Name: Separación de los Plasmodium falciparum Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprende a separar eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum en estadios tardíos mediante separación magnética basada en la propiedad paramagnética de la hemozoina. Este método eficiente preserva la capacidad invasiva de los parásitos.

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Este trabajo fue financiado por el subsidio PRB-009 para CS y una beca doctoral a LC, de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT) de Panamá, Panamá.

Todas las etapas del protocolo, a excepción de centrifugaciones, debe llevarse a cabo dentro de una campana para mantener la muestra estéril. 1. Aislamiento en estadio tardío de P. falciparum-eritrocitos infectados Todas las etapas tardías de Plasmodium eritrocitos infectados se pueden separar con esta metodología, ya hemozoína que confiere el paramagnetismo en el parásito, es un metabolito común al género. Una alta parasitemia (3-10%) en cultivo se recomienda para obtener mejores rendimientos con este protocolo, aunque una cultura típica contiene 2-4% de hematocrito (porcentaje en volumen de células rojas de la sangre) y 1-8% de parasitemia (porcentaje de infectados las células rojas de la sangre). Los parásitos pueden ser cultivados como se describe por Trager y Jansen 1. <ol><li> A simple, multi-parte de configuración debe estar montado para cada procedimiento de aislamiento de esquizontes. Para ello, las columnas LS, un separador magnético y un midiMACS MultiStand MACS de Miltenyi Biotec (Figura 1 </strong&gt;) se utilizan. En primer lugar, coloque el separador magnético para el soporte de metal y luego coloque la columna magnética en el separador. </li><li> En un tubo separado (utilizar 50 ml cónicos largo), mezclar 23,2 ml de RPMI 1640 y 750 l de bicarbonato sódico al 7,5% para crear la solución de trabajo. Tienen tubos adicionales en la mano para recoger y desechar el flujo a través de la cultura parásito. </li><li> Añadir 3 ml de la solución de trabajo a la columna para que se equilibren, y desechar el flujo a través de un tubo. </li><li> Añadir 8 ml de la P. falciparum cultura a la columna, asegurándose de que tan pronto como la última parte de la solución de trabajo ha sido empujado fuera de la columna por la cultura, el tubo receptor se sustituye por el de recogida para comenzar la recuperación de la cultura no unido. Esto es necesario para evitar diluir el cultivo más allá. </li><li> Una vez que el flujo de la cultura a través de la columna ha cesado, añadir 1 ml de la solución de trabajo para empujar los glóbulos rojos que quedan fuera de la columna. </li><li> Etapa de lavado: Añadir otra ml 3 de la solución de trabajo a la columna y recoger el líquido que fluye en el &quot;descarte&quot; tubo a fin de evitar la dilución de la cultura que se guarda como de flujo a través en el otro tubo. </li><li> La elución: Una vez que el 3 ml han pasado a través de la columna, separar este último del soporte y colocarlo en la parte superior de un tubo de 15 ml. </li><li> Una vez más, añadir 3 ml de solución de trabajo a la columna. Este paso se eluye de los eritrocitos infectados con parásitos de etapa tardía que quedaron atrapados en las cuentas de la columna. </li></ol> Nota: En este punto, y en función de la cantidad de parásitos necesario, iniciar otra ronda / s de recogida, obviamente, sujeto a los límites de la parasitemia en el cultivo original. La columna se puede reutilizar siempre y cuando el flujo mantiene un estado estacionario. <ol start="9"><li> La concentración de los parásitos recogidos: Se centrifuga el tubo de 15 ml que contiene el eluido durante 5 minutos a 150 xg, a temperatura ambientepara formar un sedimento oscuro de los eritrocitos parasitados. </li><li> Eliminar el sobrenadante dejando suficiente líquido para tomar una pequeña muestra y determinar la concentración y el rendimiento total a través de microscopía (Ver paso 2). </li><li> En este momento, si el aislamiento y la captura de los parásitos en fase tardía se realiza satisfactoriamente, incubar el cultivo recogido de nuevo con medio fresco. </li><li> Diluir los parásitos recogidos en el volumen y la solución necesaria para los experimentos posteriores. </li></ol> 2. Pureza y Análisis de Rendimiento <ol><li> Comprobar la concentración de parásitos obtenidos mediante el uso de un hemocitómetro y recuento bajo un microscopio de luz. Para contar, añadir 10 l de la mezcla de los parásitos recogidos y medios de comunicación bajo el cubreobjetos del hemocitómetro. Contar el número de parásitos en los cuatro cuadrantes del hemocitómetro y se dividen por el número total 4. Multiplicar este número por 10 4 para obtener la concentración de e infectadarythrocytes por ml. </li></ol> Notas: a) La concentración de la mezcla será decidido por el usuario en el momento de la resuspensión del sedimento, mediante la adición de más o menos medio. Una concentración de trabajo que se sugiere es de 5,5 x 10 4 schizontes por microlitro (esto normalmente se logra mediante la adición de 100-300 l de los parásitos recogidos). Si 20 l de esta concentración se añade a un volumen final de 100 l de mezcla de medios de comunicación y eritrocitos, una parasitemia de aproximadamente 1% en un cultivo típico hematocrito 4% se obtendrá. b) Contar en el hemocitómetro tiene que ser rápido, ya que los eritrocitos iniciar lisis como se seca la muestra dentro de la cámara. Eritrocitos infectados, que deben ser la mayoría, se mostrará una mancha oscura en el interior, lo que los diferencia de los no infectados. <ol start="2"><li> Realizar una Giemsa en capa fina tinción para evaluar la pureza de la recogida mediante la fijación de las diapositivas muy rápidamente en 10% de metanol, secado, y sumergiendo tdobladillo en una solución de 20% de tinción de Giemsa diluido con agua destilada. Teñir los portaobjetos durante 10 min, después de lo cual se puede secar por aire y se examina bajo el microscopio. Un parasitemia muy por encima de 70% deben ser alcanzables. </li></ol>

<ol><li>Jensen, J. B., Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+in+culture%3A+use+of+outdated+erythrocytes+and+description+of+the+candle+jar+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method.</a> J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).</li>
<li>Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+hemoglobin+degradation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway.</a> J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).</li>
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<li>Hebbel, R. P., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+heme+interaction+with+the+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane.</a> Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).</li>
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<li>Hempelmann, E., Marques, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+malaria+pigment+from+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).</li>
<li>Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+ferriprotoporphyrin+IX+in+malaria+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment.</a> J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).</li>
<li>Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+degradation+in+malaria-infected+erythrocytes+determined+from+live+cell+magnetophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis.</a> FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).</li>
<li>Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+invasive+capabilities+of+Plasmodium+falciparum+schizonts+isolated+by+Percoll+gradient+or+using+magnetic+based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation.</a> Malaria J. 10, 96(2011).</li>
<li>Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+of+the+host+cell+membrane+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+with+streptolysin+O+and+equinatoxin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II.</a> Biochem. J. 403, 167-175 (2007).</li>
<li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).</li>
<li>Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+viable+schizont-infected+red+cells+of+Plasmodium+falciparum+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).</li>
<li>Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+cells+and+subcellular+particles+with+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).</li>
<li>Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+malaria-infected+erythrocytes+from+whole+blood%3A+use+of+a+selective+high-gradient+magnetic+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique.</a> The Lancet. 318, 70-71 (1981).</li>
<li>Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+concentration+of+malarial+parasite-infected+red+blood+cells+and+removal+of+contaminating+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells.</a> Malar. J. 3, 7(2004).</li>
<li>Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+separation+of+uninfected+erythrocytes+from+those+infected+with+Plasmodium+berghei+and+for+isolation+of+artificially+released+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Parasitenkd%22%5BJournal%5D)">A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites.</a> Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Los cultivos in vitro del parásito de la malaria P. falciparum presentan una parasitemia limitada, con más de la mitad de las células rojas de la sangre infectadas en el punto más alto de la proliferación de cultivo. Para la mayoría de los experimentos de investigación, es deseable para trabajar sólo con los eritrocitos infectados. Con este fin, una técnica de separación es necesario dividir el cultivo de acuerdo a la infección. Los métodos útiles incluyen el uso de estreptolisina O para perme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Hepes modificado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130 </td><td> Suplementado con 10% de suero humano, 2% de glucosa, y 0,2% de bicarbonato de sodio </td></tr><tr><td> MidiMACS Separador </td><td> Miltenyi Biotec MACS </td><td> 130-042-302 </td><td></td></tr><tr><td> MACS MultiStand </td><td> Miltenyi Biotec MACS </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> Columnas LS </td><td> Miltenyi Biotec MACS </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Grafco </td><td> Grafco Cámara Neubauer </td><td> Se puede encontrar a través de muchos otros proveedores </td></tr></tbody></table>

separación de los<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt; late stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

A diferencia de otras especies de Plasmodium, P. falciparum pueden ser cultivados en el laboratorio, lo que facilita su estudio 1. Mientras que la parasitemia alcanzado puede alcanzar el límite de ≈ 40%, el investigador normalmente impide que el porcentaje en torno al 10%. En muchos casos es necesario aislar las células rojas de parásito que contienen la sangre (glóbulos rojos) de los no infectados, para enriquecer la cultura y proceder con un experimento dado. Cuando P. falciparum infecta los eritrocitos, el parásito se degrada y se alimenta de hemoglobina 2, 3. Sin embargo, el parásito debe tratar con un resto hemo muy tóxico que contiene hierro 4, 5. El parásito elude su toxicidad mediante la transformación del hemo en un polímero de cristal inerte llamada haemozoin 6, 7. Esta molécula que contiene hierro se almacena en su vacuola alimentaria y el metal en él tiene un estado de oxidación que difiere de la de hemo 8. El estado férrico de hierro en el grupo hemoozoin le confiere una propiedad paramagnética ausente en los eritrocitos no infectados. Como el parásito invasor alcanza la madurez, el contenido de haemozoin 9 también aumenta, lo que confiere paramagnetismo aún más en las últimas etapas de P. falciparum en el interior de los eritrocitos. En base a esta propiedad paramagnética, las últimas etapas de la P. falciparum infectados células rojas de la sangre pueden ser separadas haciendo pasar la cultura a través de una columna que contiene perlas magnéticas. Estas perlas se vuelven magnéticos cuando las columnas contienen se coloca en un soporte de imán. Eritrocitos infectados, debido a su paramagnetismo, entonces quedará atrapado en el interior de la columna, mientras que el flujo a través contendrá, en su mayor parte, los eritrocitos no infectados y aquellos que contienen etapas tempranas del parásito. Aquí, se describe la metodología para enriquecer la población de parásitos en fase tardía con columnas magnéticas, lo que mantiene la viabilidad del parásito buena 10.Después de realizar este procedimiento, la cultura no unida puede ser devuelto a una incubadora para permitir que los parásitos restantes para continuar creciendo.

En la Figura 2, el cultivo pasa a través de la columna magnética se muestra, antes (A) y después del procedimiento (B). Una a dos eritrocitos infectados se ven generalmente en un campo de aumento de 100X, como se muestra en la Figura 2, con las flechas apuntando a los eritrocitos infectados en la Figura 2A. En un procedimiento típico, a partir de un cultivo a 5% de parasitemia (Figura 2A), el rendimiento de este procedi...

Las propiedades paramagnéticas de hemozoína se utilizan para aislar las últimas etapas de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infectados glóbulos rojos que crecen en cultivo. El método es simple y rápido y no afecta a las capacidades invasivas posteriores de los parásitos.

Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Plasmodium falciparum es un parásito humano que vive exclusivamente dentro de los glóbulos rojos. En el proceso de crecimiento, utiliza las moléculas dentro de los eritrocitos para alimentarse de ellas, y dado que las moléculas de hierro dentro de la hemoglobina serían tóxicas para el parásito, las toma y las convierte en un cristal inerte llamado hemina. Este cristal de hemo confiere cierta paramagnetismo a los parásitos.Es esta propiedad paramagnética la que se utiliza para separar eritrocitos infectados de aquellos que no portan un parásito en su interior. Con el uso de un imán, se puede concentrar un cultivo que tiene un porcentaje muy bajo de parásitos hasta alcanzar casi un cien por cien de parasitemia. Esta separación de eritrocitos infectados de los no infectados es muy deseable en una serie de experimentos en los que se necesita estudiar un rasgo particular del parásito sin los factores de confusión derivados del exceso de eritrocitos.La metodología mostrada aquí es rápida, sencilla e inofensiva para el parásito. Hoy describiremos el procedimiento de separación de Plasmodium falciparum en la etapa chizen. Este equipo de múltiples componentes debe ensamblarse para cada aisl

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Immunology and Infection

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Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Este método investiga el fenotipo de aglutinación de plaquetas mediada...

Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrocitos&gt; por el VIH en un recurso pobre ajuste

Este video muestra un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo que involucra eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum marcados y opsonizados por monocitos. La citometría de flujo identifica la fluorescencia en los monocitos, lo que confirma la identificación exitosa de eritrocitos opsonizados a través de la fagocitosis.

Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

Función de medición de anticuerpos es la clave para la comprensión de la inmunidad a la malaria Plasmodium falciparum. Este método describe la purificación de merozoitos viables, y la medición de la opsonización dependiente de la fagocitosis mediante citometría de flujo.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Los microRNAs humanos se translocan de los eritrocitos del huésped a los parásitos Plasmodium falciparum. En este trabajo se describen las técnicas utilizadas para transfectar microRNAs sintéticos en eritrocitos del huésped y aislar todos los RNAs de P. falciparum.  Además, en este trabajo se detallará un método de aislamiento de polisomas en P. falciparum para determinar la ocupación ribosómica y el potencial traduccional de los transcritos de parásitos.

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

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Aprende a separar eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum en estadios tardíos mediante separación magnética basada en la propiedad paramagnética de la hemozoina. Este método eficiente preserva la capacidad invasiva de los parásitos.

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