La evaluación de la resistencia murino Función Arterial Utilizando miografía Presión

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la reactividad vascular en tiempo real de la arteria resistente del ratón in vitro en condiciones casi fisiológicas. Esto se logra montando un pequeño segmento del vaso en dos micro cánulas y manteniéndolo a presión luminal fisiológica. A continuación, el vaso se constriñe con un agonista del receptor alfa uno, la fenilefrina, para estudiar la capacidad de cualquier fármaco para dilatar el vaso.

Desafiar el vaso constreñido con acetilcolina evalúa su capacidad para dilatarse en tiempo real a través de un mecanismo dependiente del endotelio. Los resultados muestran el cambio porcentual en el diámetro del lumen en respuesta a la acetilcolina y verifican que la deficiencia de SGC alfa uno resulta en una vasodilatación dependiente del endotelio. La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como la mamografía con alambre, es que la mamografía a presión permite la caracterización de microvasos pequeños, que son más relevantes para mantener la homeostasis de la presión arterial que los vasos de conductancia más grandes.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular, como la hipertensión, donde los vasos macrorresistentes juegan un papel fundamental. Comience por sacrificar a un ratón con pentobarbital. Ahora abra la cavidad abdominal y comience a diseccionar el tejido mesentérico.

Ahora identifique una arteria mesentérica de tercer orden y aíslela del tejido conectivo y adiposo. La diferenciación entre arterias y venas a nivel de los microvasos es problemática cuando no hay sangre en los vasos. Por lo tanto, es preferible hacer esto en el animal intacto.

A continuación, corte un segmento de dos a tres milímetros de largo de una arteria mesentérica de tercer orden y colóquelo en un plato que contenga montones. Búfer PSS. El segmento arterial no debe contener ninguna ramificación.

Prepare la cámara mio llenando suavemente las cánulas a través de las válvulas de entrada y salida con montones de solución PSS De una jeringa de 10 mililitros, tenga en cuenta que una presión excesiva puede dañar el frágil transductor conectado a las cánulas. Después de llenar herméticamente las cánulas, cierre ambas válvulas. Ahora transfiera el segmento arterial aislado a la cámara y monte un extremo del vaso en la cánula derecha.

Atándolo cuidadosamente con una fina hebra de sutura de nailon con una jeringa, enjuague y llene el recipiente con solución de pila a través de la válvula de entrada. Ahora monte el otro extremo del recipiente en la cánula izquierda y asegure la cánula al recipiente con la sutura de nylon. Llene la cámara con hasta 10 mililitros de solución de pila.

Compruebe si hay una fuga empujando suavemente la solución en pila a través de la válvula de entrada con la ayuda de una jeringa. Ahora coloque la cámara debajo de la cámara de video. Encienda el oxígeno y caliente la cámara a 37 grados centígrados mientras la válvula de entrada está cerrada, conectada al tubo P one del primer depósito de solución en pila.

Deje que cualquier burbuja y solución pase a través del tubo hasta que no haya burbujas en el tubo. A continuación, abra la válvula. Conéctelo a la válvula izquierda de la cámara con el tubo P dos.

Viniendo del regulador de presión, asegúrese de que no haya burbujas ni fugas en todo el sistema. Vaya al menú de presión en el panel de interfaz myo o en el software y encienda la bomba mientras apaga el flujo. Abra el programa y haga clic en recopilar.

Ahora es posible monitorear y analizar el lumen del vaso, el diámetro del vaso y el espesor de la pared. Para aumentar gradualmente la presión interluminal, seleccione la presión P uno e introduzca una secuencia de presión ascendente. Los valores de cinco a 60 milímetros de los recipientes de mercurio, a veces se retuercen o convolúan a medida que aumenta la presión, por lo que debe ajustar la tensión o la deformación en consecuencia con la ayuda de un microposicionador vertical o longitudinal.

Una vez que la presión esté a 60 milímetros y el baño a 37 grados centígrados, equilibre el recipiente durante al menos 45 minutos y hasta una hora durante el período de equilibrio. Cambie la solución de baño una vez con montones precalentados. Ahora que la sección arterial está equilibrada, aplique 10 mililitros de solución despolarizante de cloruro de potasio a 37 grados centígrados.

El músculo liso se despolarizará por completo y logrará la máxima constricción. Después de obtener una constricción estable, enjuague el baño con solución de montón tres veces a intervalos de 10 minutos. Ahora verifique la viabilidad del vaso y la integridad del endotelio.

Primero, constriña previamente el recipiente agregando fenilefrina para atender los cinco moles negativos por litro. Cuando se haya obtenido una constricción estable, se realizará una curva de respuesta de vasodilatación de concentración acumulativa mediante la adición secuencial de dosis crecientes de acetilcolina de 10 a la negativa, de nueve a 10 a la negativa cinco moles por litro después de la última dosis de acetilcolina. Enjuague la preparación con montones tres veces a intervalos de 10 minutos.

Ahora, determine el diámetro del lumen pasivo aplicando PSS libre de calcio que contenga dos milimoles de EGTA por litro de los trazados registrados. Mida el diámetro del lumen para cada respuesta a la dosis, que se utilizará para calcular todos los parámetros. Exprese la respuesta de relajación de la acetilcolina como una comparación entre el tratamiento con el agonista y el tampón libre de calcio en términos de cuánto alteró cada uno el diámetro del lumen debido a la constricción inducida por la fenilefrina.

Se utilizó la miografía para estudiar la relajación vascular en respuesta a la acetilcolina en arterias de resistencia mesentérica aisladas de ratones knockout de tipo salvaje y SGC alfa uno en los fondos S seis y seis negros y preconstreñidos con fenilefrina. La deficiencia de SGC alfa uno se asoció con la disminución de la capacidad de la acetilcolina para inducir la relajación vascular, independientemente de los antecedentes genéticos de los ratones estudiados. Sin embargo, la relajación dependiente del endotelio de los ratones nulos SGC Alfa uno se vio más marcada en el fondo S six que en el fondo negro seis.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que la disminución de la sensibilidad de la vasculatura a la relajación dependiente del endotelio puede contribuir a la hipertensión específica de la cepa en ratones knockout SGC Alpha one Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal simultáneamente en los vasos sanguíneos vivos. Esto permitiría, por ejemplo, la medición de las concentraciones intracelulares de hierro que pueden ayudar a identificar los mecanismos de señalización subyacentes.