puerto de desecho y mezcle con ARN molde para una reacción de R-T-P-C-R de 50 µL. Luego, cargue la mezcla de R-T-P-C-R en el canal de RT mediante vacío suave.Cierre el nano puerto con un adaptador cerrado. Aplique 35 voltios al calentador uno. Mantenga los reactivos en el canal de temperatura ambiente durante 30 minutos después de que el calentador uno alcance el equilibrio a 50 grados Celsius.Mantenga los reactivos en el canal RT durante 15 minutos después de que el calentador uno se equilibre a 95 grados Celsius. A continuación, aplique 27 voltios al calentador uno y 50 voltios al calentador dos para equilibrar el calentador uno a 60 grados Celsius y el calentador dos a 95 grados Celsius. Introduzca los reactivos en el canal PCR a 0,5 microlitros por minuto.Aproximadamente 20 minutos después, cuando los reactivos se acerquen al final del canal serpenteante, recolecte los productos de PCR en la salida utilizando un pipeta y punta de tamaño adecuado para la prueba de ADN de alta sensibilidad de Agilent. Saque el kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent del refrigerador 30 minutos antes de la prueba. Encienda el bioanalizador y abra el software 2,100 experto.Cargue un microlitro de los productos de PCR para la prueba y siga el protocolo de Agilent. Analice y registre los datos en este flujo de trabajo. La muestra nasofaríngea del paciente se mezcla con tampón de lisis y se aplica al chip.Se realiza la corrida del chip y los productos de PCR del virus de la influenza aparecen en rojo utilizando un chip comercial de electroforesis capilar. Debido a las diferentes cantidades del virus de la influenza en la muestra de cada paciente, la concentración final del producto de PCR variará. Un buen resultado debe presentar bajo nivel de ruido y picos escalonados bien definidos a 35 y 10, 380 pares de bases, así como un pico único de producto en el tamaño diseñado de 107 pares de bases para la muestra positiva.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar y operar el chip microfluídico para detectar el virus de la influenza A.

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