Name: Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a ensamblar arrays nucleosómicos con histonas core recombinantes y ADN posicionador para estudiar estructura cromatínica. Este método utiliza ultracentrifugación y microscopía de fuerza atómica para evaluar la saturación y organización de nucleosomas.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones GM45916 y GM66834 a JCH, y una beca de la Fundación Internacional del Síndrome de Rett a AK Este trabajo también fue apoyado por el NIH subvención GM088409 y el Instituto Médico Howard Hughes contribuciones a KL

1. Asamblea de recombinantes Core histonas en octamers Justificación: El primer paso para la reconstitución array nucleosomal es preparar octamers histonas nativas de histonas recombinantes liofilizadas. Las proteínas histonas se combinan en cantidades molares iguales y se montan en octámeros histonas dializando las muestras de un tampón desnaturalizante en tampón de replegamiento. <ol><li> Purificar y liofilizar histonas del núcleo recombinantes (H2A, H2B, H3, H4) como se describe 13. </li><li> Disolver aproximadamente 5 mg de cada núcleo de histonas liofilizado en 3 ml de tampón de desarrollo (6 M de guanidina HCl, 20 mM de Tris pH 7,5, DTT 5 mM). Permitir que cada alícuota para disolver durante al menos una hora. Asegúrese de que ninguna proteína permanece en los lados del recipiente. </li><li> Medir la absorbancia de cada histona a 276 nm usando tampón de desplegamiento como una referencia. </li><li> Calcular la molaridad de cada histona utilizando sus coeficientes de extinción (Ver Tabla 1 </strong&gt; para Xenopus coeficientes de extinción de histonas). Comparar la concentración de absorbancia determinado de la histona al peso seco liofilizado, y estimación de si se disuelve la mayor parte de la proteína. </li><li> Determine qué histona usted tiene los topos menor cantidad de, ya que este será el número limitante de moles de todos los histonas. </li><li> Combinar las histonas en cantidades molares iguales y se diluye con tampón de desarrollo a una concentración final de 1 mg / ml. </li><li> Colocar la muestra en un tubo de diálisis de 6-8 kDa MWCO. Sellar el tubo y colocar en 2 L de tampón de replegamiento frío (NaCl 2 M, Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, 5 mM β-mercaptoetanol). </li><li> Se dializa la muestra durante 18 horas a 4 ° C con agitación. Asegúrese de que el tubo de diálisis puede girar libremente y vigorosamente, o bien las histonas puede precipitar. </li><li> Cambiar el tampón de diálisis dos veces en el período de 18 horas (es decir, cambiar el tampón de replegamiento sobre cada 6 horas hasta que esté hecho). Incluso si se forma precipitado no descartanla muestra, algunos octámero se puede recuperar aunque el rendimiento se reducirá. </li></ol> Nota: Consulte el paso 2.1-2.2 para preparar equilibrado de la columna para el día siguiente. 2. Purificación de histonas octamers por tamaño Cromatografía de exclusión Justificación: Después de concluir con la sección 1, las muestras contendrán octamers histonas, así como otros complejos de histonas como agregados, tetrámeros H3/H4 y dímeros H2A/H2B. Octámeros histonas se pueden purificar lejos de estos otros complejos usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). <ol><li> Conecte un HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) la columna a un sistema de FPLC. Asegúrese de que las burbujas de aire no entran en el sistema. </li><li> Limpie la columna de la S200 con 0,2 m de agua filtrada. Utilice una velocidad de flujo de 0,3 ml / min y establecer un límite de contrapresión de 0,5 MPa. Asegúrese de que tiene suficiente agua y permitir que la columna de limpiar toda la noche. </li><li> Equilibrar la columna y de muestreo del lazo S200 de la FPLC mediante tampón de replegamiento. Utilice 1 L de 0,2 micras tampón de replegamiento filtrada. Flujo tampón de replegamiento a través de la columna a una velocidad de 1 ml / min y una presión máxima de 0,5 MPa durante aproximadamente 2 h. </li><li> Equilibrar un concentrador centrífugo Vivaspin (50 kDa MWCO) con 1 ml de tampón de replegamiento. Sacar la prueba del tubo de diálisis y centrifugar la muestra a 4 ° C para eliminar cualquier precipitado. Pipetear el sobrenadante de la muestra en el concentrador. Concentrar la muestra hasta un volumen de aproximadamente 500 l. </li><li> Retire la muestra octámero concentrada a un nuevo contenedor y enjuague el concentrador con 1 ml tampón de replegamiento. Se concentra el enjuague hasta 500 l, y agregarlo a la muestra octámero. Esto ayuda a salvar cualquier octámero restante en el concentrador. </li><li> Haga girar la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 5 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. Esto ayuda a eliminar cualquier precipitado antes de cargar la muestra en el FPLC. </li><li> Cargue la muestra en la columna de la S200. Cargue un máximo de 1,5 ml de volumen total o 15 mg octámero en una sola purificación. </li><li> Se eluye la muestra utilizando tampón de replegamiento recién hecho. Utilice una velocidad de flujo de 1 ml / min y un límite de presión de vuelta de 0,5 MPa. Utilice dos volúmenes de columna (400 ml) tampón de replegamiento y recoger fracciones de 2 ml. Supervisar la absorbancia a 280 nm durante la elución. Las diferentes especies se eluir en orden decreciente de tamaño. Agregados histonas generalmente eluyen a aproximadamente 45 ml, octamer en alrededor de 65 ml, y de dímero en alrededor de 84 ml (Figura 1). </li><li> Analizar las fracciones de elución de los picos de interés mediante la ejecución de las muestras en un 18-20% de SDS-PAGE. Las fracciones que contienen octamers purificadas deben tener cantidades molares iguales de las cuatro proteínas histonas (Figura 1). </li><li> Reunir las fracciones que contienen octámeros purificados, y concentrar a ≤ 15 mg / ml con un filtro centrífugo Vivaspin. Si diluida izquierda, octamers pueden disociar idímeros y tetrámeros nto H2A/H2B H3/H4. </li><li> Determinar la concentración de octámero por la medición de la absorbancia a 280 nm y calcular utilizando el coeficiente de extinción de la Tabla 1. </li><li> Octamers histonas pueden mantenerse a corto plazo en el tampón de replegamiento a 4 ° C. Si está almacenado a largo plazo, los octámeros serán más estables a -20 ° C y en una solución de glicerol al 50%. Octamers almacenados en glicerol deben dializaron en tampón de replegamiento fresco antes de las mediciones de absorbancia y uso en reconstrucciones de matriz nucleosomales. </li></ol> 3. Reconstitución de nucleosomal matrices de ADN y se purificó octamers Justificación: La reconstitución de nucleosomal arrays requiere que octamers histonas y ADN molde se combinan en proporciones molares específicos. Las mezclas de ADN y las histonas octámeros en NaCl 2 M son paso dializaron en tampones de fuerza iónica decreciente. Un cambio gradual a la sal inferior asegura la formación de nucleosomas adecuada. La obtención de nmatrices ucleosomal con el nivel deseado de saturación de octámero de histona del ADN molde requiere pequeñas reconstituciones de prueba a escala seguido de una reconstitución preparativa a gran escala. Las condiciones apropiadas definidas por las reconstituciones pequeña escala se utilizan para guiar la reconstitución preparativa. <ol><li> Se purifica ADN de posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem como se describe 4,12. Brevemente, aislar el ADN plásmido usando un kit de Qiagen GigaPrep o un producto similar. Establecer un enzima de restricción digerir con el fin de liberar el ADN plantilla y digerir el ADN plásmido a tamaños más pequeños (≤ 700 pb). La plantilla de ADN puede entonces ser purificado lejos de los pequeños restos de ADN plásmido utilizando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Una columna por gravedad, con una altura de unos 115 cm llenas de perlas Sephacryl S-1000 es suficiente para la purificación de 601 x 207bp DNA 12mer. </li></ol> Notas: Para la purificación de ADN plásmido a un costo disminuyó, pero aumentó efORT, uno puede utilizar lisis alcalina con la purificación de ADN con fenol / cloroformo con el fin de aislar el ADN plásmido a partir de E. coli 23,24. Estrategias para la separación de la plantilla de ADN de plásmido de ADN puede variar con cambios en la plantilla de tamaño de ADN. Para la SEC, es importante establecer la enzima de restricción digerir de una manera que maximiza la diferencia de tamaño entre la plantilla y el ADN plásmido. <ol start="2"><li> Determinar qué relaciones molares (r) a utilizar para la reconstitución. R es igual a la relación de moles de octámero a moles de repetición de ADN. Para los ensayos iniciales a pequeña escala, los valores de r de 0,9, 1 y 1,1 son apropiados si la intención es obtener matrices nucleosomal saturados. </li><li> Preparar las muestras a pequeña escala mediante el cálculo de la cantidad de octámero añadir a aproximadamente 18 mg de ADN para cada relación molar a probar. Mezclar el ADN y las histonas octamers. La concentración final de NaCl en la muestra debe ser ≥ 2 M, y la concentración final de DNA debe estar alrededor de 0,3 mg / l. Las condiciones de tampón de muestra finales también deben incluir 10 mM de Tris pH 7,8, y EDTA 1 mM. </li><li> Las muestras están ahora listas para la diálisis. Cargar las muestras en tubos de diálisis 12k-14k MWCO. Dializar las muestras contra 2 l de tampón de fuerza iónica decreciente de la siguiente manera. </li></ol> Componentes en todos los búferes: 10 mM de Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Buffer 1 (añadir NaCl 1 M, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 2 (añadir NaCl 0,75 M, DTT 1 mM) durante la noche. Buffer 3 (añadir NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 4 (añadir NaCl 2,5 mM, 0,1 mM PMSF) durante la noche. <ol start="5"><li> Retirar las muestras de los tubos de diálisis y proceder a secciones de 4-6. Si las muestras a pequeña escala producen los resultados deseados, repetir los pasos de las secciones 3-6 en la gran escala. </li></ol> Nota: Con el fin de conservar los recursos, las muestras a pequeña escala deben tener el volumen mínimo necesario para ser suficiente para ensayos de selección de aguas abajo. Con el fin de tener correonough muestra para los experimentos de velocidad de sedimentación y AFM enumerados aquí, 50 l de muestras de ADN en 0.3 mg / ml son apropiados. El tamaño de gran escala, muestras preparativas dependen de su uso previsto. Una muestra a gran escala se debe preparar de la misma manera que las muestras a pequeña escala. 4. Análisis de la velocidad de sedimentación de reconstituido nucleosomal arrays Justificación: Sedimentación experimentos de velocidad en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica Beckman XL-A / I sobre el tamaño y la forma de las moléculas en solución. Experimentos de velocidad de sedimentación realizados en condiciones de baja sal se utilizan para determinar el grado en que las matrices reconstituidas se saturan con nucleosomas. <ol><li> Diluir la muestra a una absorbancia alrededor de 0,5 a 260 nm usando tampón TEN (Tris 10 mM pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Carga de 400 l de muestra en una cubeta con una pieza central de dos sectores, con la muestra en un lado y la refeCe (tampón TEN) en el otro 25. Mantenga el menisco de referencia más altos que el menisco de la muestra (es decir, añadir la solución de referencia l 420). </li><li> Cargar las células en el rotor, y alinear las células adecuadamente utilizando las marcas de hash en la parte inferior de las células y el rotor 25. El polvo con cuidado las lentes de las células por medio de aire comprimido. </li><li> Encienda la centrífuga XL-A/XL-I, inserte el rotor, y fije y asegure la óptica como se describe en el manual. Abra el software proteoma Lab y seleccione el archivo: nuevo. </li><li> Configurar una sola corrida de exploración en 3000 rpm y una temperatura de 25 ° C. En Opciones, seleccione la parada después de la última exploración, y la calibración de desviación radial (radial calibración no es necesaria si el rotor fue el último rotor utilizado en el AUC). </li><li> Para cada celda, el nombre de las muestras, seleccione una longitud de onda (260 nm), seleccione absorbancia, y elija una ubicación para guardar el archivo en su computadora. Comience la única prueba de exploración. </li><li> Utilice el ciclo individual para determinar el ra apropiadamarcar la longitud de análisis (Figura 2A). La disminución de la longitud de la célula que se digitalizará disminuye el tiempo de ejecución. Sin embargo, asegúrese de incluir el menisco de la muestra y se extienden al final muy cerca de, o en la parte inferior de la celda. </li></ol> Nota: los análisis individuales permiten que el área de medición para ser acortado por mediciones comenzando justo antes de que el menisco de la muestra (Figura 2A). La mayoría de las exploraciones generadas durante la ejecución de la AUC debe tener fracciones de límites últimos del menisco, así como mesetas estable (Figura 2B). Lentes sucias en las células de las AUC pueden generar imágenes escaneadas con grandes picos, estos pueden afectar el análisis de los datos. El software UltraScan incluye un manual que es un gran recurso para obtener información sobre el análisis de los datos de ultracentrifugación analítica 26. <ol start="7"><li> Uso del panel de control XL-A/XL-I, introduzca una velocidad de 0 y pulse Iniciar. Esto hará que la cámara de centrífuga para tirar de un vacío y todoOW la temperatura de la cámara se equilibre. Espere 1 hora para permitir el equilibrio de temperatura antes de empezar a correr. </li><li> Utilice el software para establecer el plazo para la velocidad y el número de análisis deseado. Las velocidades más altas aumentan la resolución, pero uno debe recoger al menos 20 exploraciones (preferiblemente más) antes de que la muestra ha sedimentado a la parte inferior de la celda. Es conveniente superponer las últimas exploraciones realizadas (en el menú de opciones) con el fin de monitorear el progreso de la carrera y ver si hay problemas potenciales, tales como las células con fugas. Monitorear el primer par de scans para garantizar un funcionamiento correcto. </li></ol> 5. Edición y análisis de datos de la velocidad de sedimentación Justificación: datos de la velocidad de sedimentación Raw deben ser analizados por un programa que produce una distribución coeficiente de sedimentación de difusión corregido. Esta información, a su vez indica la fracción de una muestra reconstituida que contiene un nivel de saturación dada, por ejemplo, </em&gt; si el uso de una plantilla de ADN de 12-mer que será posible determinar la fracción de matrices reconstituidas que tiene 10, 11 y 12 nucleosomas / ADN. <ol><li> Utilice AUC software de análisis de datos, tales como UltraScan para editar los datos 26. Edición de los datos de exploración se debe hacer para cada celda y se crea un conjunto de datos para su posterior análisis. Edición adecuada de exploraciones implica la definición de los meniscos de la muestra, la reducción de los datos a una región de interés, y la definición de la línea de base, así como regiones de meseta (Figura 2). Análisis no deseados también se pueden eliminar de los datos que figuran en este punto. Sin embargo, ya que es posible eliminar las exploraciones no deseados durante el análisis, se recomienda que todos los análisis se mantendrán en este punto. </li><li> Es muy recomendable que la furgoneta método Holde-Weischer mejorada puede utilizar para analizar los datos de 27. Este método de análisis corrige los efectos de la difusión en el transcurso de la carrera y se obtiene la distribución integral de los coeficientes de sedimentación. En particular, El método Holde-Weischer mejorado van (como se aplica en UltraScan) permitirá la inclusión de las exploraciones que carecen de mesetas estables, o que contienen fracciones de límites que no se han debitado el menisco en el análisis 28. </li><li> Determinar la distribución de los coeficientes de sedimentación para las matrices de ensamblados. Los resultados representativos para 601-12 (207bp, 12-mer) nucleosomal arrays se muestran en la Figura 3. </li><li> Si una de las muestras a pequeña escala contiene matrices con el rango deseado de coeficientes de sedimentación, a continuación, repita el proceso en mayor escala a partir de la sección 3. Entonces, si ninguna de las muestras a pequeña escala tiene una distribución adecuada de los coeficientes de sedimentación repetir las pruebas a pequeña escala con una nueva gama r a partir de la sección 3. </li></ol> 6. Visualizar Nucleosomal matrices mediante Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) Justificación: AFM permite la visualización del nivel de saturación del nucleosomal matrices. Esta técnica complementa la velocidad de sedimentación por el AUC y la digestión con enzimas de restricción como un ensayo de control de calidad. <ol><li> Usando métodos descritos anteriormente, obtener una matriz de nucleosoma bien saturado (Figura 5A). </li><li> Preparar APTES tratados diapositivas de mica mediante la colocación de ~ 30 l de dilución 1:1.000 de comercial (Sigma-Aldrich (3-aminopropil) trietoxisilano A3648-100 ml) en 0,22 micras agua filtrada nanopura durante 30 min. </li><li> Después de 30 min enjuagar los APTES con agua filtrada y secar suavemente en un flujo de nitrógeno. </li><li> Coloque la muestra matriz nucleosoma apropiadamente diluido (~ 1,5 ng / l) en la diapositiva, e incubar cubierto a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Enjuagar la muestra con tampón de muestra filtrada, seca como antes, y el lugar de diapositivas en la etapa de la AFM (en este caso una investigación MFP-3D Microscopio de Fuerza Atómica de asilo). </li><li> Comience por imágenes de 2 x 2 m exploraciones con 512 líneas de exploración. Cuente el número de nucleosomas para determinar el nivel de saturación (Figura 5B). </li><li> Lo ideal es que las áreas de imagen en la diapositiva con matrices de nucleosomas bien separados. </li><li> Para las imágenes de mayor resolución, una exploración de 500 x 500 nm se puede obtener (Figura 5C). </li><li> Las imágenes pueden ser aplanadas y analizados utilizando el software de la impresora multifunción en 3D proporcionado por el Asilo. </li><li> Cada imagen puede ser dividida en cuatro cuadrantes y el zoom digital para obtener una visión más clara de las matrices bien separados y múltiples líneas de mano libre se pueden extraer a través de las matrices y perfiles de altura se obtienen de los nucleosomas (Figura 5C, la derecha del panel de altura traza y 5D). </li><li> Varias de estas imágenes deben ser analizados para cada tipo de matriz que abarca varios cientos de nucleosomas. Perfiles de altura se registran, clasifican y se representan gráficamente en MS Excel. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Nucleosomal arrays modelo son una herramienta muy útil para el estudio in vitro de la estructura y función de la cromatina. Por ejemplo, han sido ampliamente usado para estudiar el mecanismo de la fibra de cromatina de condensación en solución 30-34, y hecho posible la obtención de una estructura de rayos x de un Tetranucleosome 35. Más recientemente han demostrado ser útiles en el desciframiento de los efectos estructurales de las variantes de las histonas núcleo específico, mutantes y mo...

Genomas eucariotas no existen como ADN desnudo, sino que más bien se compactan y organizados por proteínas unidas. Estos complejos de ADN y de proteínas se conocen como cromatina. La unidad de repetición básica de la cromatina es el nucleosoma. Un nucleosoma consta de octámero de histonas y 146 pares de bases de ADN enrollado alrededor del octámero de histonas alrededor de 1,6 veces 1. El octámero de histona se compone de dos copias de cada uno de la H2A histonas del núcleo, H2B, H3, y H4. Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. La estructura extendida de matrices nucleosomal se ha referido como la fibra de 10 nm o las &quot;cuentas en una cadena&quot; estructura y está presente in vitro bajo condiciones de poca sal 2. La fibra de 10 nm es capaz de condensar en estructuras de orden superior a través de la compactación dentro de la matriz y / o inter-array oligomerización 2. Estas estructuras de orden superior pueden ser inducidas en presencia de sales,o puede ser influenciada a través de la unión de las proteínas de arquitectura de la cromatina a la matriz nucleosomal 3,4. Los niveles de compactación de la cromatina se correlacionan inversamente con la tasa de transcripción en 5,6 vivo. La investigación reciente pone de relieve la importancia de la organización estructural de los genomas en procesos tales como la diferenciación, el desarrollo del cáncer, y otros 7,8. El uso de matrices nucleosomal para estudiar la estructura y función de la cromatina se ha generalizado. Aquí se describe un método para el montaje de matrices nucleosomal de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas. El uso de ADN recombinante con repeticiones en tándem de secuencias de posicionamiento de nucleosomas permite la reconstitución de matrices que contienen nucleosomas regularmente espaciados. Dos de las secuencias de posicionamiento más populares son la secuencia del gen 5S rRNA y el &quot;601&quot; secuencia de 9,10. La secuencia 601 se deriva a partir de experimentos de SELEX y More posiciona fuertemente nucleosomas que la secuencia 5S 11. En consecuencia, la longitud del ADN enlazador de las matrices 601 es más homogénea. El posicionamiento de nucleosomas ADN repetidas en tándem se obtiene por filtración en gel 4,12. Histonas recombinantes se purificaron a partir de E. coli en condiciones de desnaturalización 13. El uso de las histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente la composición de la histona de las matrices nucleosomal. Por ejemplo, el núcleo de histonas teniendo mutaciones específicas 14 o las modificaciones posteriores a la traducción 15,16 puede ser sustituido por histonas de tipo salvaje. Experimentos de velocidad de sedimentación supervisar la tasa de sedimentación de las macromoléculas en solución bajo una fuerza centrífuga aplicada 17. Esto produce información sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas en una muestra. Experimentos de velocidad de sedimentación son, pues, un instrumento adecuado para el estudio de los cambios de estado de soluciones en fibra de cromatinaestructura debido a la condensación de la cromatina 18. Es importante destacar que, en primer lugar es necesario el uso de experimentos de velocidad de sedimentación como un paso de control de calidad en la reconstitución matriz nucleosomal. Si el ADN y nucleosomas no se combinan en la proporción molar adecuado, las formaciones pueden ser sub o sobre-saturado de histonas. Por lo tanto, la información obtenida a partir de experimentos de velocidad de sedimentación se utiliza para asegurar que el ADN está saturado correctamente con nucleosomas. Es importante utilizar métodos alternativos para estimar la saturación de ADN con nucleosomas, especialmente si se trabaja con una plantilla de ADN no caracterizado previamente. Por lo tanto, también se describe un método para el análisis de matrices nucleosomal utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM es una técnica poderosa que permite la visualización de los efectos de una serie de parámetros, tales como el nivel de saturación, efecto de la presencia de variantes de histonas o los efectos de MgCl 2 19,20. AFM también ha sido aplied para estudiar la dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de lapso de tiempo 21. In vitro reunidos nucleosomal arrays 12-mer son particularmente susceptibles a los estudios de AFM porque pertenecen en el rango de tamaño adecuado para imágenes de AFM 22. En el presente estudio hemos utilizado AFM de matrices nucleosomal como control de calidad, así como un medio de afirmación de los datos de AUC (&quot;ver para creer&quot;). Además de la visualización sencilla, AFM permite la medición de perfiles de altura de muestras como una métrica adicional.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Tubo de diálisis</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Columna</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrador centrífugo</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Tubo de diálisis</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Ultracentrífuga analítica</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

asamblea de nucleosomal arrays de recombinantes core histonas y el adn posicionamiento de nucleosomas

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. Nucleosomal arrays se obtienen en una de dos maneras: la purificación a partir de fuentes in vivo, o la reconstitución in vitro de histonas del núcleo recombinantes y de ADN posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem. El último método tiene la ventaja de permitir para el montaje de un uniforme más de composición y matriz nucleosomal posicionado con precisión. Experimentos de velocidad de sedimentación en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas mediante el análisis de la tasa a la que migran a través de la solución bajo la fuerza centrífuga. Esta técnica, junto con microscopía de fuerza atómica, se puede utilizar para el control de calidad, garantizando que la mayoría de las plantillas de ADN están saturados con nucleosomas después de la reconstitución. Aquí se describen los protocolos necesarios para reconstituir cantidades de miligramos de longitud y compositivamente dnucleosomal arrays efined adecuados para los estudios bioquímicos y biofísicos de la estructura y función de la cromatina.

Para ilustrar el protocolo que reconstituido nucleosomal arrays de histonas del núcleo de Xenopus recombinantes y ADN que consiste en 12 repeticiones tándem de 207 pb de la secuencia 601 de posicionamiento (601 207 x 12). En primer lugar, reunido octámeros nativos de histonas del núcleo liofilizadas y después se purificó los octámeros mediante FPLC utilizando una columna S200 (Figura 1A). Complejos más grandes eluyen antes de la columna de la S200. Las histonas se eluyen generalmente...

Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Este experimento tiene como objetivo ensamblar matrices nucleosómicas que contengan una serie de secuencias de ADN posicionadoras de nucleosomas repetidas en tándem, con un número igual de nucleosomas. Primero, reorganicen los complejos de histonas mediante diálisis de las histonas centrales fuera de un tampón desnaturalizante. Luego, separen el complejo de histonas mediante una columna de exclusión por tamaño. A continuación, combinen el complejo de histonas con el ADN molde en una serie de relaciones molares y deposítenlo sobre el ADN como nucleosomas mediante diálisis escalonada, desde sal alta hasta sal baja.A continuación, analice las muestras mediante velocidad de sedimentación para determinar la relación molar adecuada para el nivel deseado de saturación. Los resultados pueden mostrar el nivel de saturación de los arrays nucleosómicos según su migración a través de la solución bajo fuerza centrífuga, o según una imagen generada por microscopía de fuerza atómica. La ventaja principal de los arrays nucleosómicos frente a los nucleosomas monocromosómicos es que los nucleosomas están conectados por ADN intercalado, lo que impone una restricción estructural adicional.Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura de la cromatina, también puede aplicarse a otros sistemas, como el estudio de transcripción in vitro en plantillas de cromatina. Ryan y Anna demostrarán ahora el ensamblaje de matrices nucleosómicas a partir de histonas centrales recombinantes en ADN con posición nucleosómica definida. Comience con las proteínas purificadas liofilizadas de histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4; disuelva aproximadamente cinco miligramos de cada una en tres mililitros de tampón desnaturalizante e incube durante al menos una hora a temperatura ambiente con agitación.Ahora mida la absorbancia de cada solución de histona a 276 nanómetros utilizando el tampón de desnaturalización como referencia. Luego, calcule la molaridad de cada histona utilizando sus coeficientes de extinción. Compare la concentración de histona determinada por absorbencia con el peso seco liofilizado y estime si la mayor parte de la proteína está disuelta.Identifique la muestra de histonas que contiene el menor número de moles, ya que este será el número limitante de moles para todas las histonas. Luego, combine las histonas en cantidades molares iguales. Diluya la mezcla de histonas con tampón desnaturalizante hasta una concentración final de un miligramo por mililitro.Ahora transfiera la muestra al tubo de diálisis. Selle el tubo y colóquelo en dos litros de tampón de plegamiento frío. Somete la muestra a diálisis durante 18 horas a cuatro grados Celsius con agitación.Asegúrese de que la tubería de diálisis pueda girar libremente y con vigor para evitar la precipitación de sales. Cambie el tampón de diálisis cada seis horas; incluso si se forma un precipitado, no deseche la muestra, ya que es posible recuperar algo de octi, aunque el rendimiento se reducirá. Conecte la columna S 200 a un sistema FPLC asegurándose de que no entren burbujas de aire en el sistema.Limpie la columna S 200 durante la noche con agua filtrada de 0,2 micrómetros utilizando un caudal de 0,3 mililitros por minuto y un límite de presión inversa de 0,5 megapascales; a continuación, equilibre el sistema con un litro de tampón de plegamiento filtrado de 0,2 micrómetros durante aproximadamente dos horas. Asimismo, equilibre un concentrador centrífugo con un mililitro de tampón de plegamiento. Ahora retire la muestra del tubo de diálisis.Centrifugar la muestra a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier precipitado. Pipetear el sobrenadante de la muestra hacia el concentrador. Concentrar la muestra hasta un volumen de aproximadamente 500 µL.Transfiera la muestra concentrada de Optimus a un nuevo recipiente. Enjuague el concentrador con un mililitro de tampón de plegamiento. Concentre el enjuague hasta 500 microlitros y añádalo a la muestra de ER.Centrifugar la muestra en un tubo microfuge de 1,5 mililitros durante cinco minutos a 10.000 RPM a cuatro grados Celsius. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, cargar la muestra en la columna S 200.Eluir la muestra con 400 mililitros de tampón de plegamiento recién preparado y recoger fracciones de dos mililitros. Monitorear la absorbancia a 280 nanómetros durante la elución. Los agregados de His suelen eluirse aproximadamente a 45 mililitros de EMR, alrededor de los 65 mililitros y el tiempo.Aproximadamente en 84 mililitros. Analice las fracciones eluidas de los picos de interés realizando corridas de las muestras en un gel SDS-PAGE al 18-20%. Las fracciones que contengan émulos purificados deben tener cantidades molares iguales de las cuatro proteínas de histonas centrales.Ahora, reúna las fracciones que contienen OCR purificados y concéntrelos mediante un filtro centrífugo para determinar la concentración final de octr. Mida la absorbancia a 280 nm y calcule la concentración utilizando el coeficiente de extinción.Reconstituya matrices nucleosómicas a partir del ADN y las ER purificadas según se describe en el texto del protocolo. Luego, diluya la muestra hasta una absorbancia de 0,5 a 260 nanómetros. Cargue 400 microlitros de la muestra en una celda con un centro móvil de dos compartimentos, colocando la muestra en un lado y el tampón de referencia 10 en el otro.Aunque el nivel del líquido en ambos sectores debe estar próximo al mismo nivel, mantenga el menisco de referencia más alto que el menisco de la muestra. Cargue las células en el rotor y alinéelas correctamente.Utilizando las marcas de hash en la parte inferior de las celdas del rotor, limpie suavemente las lentes de las celdas con aire comprimido. Encienda la centrífuga X-L-A-X-L-I. Inserte el rotor y coloque y asegure la óptica según se describe en el manual.Abra el software del laboratorio de proteómica y seleccione archivo nuevo. Configure una corrida de escaneo único a 3000 RPM a una temperatura de 25 grados Celsius. Para cada celda, asigne nombres a las muestras, seleccione una longitud de onda, seleccione absorbancia y elija una ubicación para guardar el archivo en su computadora.En las opciones, seleccione detener. Después del último escaneo y de ejecutar la calibración radial, inicie la ejecución de un solo escaneo. Utilice el escaneo individual para determinar la longitud adecuada del escaneo radial.Utilizando el panel de control X-L-A-X-L-I. Introduzca una velocidad de cero y presione la tecla asterisco para equilibrar la cámara. Mediante el software, establezca la velocidad deseada y el número de escaneos.Velocidades más altas de la centrífuga aumentan la resolución del coeficiente de sedimentación. Sin embargo, se deben recopilar al menos 20 escaneos antes de que toda la muestra haya sedimentado en el fondo de la celda. Supervise los primeros escaneos para asegurar un funcionamiento adecuado.Superponer las últimas escaneos para monitorear el progreso del ensayo y verificar posibles problemas, como celdas con fugas. El análisis de los resultados de velocidad de sedimentación, así como un protocolo para visualizar arreglos mediante microscopía de fuerza atómica, se detallan en el texto del protocolo. En este experimento.Las histonas nucleares de Xenopus liofilizadas se reconstituyeron en el octr purificado mediante FPLC en una columna S 200. El agregado no específico de histonas aparece primero, seguido por el octr de histonas, las tetraméricas H tres, H cuatro y las diméricas H dos A.H dos B. El análisis de las fracciones de octr purificadas mediante electroforesis SDS-PAGE indica cantidades equimolares de las cuatro proteínas histonas. Obsérvese que las H dos A y H dos B de Xip tienen pesos moleculares que difieren en solo aproximadamente 200 daltons, y por lo tanto, a menudo aparecen como una sola banda en geles SDS.Las fracciones 64 a 67 se reunieron y conservaron para la reconstitución de matrices nucleosómicas. Se utilizó una captura de pantalla del software de Proteome Lab de un único escaneo recolectado a 3000 RPM para establecer el rango de mediciones de un escaneo de células UC. Luego, se editó una serie de escaneos de velocidad de sedimentación para generar un conjunto de datos; las líneas roja y verde representan dos métodos diferentes para visualizar la distribución de los coeficientes de sedimentación.En UltraScan. La línea roja es la distribución integral de los coeficientes de sedimentación, mientras que la verde es la derivada en el estudio de la organización de la cromatina. La microscopía de fuerza atómica in vitro complementa la ultracentrifugación analítica para determinar el grado de saturación de la plantilla tras la reconstrucción.Aquí, la mayoría de los 27 ARS utilizados en la imagen contenían de 10 a 11 nucleosomas. Esta exploración de 500 por 500 nanómetros muestra claramente matrices nucleosómicas con el ADN del enlazador. También se muestran el rastro de amplitud, el rastro de fase y el mismo rastro de altura con una línea trazada a mano alzada a través de los nucleosomas para determinar el perfil de altura de los nucleosomas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo correctamente.Al seguir este procedimiento, es muy importante recordar ser muy preciso al medir las concentraciones de sus reactivos. Tras este procedimiento, también puede probar los niveles de saturación de los arreglos nucleosomales utilizando técnicas como la microscopía de fuerza atómica. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cromatina estudiaran la estructura de la cromatina y la compactación de la cromatina.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos técnicas de imagen de microscopía de fuerza atómica de lapso de tiempo de alta velocidad, AFM, para estudiar la dinámica de los complejos de nucleosomas. A medida que la punta de AFM escanea la superficie del nucleosoma, detecta alteraciones en la altura del nucleosoma y registra el desenvolvimiento del ADN a lo largo del tiempo.

Microscopía de fuerza atómica time-lapse de alta velocidad para capturar la dinámica de los nucleosomas

Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta...

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar partículas nucleosoma en el nivel de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica estática y Time-lapse (AFM) técnicas de imagen. El método de funcionalización de superficies descrito permite la captura de la estructura y la dinámica de los nucleosomas en alta resolución a escala nanométrica.

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Aquí presentamos un método para expresar proteínas de histonas acetiladas utilizando la expansión del código genético y ensamblar nucleosomas reconstituidos in vitro.

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Este protocolo describe en detalle la preparación de complejos nucleosómicos utilizando dos métodos de preparación de muestras para congelar rejillas TEM.

Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Este video muestra la técnica utilizada para la preparación de organizador y explantes de animales polo de Xenopus laevis embriones, incluyendo el uso de la cuchilla de cejas - una herramienta especializada disección hecha de una de las cejas. El protocolo para el montaje de un ensayo de adhesión se da también, que las sondas para detectar la presencia de moléculas de adhesión clave presentes en el organizador de la superficie de las células animales o polos que son fundamentales para un...

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

Aprende a ensamblar arrays nucleosómicos con histonas core recombinantes y ADN posicionador para estudiar estructura cromatínica. Este método utiliza ultracentrifugación y microscopía de fuerza atómica para evaluar la saturación y organización de nucleosomas.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

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