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El objetivo general del siguiente experimento es aislar monocitos de sangre periférica humana y diferenciarlos hacia diferentes tipos de polarización de macrófagos. Esto se logra aislando primero células mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Como segundo paso, se realiza el aislamiento de perlas negativas para obtener monocitos CD 14 positivos puros.

A continuación, los monocitos se cultivan en condiciones específicas para inducir macrófagos específicamente polarizados. En última instancia, la expresión diferencial de los marcadores de polarización de macrófagos en respuesta a sus condiciones de cultivo puede determinarse mediante PCR cuantitativa. Este método puede ayudar a diseccionar la diferenciación de los macrófagos hacia diferentes tipos de polarización.

Una característica que es extremadamente importante en enfermedades inflamatorias como la aterosclerosis. Después de extraer 30 mililitros de sangre entera de la vena del antebrazo de un voluntario, divida la sangre en partes iguales en dos tubos cónicos de 50 mililitros que no sean de poliestireno. A continuación, diluya la sangre de cada tubo con 10 mililitros de PBS.

A continuación, agregue 25 mililitros de paquete de histo a los 25 mililitros de sangre entera y PBS en cada tubo, teniendo cuidado de que el paquete de histo y la sangre no se mezclen. A continuación, centrifugar los tubos durante 30 minutos a 400 Gs y temperatura ambiente sin interrupción. Después del centrifugado, primero aspire la capa de plasma y luego transfiera la capa de interfaz opaca a un tubo nuevo de 50 mililitros.

Lave las celdas de la interfaz en 20 mililitros de PBS más CDTA durante cinco minutos a 250 Gs y cuatro grados Celsius. Luego, después de desechar el sobrenadante resus, suspenda el pellet en 10 mililitros de PBS más CDTA y mezcle bien las células mediante vórtice durante 10 segundos. Ahora diluya 200 microlitros de la suspensión celular en 300 microlitros de PBS más EDTA, y 500 microlitros de azul triam.

Para lograr alrededor de 200 a 500 células por 10 cuadrados y un hemocitómetro comienza el aislamiento negativo girando las celdas tres veces durante 10 minutos a 120 Gs Después del segundo lavado, suspendemos el pellet en nueve mililitros de agua estéril durante tres segundos. Luego agregue un mililitro de 10 XPBS después de lavar y contar las celdas una vez más, diluirlas en tampón de fácil fraguado a cinco veces 10 de las siete celdas por mililitro. Ahora incube las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en 50 microlitros por mililitro de cóctel de enriquecimiento de monocitos.

Durante el último minuto del vórtice de incubación, el enriquecimiento de monocitos cept se acumula durante 30 segundos. Luego agregue 50 microlitros por mililitro de las perlas a las celdas e incube la perla en suspensión celular durante otros cinco minutos. Después de la segunda incubación, aumente el volumen de la solución celular a 2,5 mililitros.

Con más tampón eep, la solución ahora aparecerá de un color marrón. A continuación, coloque el tubo en un imán eep durante dos minutos y medio a temperatura ambiente. Después de que las células unidas a las perlas hayan tenido la oportunidad de adherirse, vierta el tampón que contiene los monocitos no vinculantes en un tubo estéril nuevo.

La solución ahora aparecerá de un color blanquecino después de lavar las células no unidas una vez con PBS más EDTA, transferir las células a una placa de pocillos múltiples, luego agregar un mililitro de medio de cultivo por una vez 10 a las seis células de la placa de cultivo. Finalmente, cultive las células en las condiciones experimentales de interés durante seis días para inducir la diferenciación de macrófagos. Reemplace la mitad de los medios después de tres días con medios nuevos después de seis días.

Recoja las células para el análisis experimental deseado. Utilizando el protocolo descrito anteriormente, aproximadamente 25 veces 10 de los seis monocitos se obtienen rutinariamente a partir de 100 mililitros de sangre La pureza de los monocitos, según lo determinado por la tinción por citometría de flujo para CD, 14 es rutinariamente superior al 95% cuando se agrega por primera vez al cultivo. Los monocitos son inicialmente de forma redonda y flotan en unas pocas horas.

Sin embargo, se adhieren, dándoles una apariencia de huevo frito o de huso después de seis días. En cultivo con MCSF solo o con la adición de LDL oxidado durante las últimas 24 horas, aproximadamente el 80% de las células no expuestas a LDL oxidadas son viables, según lo determinado por yoduro de propidio. Por otro lado, el tratamiento de tinción con LDL oxidado da como resultado una viabilidad celular de aproximadamente el 70% después de seis días de cultivo.

Con el flujo de MCSF, el análisis citométrico demuestra que mientras las células siguen expresando el marcador de leucocitos CD 45 ro, regulan a la baja el marcador de monocitos CD 14. Dependiendo de las condiciones específicas que pueden inducir la polarización de los macrófagos durante el cultivo celular, se necesitan marcadores adicionales para garantizar una polarización exitosa. Condiciones específicas pueden inducir la polarización de los macrófagos.

Por ejemplo, los macrófagos polarizados M1 expresan marcadores típicos como IL seis y TNF alfa, mientras que los macrófagos M dos polarizados expresan CD 36 y CD 2 0 6, los macrófagos se pueden estudiar más a fondo en experimentos funcionales. Por ejemplo, la absorción de LDL oxidado se puede estudiar utilizando LDL marcado con fluorescencia. En este experimento, las células se expusieron a 10 microgramos por mililitro de LDL oxidado marcado con DII durante cuatro horas, y los núcleos se volvieron a tiñir con dpi.

El histograma muestra la medición citométrica de flujo de la absorción de LDL oxidado DII por los macrófagos inducidos por MCSF, con el histograma gris sólido que representa las células de control no tratadas y el histograma abierto negro. Representando los macrófagos oxidados tratados con LDL después de su desarrollo. Esta técnica permite a los investigadores estudiar la diferenciación y heterogeneidad de los macrófagos humanos.

De este modo, les permite estudiar enfermedades inflamatorias como la aterosclerosis para identificar nuevos mecanismos de enfermedad y nuevas dianas terapéuticas.