Name: PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y In vitro Propiedades antimicrobianas de PRP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprende a preparar plasma rico en plaquetas con concentración estandarizada y evaluar sus propiedades antimicrobianas in vitro. Este método reduce significativamente las unidades formadoras de colonias bacterianas.

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Los autores agradecen a Therwa Hamza, John E. Tidwell, Clovis Nina, y Suzanne Smith para la asistencia experimental y Suzanne Smith para corrección de pruebas. Los autores también agradecen a John Thomas, PhD para la prestación de los aislados bacterianos clínicos y John B. Barnett, PhD, por su apoyo y el uso del laboratorio de seguridad biológica en el Departamento de Microbiología, Inmunología y Biología Celular en la Universidad de Virginia Occidental. Los autores agradecen el apoyo financiero de la Osteosíntesis y Trauma Care Foundation y la National Science Foundation (# 1003907). Microscopio experimentos y análisis de imagen se realizaron también en el West Virginia University Fondo Imaging, que es apoyado en parte por el Mary Babb Randolph Cancer Center y el NIH subvención P20 RR016440. El uso de animales para la extracción de sangre fueron aprobados por el Cuidado de Animales Universidad West Virginia institucional y el empleo. Todos los experimentos fueron ejecutadas en conformidad con todas las guidelin relevanteEs, regulaciones y agencias reguladoras.

1. Preparación y activación de PRP 1.1 Extracción de sangre <ol><li> Anestesiar conejo por inhalación de isoflurano (2% en O 2 para la inducción y 1% para el mantenimiento). </li><li> Dibujar 2 ml 0,129 M citrato trisódico (una solución anticoagulante) en una jeringa de 20 ml. La solución de citrato tri-sódico se prepara disolviendo 1,897 g de tri-citrato de sodio en 50 ml de H 2 O destilada y filtrar con un filtro de 0,22 micras estéril. </li><li> Esterilizar la oreja del conejo utilizando 70% de etanol. </li><li> Extraer la sangre (por ejemplo, 5 ml) de la vena de la oreja de conejo a través de una aguja de mariposa (25 G) conectado a la jeringa. </li><li> Mezclar la sangre con la solución de citrato de tri-sodio por agitación suave. La relación de volumen de sangre y tri-sodio solución de citrato es de 9:1. </li></ol> 1,2 PRP preparación (Figura 1) <ol><li> Transferir la sangre anticoagulada a un tubo de 50 ml de centrífuga de plástico. Tomar una alícuota de 10 lde sangre para determinar el recuento de plaquetas basal utilizando hemocitometría. </li><li> Se centrifuga la sangre a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) en una centrífuga con un rotor basculante. Establecer la aceleración y la velocidad de frenado a baja (Figura 1). </li><li> Después de la centrifugación, la sangre se separa en tres capas. La capa inferior es principalmente células de la sangre rojas, la capa media (comúnmente conocido como la &quot;capa leucocitaria&quot;) se compone de concentrados de plaquetas y leucocitos, y la capa superior es principalmente plasma, que es el componente líquido de la sangre, y las plaquetas ( Figura 1). Transportar con cuidado el tubo de centrífuga a una campana de cultivo de células; no molestar las capas. Transferir todo el plasma, capa leucocitaria, y 2-3 mm de espesor capa de glóbulos rojos en un tubo de plástico de 15 ml usando una pipeta de 1 ml de plástico. </li><li> Centrifugar la muestra transferida por segunda vez a 3.000 xg durante 15 min a TA. La capa superior (sobrenadante) se considera plasma pobre en plaquetas (PPP) und es transferido a un nuevo tubo. </li><li> Obtener PRP mediante el ajuste de la concentración de plaquetas en la muestra de sangre restante utilizando PPP para obtener 2,0 x 10 6 plaquetas / l (determinado por hemocitometría). </li></ol> 1,3 PRP activación <ol><li> Preparar la solución de PRP activación mediante la disolución de 5.000 IU trombina bovina con 5 ml de cloruro de calcio 10% a la concentración de trabajo de 1.000 UI / ml. </li><li> Añadir la solución de activación de PRP y PPP, y mezcle la solución pipetear repetidamente para formar PRP y PPP-geles. La relación en volumen de la solución de activación de PRP o PPP es de 1:4. </li></ol> 2. Prueba in vitro a los antimicrobianos de PRP usando el ensayo de Kill curva (Figura 2) <ol><li> El uso de un asa de inoculación estéril, añadir varias colonias de S. aureus a partir de su cultivo en placa durante la noche en 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) en un tubo de plástico. Vórtice brevemente y luego incubar la muestra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, La densidad óptica de los medios de comunicación bacteriana se determinó utilizando un espectrofotómetro y se ajustó a una densidad óptica igual a ~ 1 x 10 8 UFC / ml en base a la curva estándar predeterminado. </li><li> Hacer una dilución de 100 veces utilizando PBS para obtener 1 x 10 6 UFC / ml y colocar el inóculo en hielo. </li><li> Configurar y etiquetar estériles, desechables 5 ml de fondo redondo tubos de poliestireno, y preparar los siguientes grupos de la muestra como se indica en la Tabla 1 para un volumen final de 2 ml en cada tubo. </li><li> Añadir PRP, PPP, o PBS primero a los tubos de poliestireno, seguido por la solución de trombina para la activación (formación de gel). A continuación, agregue MHB y luego la S. inóculos aureus (1 x 10 6 UFC / ml) para obtener la concentración final de 1 x 10 5 UFC / ml. </li><li> Incubar los tubos a 37 ° C con agitación orbital a 150 rpm. </li><li> En los puntos de tiempo predeterminados (por ejemplo, 0, 1, y h 2), mezclar las soluciones en cada tubo mediante pipeteo repetido (estepaso es importante ya que las bacterias pueden ser atrapados dentro del gel de PRP). Tomar 10 l de muestra, diluir en serie con una solución salina estéril al 0,9%, y pipetear una parte alícuota de 100 l de cada dilución en placas en un agar de tripticasa de soja (TSA, con sangre de oveja al 5%) para el recuento de CFU placa. </li><li> Cultura las placas de agar durante la noche a 37 º C, y luego contar y registrar las colonias de las placas. Representan los datos en una escala logarithimic con el tiempo (hr) en el eje X y UFC / ml en el eje y. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Plasma rico en plaquetas se ha usado cada vez más para aplicaciones clínicas debido a sus propiedades de promoción de la cicatrización 15-17. En el presente estudio, el PRP se presenta como un nuevo enfoque para la prevención de infecciones. PRP se encontró que tienen fuertes propiedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, estreptococo del grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Las principales ventajas de PRP, en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos para la prevención d...

Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) es uno de los microorganismos más comunes aislados de infecciones relacionados con el implante. Es capaz de producir una biopelícula que recubre las superficies de implantes y puede conducir a 1,2 infección resistente a antibióticos. El tratamiento de las infecciones asociadas a implantes con frecuencia requiere hospitalización a largo plazo para desbridamientos repetidos y prolongados de terapia antibiótica parenteral. En los casos resistentes a antibióticos, la extracción del implante puede ser necesario. La creciente resistencia de las bacterias a los antibióticos también se ha referido a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) como &quot;uno de los problemas de salud del mundo más urgentes.&quot; Con el tiempo, sin el desarrollo de tratamientos antimicrobianos nuevos y eficaces, es posible que los fármacos múltiples patógenos resistentes será intratable con los antibióticos convencionales. Prevención de implante asociadoinfección es por lo tanto importante y nuevos agentes profilácticos o enfoques son necesarios para la prevención de tales infecciones. Plasma rico en plaquetas (PRP) es una concentración de sangre autóloga que contiene más de 30 factores de crecimiento que pueden ayudar con la curación del hueso y de injerto de hueso 3-5. La aplicación de PRP para la reconstrucción ósea y maduración del tejido blando se ha informa cada vez más en las clínicas debido a su alta concentración de diversos factores de crecimiento liberados por las plaquetas. Varias características de PRP PRP indican que también pueden tener propiedades antimicrobianas 6-9. PRP contiene un gran número de plaquetas, una alta concentración de leucocitos (que puede poseer defensa del huésped-acciones contra bacterias y hongos), y varios péptidos antimicrobianos 7,8,10. En un estudio reciente de una gran cohorte de pacientes quirúrgicos cardíacos, se reveló que el uso intraoperatorio de PRP-gel durante el cierre de la herida significativamente disminuyó la incidencia de infección esternón superficial y profunda 11. Por estas razones y observaciones, la hipótesis de que el PRP, además de sus bien estudiadas promueven la curación de las propiedades, tiene propiedades antimicrobianas. Las ventajas potenciales de la utilización de PRP para prevenir la infección pueden incluir: (i) PRP es menos probable que induzca resistencia en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos. (Ii) PRP también tiene propiedades que favorecen la cicatrización que puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones; curación promotoras de PRP de propiedades podrían proporcionar un sello para evitar la adhesión bacteriana reduciendo así las probabilidades de infección por los patógenos y las células humanas están compitiendo para superficies de implante 12 , 13. (Iii) PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles. Nuestro objetivo a largo plazo es el uso de PRP como un nuevo enfoque para prevenir implante asociada infections. El objetivo de este estudio fue la preparación de PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, para examinar PRP en propiedades antimicrobianas in vitro, y para describir los protocolos para evaluar tales propiedades antimicrobianas.

<table><tbody><tr><td>Trombina bovina</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>Trombina (de origen bovino)</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>Cloruro de calcio al 10% Etanol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Mueller Hinton</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Kendro Productos de laboratorio 750043077</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

prp como un nuevo enfoque para prevenir la infección: preparación y<em&gt; in vitro</em&gt; propiedades antimicrobianas de prp

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implante infección asociada se está volviendo más y más difícil para la industria de la salud en todo el mundo debido a la creciente resistencia a los antibióticos, la transmisión de bacterias resistentes a antibióticos entre animales y seres humanos, y el alto costo de tratamiento de las infecciones. En este estudio, se describen una nueva estrategia que puede ser eficaz en la prevención de las infecciones relacionadas con implante basado en las propiedades antimicrobianas potenciales de plasma rico en plaquetas (PRP). Debido a sus propiedades bien estudiados para promover la curación, PRP (un producto biológico) ha sido cada vez más utilizado para aplicaciones clínicas, incluyendo cirugías ortopédicas, cirugía periodontal y oral, cirugías maxilofaciales, cirugías plásticas, medicina deportiva, etc PRP podría ser una alternativa avanzada a los tratamientos convencionales con antibióticos para prevenir las infecciones asociadas a implantes. El uso de PRP puede ser ventajoso en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos SINCE PRP es menos probable que induzca resistencia a los antibióticos y PRP antimicrobiana y propiedades curativas que promueven puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones. Es bien conocido que los agentes patógenos y las células humanas están compitiendo por superficies de los implantes, y PRP propiedades de curación promoción podría mejorar la unión celular humana reduciendo así las probabilidades de infección. Además, el PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles. Para nuestro estudio, hemos seleccionado varias cepas clínicas de bacterias que se encuentran comúnmente en las infecciones ortopédicas y examinó si PRP tiene propiedades in vitro antimicrobianos contra estas bacterias. Hemos preparado PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, que permite la concentración de plaquetas mismo que debe obtenerse para todas las muestras. Hemos logrado resultados consistentes antimicrobianos y se ha encontrado que el PRP tiene fuerte propiedades in vitro antimicrobianos contra bacterias como methicillin sensible a la meticilina y resistentes a Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Por lo tanto, la utilización de PRP puede tener el potencial para prevenir la infección y reducir la necesidad de un costoso tratamiento post-operatorio de infecciones relacionados con el implante.

PRP se preparó reproducible utilizando un enfoque de centrifugación dos veces (Figura 1). PRP se encuentra a presentar fuerte (hasta 100-veces la reducción de UFC) en las propiedades antimicrobianas in vitro contra S. aureus resistente aureus (MRSA) (Figura 3), que se encuentra comúnmente en los hospitales de todo el mundo 14. Del mismo modo, el PRP tiene fuertes propiedades antimicrobianas en contra de estafilococos sensibles S. aureus...

Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Este estudio describe un enfoque utilizando plasma rico en plaquetas (PRP) para prevenir infecciones relacionados con el implante, presenta el protocolo para la preparación de PRP con concentración de plaquetas constante, e informa de las propiedades antimicrobianas de los recientemente identificados PRP y protocolos relacionados para examinar tales propiedades antimicrobianas<em&gt; In vitro.</em

PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y<em&gt; In vitro</em&gt; Propiedades antimicrobianas de PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar in vitro las propiedades antimicrobianas del plasma rico en plaquetas o PRP. Primero, aíslese el plasma rico en plaquetas de un conejo donante. A continuación, prepárese un inóculo bacteriano, actívese luego el PRP utilizando trombina y mézclese con el inóculo bacteriano.Incube la mezcla, la muestra y mida las unidades formadoras de colonias resultantes. Las propiedades antimicrobianas del PRP se demuestran mediante la reducción de UFC en las muestras tratadas con PRP en comparación con las muestras control. Sin el tratamiento con PRP, el plasma rico en plaquetas tiene menos probabilidades de inducir resistencia al BOL en comparación con los tratamientos convencionales de BOL.También posee propiedades que promueven la cicatrización de heridas, lo que podría tener un efecto sinérg ico en la prevención de infecciones. En el presente protocolo, se realizó un enfoque de doble centrifugación y se normalizó la concentración de plaquetas del PRP a dos veces 10 a la seis plaquetas por aproximadamente 10 veces por encima del valor basal en sangre; se utilizó PRP enriquecido con leucocitos. Dado que los leucocitos también participan en la respuesta inmune directa contra bacterias y en respuestas inmunes específicas contra antígenos, esto podría contribuir a las propiedades antimicrobianas del PRP. Primero, anestesiar un conejo mediante inhalación de isoflurano.Extraiga dos mililitros de citrato de sodio trisódico al 0,129 moles por litro en una jeringa de 20 mililitros. Estérilice la oreja del conejo utilizando etanol al 70 %.Utilizando una aguja tipo mariposa de 25 gauge. Extraiga sangre de la vena del oído del conejo y mezcle la sangre con la solución de citrato de sodio mediante agitación suave. Transfiera la sangre anticoagulada a un tubo de centrífuga plástico de 50 mililitros.Tomar un Eloqua de 10 microlitros de sangre para determinar el recuento inicial de plaquetas mediante citometría hemática en un rotor de balanceo. Establecer la aceleración y la velocidad de frenado en bajas y centrifugar la sangre a 300 G durante 10 minutos. A temperatura ambiente, transportar cuidadosamente el tubo de centrífuga a una cabina de cultivo celular sin alterar las capas.Transfiera todo el hematocrito plasmático y una capa de glóbulos rojos de dos a tres milímetros de grosor a un tubo plástico de 15 mililitros. Centrifugue la muestra transferida a 3000 G durante 15 minutos. A temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante de plasma pobre en plaquetas a un tubo nuevo.Obtenga plasma rico en plaquetas ajustando la concentración de plaquetas en la muestra sanguínea restante con PPP para obtener dos veces 10 de las seis plaquetas por microlitro, según se determinó mediante citometría hemática a partir de una placa de agar sangre sembrada durante la noche con S reus. Inocule cinco colonias en cinco mililitros de caldo Mueller Hinton y vortexee. Afloje la tapa e incube durante dos horas a 37 grados Celsius.Lea la densidad óptica utilizando un espectrofotómetro. Ajuste el inóculo a una densidad óptica basada en la curva estándar predeterminada. Realice una dilución de 100 veces en PBS para obtener uno por diez a la seis UFC por mililitro y coloque el inóculo en hielo.Prepare y etiquete tubos estériles descartables de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Para los grupos de muestras según se indica, agregue primero P-R-P-P-P-P o PBS. Luego agregue la solución de trombina para la activación.A continuación, agregue caldo Mueller-Hinton y luego los inóculos de ESU para obtener una concentración final de uno por diez a la quinta UFC por mililitro. Incube los tubos a 37 grados Celsius con agitación orbital a 150 RPM en puntos de tiempo predeterminados. Mezcle las soluciones en cada tubo para asegurar que las bacterias no queden atrapadas dentro del gel de PRP.Tome 10 microlitros de cada muestra. Diluya en serie con solución salina estéril al 0,9 % y pipetee 100 microlitros de cada dilución sobre una placa de agar de soya triptica. Incube las placas de agar durante la noche a 37 grados Celsius para el recuento de UFC.Luego cuente y registre las colonias de la placa. Represente los datos en una escala logarítmica con el tiempo en el eje X y UFC por mililitro. En el eje Y, el plasma rico en plaquetas se prepara de forma reproducible utilizando un enfoque de doble centrifugación.El PRP tiene fuertes propiedades antimicrobianas contra varias bacterias, incluyendo *Staphylococcus aureus* sensible y resistente a la meticilina, estreptococo del grupo y gonorrea por RIA en puntos temporales de una y dos horas. Las bacterias MRSA se encuentran comúnmente en hospitales de todo el mundo. Este ensayo de eliminación muestra.El PRP presenta fuertes propiedades antimicrobianas in vitro frente al MRSA en los tiempos de una y dos horas. El análisis cuantitativo indica una reducción de hasta 100 veces en UFC al usar PRP en comparación con los controles de PPP y PBS a la hora de incubación. Las extensiones puntuales de sangre de PRP preparadas mediante el método de doble centrifugación tienen aproximadamente 10 veces más plaquetas que la sangre completa, lo que facilita resultados consistentes y reproducibles.El número y la calidad de las plaquetas son los factores clave que influyen en el éxito de este experimento. Siguiendo este procedimiento, pueden evaluarse otras cepas bacterianas y el PRP puede examinarse también in vivo para explorar sus propiedades antimicrobianas en modelos de infección animal tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del PRP exploraran el uso potencial del PRP en la prevención de infecciones y en la promoción de la cicatrización de heridas en entornos animales y clínicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí, se presenta el ensamblaje de quimeras mediante la recuperación de plásmidos y la inserción en el sitio de enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo basado en la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas y recuperación funcional de plásmidos. Este protocolo es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

Este trabajo pretende describir las inyecciones interfollicular plasma rico en plaquetas autólogo (0,20 mL x cm2) en el cuero cabelludo de los 23 pacientes afectados por la alopecia androgenética a una profundidad de 5 mm utilizando una pistola inyector médica equipada con una aguja de 30 calibre, en tres sesiones.

Inyecciones de PRP mecánica y controlados en pacientes afectados por la Alopecia Androgenética

El protocolo presenta la Escherichia coli-basado presión selectiva incorporación de aminoácidos no-canónico (ncAAs) el lactococcal péptidos antimicrobianos nisina. Sus propiedades pueden cambiarse durante la expresión recombinante mediante sustitución con ncAAs deseado en medios de crecimiento definido. Cambios resultantes en la bioactividad se asignan por ensayos de inhibición de crecimiento y microscopía de fluorescencia.

Péptidos antimicrobianos producidos por presión selectiva incorporación de aminoácidos no-canónico

Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

Este protocolo presenta un dispositivo que produce PRP para impulsar la expansión in vitro de las células en un sistema de cultivo de fibroblastos 100% autólogo.

Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos

Este protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar el alcance de la internalización de Staphylococcus aureus y su capacidad para sobrevivir dentro de la célula huésped humana, así como la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos.

Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de Staphylococcus aureus y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos

Presentamos cuatro métodos para evaluar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas utilizando técnicas in vitro . Estos métodos se pueden adaptar para estudiar las interacciones de diferentes nanopartículas y superficies nanoestructuradas con una amplia gama de especies microbianas.

Evaluación de las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas in vitro

El protocolo resume las mejores prácticas para minimizar la carga biológica microbiana en un entorno de sala limpia e incluye estrategias como el monitoreo ambiental, el monitoreo de procesos y las pruebas de esterilidad del producto. Es relevante para las instalaciones de fabricación y prueba que deben cumplir con los estándares actuales de buenas prácticas de tejidos y los estándares actuales de buenas prácticas de fabricación.

Control microbiano y estrategias de monitoreo para ambientes de salas limpias y terapias celulares

Falta un método para evaluar las áreas de uso común en entornos de laboratorio para detectar la contaminación priónica y una descontaminación efectiva. El protocolo descrito aquí proporciona los fundamentos clave para implementar una prueba de deslizamiento de seguridad priónica de laboratorio que se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades individuales de laboratorios específicos.

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción...

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

Aprende a preparar plasma rico en plaquetas con concentración estandarizada y evaluar sus propiedades antimicrobianas in vitro. Este método reduce significativamente las unidades formadoras de colonias bacterianas.

PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y

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