Name: De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a extraer ADN genómico de sangre completa mediante la tecnología TruTip automatizada en el sistema Hamilton Star. Este método de alto rendimiento elimina contaminantes y reduce errores operativos en aplicaciones clínicas.

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Partes de este trabajo fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) en virtud de concesión R44 AI072784. Agradecemos al Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson y Amy Dean, del Laboratorio de Enfermedades Virales, Wadsworth Center, New York State Dept. de Salud de viriones de la gripe cuantificados y el acceso a la gripe en tiempo real clínicamente validado Los ensayos de PCR.

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Los autores son empleados de Akonni Biosystems, Inc., que producen los materiales utilizados en este artículo. Acceso libre y Producción de este artículo está patrocinado por Akonni Biosystems, Inc.

La simplicidad del concepto TruTip y flujo de trabajo (Figura 1) que sea fácilmente adaptado, automatizado, eficiente y eficaz para un número de matrices de muestras clínicas, los volúmenes de muestra de entrada, y los sistemas de manejo de líquidos. Debe reconocerse, sin embargo, que cada muestra clínica es único, y pueden variar uno al siguiente en la viscosidad, partículas, moco, contaminantes de la superficie, microbianos, y / o fondos genéticos humanos. Teniendo en cuenta las variaciones esperadas en la composición de la muestra clínica y usos previstos de un protocolo de preparación de la muestra TruTip automatizado, para ello puede ser necesario modificar algunos pasos en un procedimiento TruTip con el fin de lograr los resultados deseados para un tipo de muestra específica. Independientemente del tipo de muestra, sin embargo, los parámetros de TruTip que típicamente tienen el impacto más significativo sobre la pureza del ácido nucleico y / o de recuperación incluyen: <ol><li> Ejemplo de mezcla y homogeneización con tampón de lisis (y el alcohol). Mientras TruTips tienen una retamaño de poro lativamente grande, homogeneización de la muestra y la licuefacción es muy importante para la lisis celular eficaz, y etapas de unión posteriores a la TruTip monolito. Con un lisado homogénea y bien licuado, las muestras pueden moverse a través de la TruTip con caudales más altos, lo que reduce el tiempo total de procesamiento de la muestra. El protocolo de plasma de gran volumen demuestra el potencial de los usuarios para homogeneizar bien y licuar muestras difíciles (on-line u off-line), a pesar del gran volumen de la muestra de entrada. </li><li> Las velocidades de flujo. Tasas de flujo más lento durante la unión a ácido nucleico o elución suelen dar lugar a mayores rendimientos de ácido nucleico, aunque a expensas de tiempo de procesamiento total. Las tasas de flujo más lento también pueden reducir el grado de cizallamiento de ADN. </li><li> Los números de ciclo. El número óptimo de ciclos de aspiración y dispensación depende de tipo de muestra, el volumen total de la muestra, y las tasas de flujo. Paso 1 en la figura 1 es normalmente el punto en el que Numbe ciclors (y velocidades de flujo) puede requerir alguna optimización empírica, con muestras tales como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa uno de los lisados ​​más desafiantes para optimizar debido a la gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes. </li><li> Secado. Secado completo de la TruTip monolito es imperativo para evitar disolventes orgánicos residuales procedentes de la co-eluyendo con la muestra purificada de ácido nucleico y la inhibición de los procesos aguas abajo o pruebas. Debido a TruTip no se seca a través de centrifugación o filtración al vacío, es importante para maximizar tanto la velocidad de flujo y los números de ciclo durante la etapa de secado. A veces hay una gota residual de la solución de lavado en el término de TruTip después de completar los ciclos de secado. El Hamilton robot tiene la capacidad de realizar una &quot;punta toque&quot; en el lado del pozo para liberar la gota, garantizando así una elución libre de disolvente. El sistema de epMotion no tiene esta característica, sino una pre-enjuague del terminal TruTip en ellución tampón puede ser programado para lograr el mismo efecto. </li></ol> Debido a la geometría, material de la punta de pipeta, y el método de fijación de los brazos robóticos de canal son únicos para cada fabricante de instrumentos, se requiere una construcción TruTip diferente para cada sistema de manejo de líquidos. Las dimensiones monolito TruTip (diámetro, grosor y tamaño de poro) se correlacionan con la capacidad de unión a ácido nucleico (y las eficiencias de elución), como se espera que para cualquier técnica de extracción en fase sólida. Si bien gruesas matrices (&gt; 4 mm) se pueden incrustar en un TruTip 1 ml a aumentar la capacidad de unión a ácido nucleico para muestras de gran volumen y / o igualar la capacidad de unión a través de formatos de TruTip específicas, hay un equilibrio entre el espesor de TruTip y velocidades de flujo durante la etapa de unión inicial (en la presencia de lisados ​​crudos). Por lo tanto, a veces es ventajoso incorporar monolitos de mayor diámetro en la punta de la pipeta de mayor volumen para las etapas iniciales de un protocolo automatizado (por ejemplo &lt;/ Em&gt; los ml Hamilton / Akonni TruTips 5 de extracciones a gran volumen). Dadas las configuraciones TruTip específicas dictadas por los fabricantes de robots de manipulación de líquidos, sin embargo, no necesariamente esperamos rendimientos de ácido nucleico TruTip sean idénticos en todas las plataformas de manejo de líquidos de diferentes fabricantes, o en diferentes tamaños TruTip. Las muestras clínicas (por definición) contendrán cantidades significativas de ADN genómico humano a menos que se adquieren a partir de sitios normalmente estériles (por ejemplo líquido cefalorraquídeo). A veces se desea el ADN genómico humano (como en la Figura 6), mientras que en otras aplicaciones el ADN humano representa un fondo genómico no deseados (como para la Figura 5). La presencia de ADN de fondo no suele ser problemático, ya que siempre que la cantidad total de ácido nucleico en la muestra no exceda la capacidad de unión del monolito, y el ADN de fondo puede servir como un portador si la nucleico diana deseadaácido está presente en cantidades traza. El objetivo del protocolo de extracción de plasma de gran volumen (Figura 7) es para aislar (fragmentado) ADN fetal en presencia de un exceso de 10-20 veces de ADN materno, que es similar a la preparación de la muestra objetivo de las pruebas de enfermedades infecciosas, excepto que las secuencias son muy congruentes y sólo se pueden distinguir por las pruebas moleculares altamente específica y / o tamaño de la discriminación. En este caso, el ADN circulante total se aisló utilizando un TruTip 5 ml, y ADN fetal de alto peso molecular y de bajo peso molecular posterior se separan en la posterior unión y elución a un ml TruTip 1 mediante la alteración de las condiciones de tampón de unión. Tamaño de la separación y el enriquecimiento selectivo de los ácidos nucleicos diana sobre la base de sus propiedades de unión y elución a un monolito de sílice es un modo significativamente diferente de acción que la conseguida por membranas o columnas de centrifugado de exclusión por tamaño. Tamaño separación y enriquecimiento de ADN microbiano a partir de ADN genómico humano pueden ser unaccomplished en aplicaciones futuras a través de la personalización de tampones de elución de unión y TruTip. Los protocolos automatizados demostraron aquí hincapié en la utilidad de la TruTip sí mismo monolito para el procesamiento de diversas muestras clínicas, y cómo puede ser adaptado para grandes volúmenes y los robots de manejo de líquidos específicos. Los métodos simplificados suelen dar lugar a protocolos de extracción más rápido en comparación con otros sistemas automatizados. La simplicidad de la tecnología TruTip, sin embargo, también ofrece algunas ventajas de costes para los interesados ​​en la compra de un nuevo sistema de purificación de ácidos nucleicos automatizada,, porque el hardware primaria requerida para la automatización de los procedimientos de TruTip es el brazo pipeta propio canal en lugar de varillas magnéticas, sistemas de vacío , oa bordo de centrifugadoras. La utilización de placas de reactivos precargados también puede reducir el espacio y consumibles necesarios, y el doble de rendimiento por ciclo. Minimizar el espacio de la cubierta con los protocolos TruTip también permite a los usuarios avanzados la integración aguas arriba o aguas dprocesos automatizados ownstream con la TruTip. Por ejemplo solución easyBlood de Hamilton a la sangre completa fraccionar puede incorporarse con el método de extracción TruTip automatizada, lo que agilizar significativamente los procesos bio-banking. Los procesos de post-extracción tales como la cuantificación de ácido nucleico, la normalización, la PCR configuración, o la secuenciación de ADN también se integran fácilmente con TruTip en las plataformas de manejo de líquidos más grandes.

Purificación de ácidos nucleicos es necesario para el diagnóstico molecular más, la investigación sólo utilizar, y aplicaciones de ciencias de la vida. Varios enfoques han surgido desde el momento de extracciones con fenol / cloroformo, muchos de los cuales se basan en el principio fundamental de la unión de ácidos nucleicos a la sílice en presencia de sales caotrópicas 1. El proceso de extracción se ha simplificado y automatizado a través del uso de diversos formatos-y el talón basados ​​en membranas, con filtros de espín, perlas magnéticas y enfoques relacionados que dominan la industria de ciencias de la vida (ver ejemplos en 2-13). Aunque eficaz, las partículas y las membranas han sabido limitaciones cuando se enfrentan a difíciles matrices clínicos. Por ejemplo, las membranas y columnas basados ​​en perlas son compatibles, tienen pequeños tamaños de poro (por lo tanto, altas presiones de la espalda), y requieren algún tipo de apoyo con el fin de ser procesados ​​por un sistema de centrífuga o de vacío. Las características físicas de las membranas y columnas de perlas de resultado enresistencia fluídica significativa, lo que limita el tipo de muestras que se puede procesar de manera eficiente sin obstruir el consumible, y / o el volumen total de la muestra (entrada) que pueden ser uni-direccionalmente procesado a través de la trayectoria de flujo. Por el contrario, las partículas magnéticas deben ser distribuidas a lo largo de la muestra por agitación. La necesidad de distribuir homogéneamente las partículas magnéticas dentro de una solución limita el volumen de la muestra total de entrada que puede ser procesado con los consumibles de talón más magnéticos. Atributos de muestras clínicas (tales como la viscosidad o la complejidad) pueden conducir a la concentración de partículas magnéticas ineficiente en el lado de un tubo o varilla. Además, las partículas finas de sílice pueden desprenderse de las cuentas durante el proceso de extracción, perdiendo su magnetización y la contaminación de la muestra final. La tecnología TruTip fue desarrollado para superar algunas de estas limitaciones de ácidos nucleicos de muestra y limitaciones de procesamiento 14. Mediante la incorporación de un monolito poroso dentro de unpunta de la pipeta, contrapresión de fluido se reduce, lo que permite el control de flujo de vacío (es decir, una pipeta de aspiración). Esta característica permite que el proceso de extracción y de la instrumentación requerida para purificar ácidos nucleicos a partir de los tipos de muestras difíciles de ser simplificado en gran medida (Figura 1). La geometría y la porosidad del monolito se adapta para reducir al mínimo la obstrucción, mientras que el espesor del monolito proporciona la capacidad de unión de ácido nucleico suficiente para volúmenes de muestra que van de 1,0 a 5,0 ml. De flujo bidireccional de la muestra durante la aspiración y la dispensación permite tiempos de residencia prolongados entre el extracto de la muestra y el monolito de unión para la recuperación de ácido nucleico eficiente y elución, y permite relativamente grandes volúmenes de muestra para ser procesada que exceda la capacidad de volumen de la propia punta de la pipeta. Hemos informado anteriormente de la elaboración y aplicación de un procedimiento TruTip manual para purificar ARN influenza en muestras nasofaríngeas utilizando un único o multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiencia de extracción equivalentes se obtuvieron entre automatizado QIAcube y métodos TruTip manuales a 10 6 copias de genes de influenza A por ml aspirado nasofaríngeo. El objetivo de este estudio fue demostrar, procedimientos de mediano y alto rendimiento automatizadas TruTip purificación de ácidos nucleicos de aspirado nasofaríngeo (NPA) y otros tipos de muestras clínicamente relevantes, utilizando robots de manipulación de líquidos que se encuentran comúnmente en los laboratorios clínicos de referencia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reactivo/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de influenza TruTip (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>Etil alcohol al 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Acetona al 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio de reactivos, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de pocillos profundos 96/2.000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas epT.I.P.S., 1.000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema epMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta dispensadora TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaplatos para reservorio</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla 1. &lt;/strong&gt; Reactivos y equipos para la extracción automatizada de ARN a partir de aspirado nasofaríngeo.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reactivo/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN genómico de sangre TruTip (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>Etil alcohol al 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Portapuntas filtradas CO-RE 96 de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>Portapuntas no filtradas CO-RE 96 de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja reactivos de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Placa de pocillos profundos de 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de reactivos</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema Hamilton STAR</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>Canales independientes de pipeta de 1 ml / Brazo modular</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de 96 canales de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Portapuntas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras/Insertos</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Portaplacas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Portador multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Unidad agitadora calefactora HHS2</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Portador de rack</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla 2. &lt;/strong&gt; Reactivos y equipos para la extracción de ADN genómico en placas de 96 pocillos a partir de sangre total.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reactivo/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN circulante TruTip R+D (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Consultar para obtener información</td><td></td></tr><tr><td>Etil alcohol al 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas de 4 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Puntas no filtradas de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>Placas de pocillos profundos de 96 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de reactivos de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de reactivos de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas grandes de reactivos de 96 posiciones</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Base del sistema STARplus Autoload / Módulo de cubierta</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>Canales independientes de pipeta de 1 ml / Brazo</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>Canal independiente de 5 ml / Brazo modular</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Portaplacas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Portador multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Portador de rack para bandejas de reactivos de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Portador de bandeja de reactivos de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Portapuntas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Portador de tubos de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras de 24 posiciones</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras de 32 posiciones</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla 3. &lt;/strong&gt; Reactivos y equipos para la extracción de ADN de gran volumen a partir de plasma.</td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento, extracción automática de adn y rna de muestras clínicas utilizando la tecnología trutip en común robots manejo de líquidos

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. La geometría del monolito puede ser adaptado para puntas de pipeta específicas que varían en volumen de 1,0 a 5,0 ml. La gran porosidad del monolito permite muestras viscosas o complejo para pasar fácilmente a través de él con contrapresión de fluido mínima. Flujo bidireccional maximiza el tiempo de residencia entre el monolito y la muestra, y permite a las grandes volúmenes de muestra para ser procesada dentro de un solo TruTip. Los pasos fundamentales, independientemente de su volumen de la muestra o la geometría TruTip, incluyen la lisis celular, unión de ácidos nucleicos a los poros interiores de la TruTip monolito, lavando componentes de la muestra no unidos y tampones de lisis, y eluir los ácidos nucleicos purificados y se concentró en un tampón apropiado. Los atributos y la adaptabilidad de TruTip se demuestran en tres protocolos de procesamiento de muestras clínicas automatizadas utilizando un Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR y STARPLUS robots de manipulación de líquidos, como el aislamiento de ARN de aspirado nasofaríngeo, el aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total, y la extracción de ADN fetal y el enriquecimiento de grandes volúmenes de plasma materno (respectivamente).

Datos de PCR en tiempo real para la gripe extracción de RNA de NPA se muestran en la Figura 5A. Estima que la eficacia de extracción de ácido nucleico es similar a los resultados obtenidos con la versión manual del protocolo 15. Una respuesta lineal en promedio valores C t se observa entre 10 4 y 10 6 copias del gen ml -1 modificado influenza (R 2 = 0,99 y 0,98 para la influenza A y B, respectivamente), con desviaciones estándar en media C t valores inferiores a 1 ciclo. La ausencia de contaminación cruzada con el sistema de epMotion se demuestra en la Figura 5B, donde 12 muestras NPA positivas que contienen 10 copias del gen 6 ml -1 NPA se intercalan con 12 espacios en blanco tampón. El promedio de C t para los controles positivos fue 30,16 ± 0,14, y todos los espacios de amortiguamiento fueron negativos. El tiempo total de procesamiento de la muestra es 16, 28 y 40 min para 8, 16 y 24 muestras, respectivamente.Debido a que una típica aspirado nasofaríngeo clínica o un hisopo contendrán 10 7 gen copias ml -1 (suponiendo 1000 viriones por TCID 50 y 16&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 gripe 17), se espera que el protocolo de epMotion automatizado para ser eficaz en la mayoría de especímenes clínicos NPA. Teniendo en cuenta la gama de pruebas moleculares realizados sobre el ADN genómico humano, el objetivo principal de extracción de ácidos nucleicos de la sangre entera es para producir ADN genómico libre de contaminantes, de alto peso molecular. El protocolo automatizado para 96 muestras se completa en 1 hora, que es una mejora con respecto a otros sistemas automatizados (por ejemplo, Promega MagneSil = 90 min y Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot sistema MDx = 2,5 h). Figura 6A muestra los perfiles de absorbancia de UV / VIS para 45 muestras de sangre positivas procesados ​​simultáneamente con 45 espacios en blanco de reactivos en el protocolo de Hamilton STAR, con un promedio Un <sub&gt; 260/280 proporción de 1.96 y el promedio de una relación de 260/230 de 1,93. Una relación A 260/280 entre 1,7-2,0 y A 260/230 ratio&gt; 1,7 son generalmente indicativos de ADN muy puro, libre de sales residuales, proteínas o disolventes, y aceptable para aplicaciones moleculares más abajo. El gel de agarosa al 1% en la Figura 6B muestra que el gDNA resultante es de alto peso molecular (&gt; 24 kb), con cizallamiento mínima. El rendimiento promedio de ácido nucleico a partir de todo el conjunto de 45 muestras positivas es de 5,26 ± 0,46 g ADN humano por 200 l de sangre entera, sobre la base de las Tecnologías de Quantifiler kit de cuantificación de ADN humano vida. Estudios de contaminación cruzada similares a los mostrados en la Figura 5B se realizaron con espacios en blanco tampón de control negativo intercalados con las muestras positivas y se extrajo en paralelo; todos los espacios en blanco volvieron a ser negativos por PCR (no se muestra). El purificado ADNg también es adecuado para otros numerosos análisis basados ​​en la PCR (no se muestra). Resultados en tiempo real de ocho muestras repetidas de una muestra de plasma de la madre agrupado procesado con el procedimiento TruTip de gran volumen se muestran en la Figura 7. El protocolo completo (incluyendo fuera de línea proteinasa K de incubación) se terminó en aproximadamente 2,5 horas, similar a la del manual de circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no comparables kits de extracción automatizados están disponibles aún). El promedio de los valores C t más de todas las repeticiones son 34,58 ± 0,66 y 29,76 ± 0,50 para el varón fetal (CHi) y el total de ADN (CH1), respectivamente, lo que demuestra una excelente repetibilidad del método de extracción automatizado. La concentración de ADN fetal dentro de la piscina total de ADN (en equivalentes de genoma), se calcula sobre la base de análisis de punto de comparación ajuste a las normas, con la media% ADN fetal resultante a través de todas las muestras de 2,8%. El ADN fetal% real para esta muestra es desconocido porque las muestras se agruparon antes de realizar la extracción. Composición de ADN fetalen muestras de plasma no agrupados extraídos utilizando el método TruTip son típicamente 1,5 veces mayor en comparación con los resultados con una circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no se muestra). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. El proceso de extracción TruTip y el flujo de trabajo, independientemente del sistema de manejo de líquidos. Otros preparación de la muestra o los pasos de manipulación de líquidos se pueden incorporar en las rutinas automatizadas dependiendo de las capacidades del instrumento de manipulación de líquidos y software específicos. <img alt="La figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 muestra de diseño de la placa. (B) Disposición de los reactivos / Consumables en la mesa de trabajo. La placa de la muestra se pueden configurar para un máximo de 24 muestras (columnas 1, 5 y 9, respectivamente), aunque el epMotion sólo procesará un máximo de 8 muestras simultáneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton ESTRELLA disposición de la cubierta para la purificación de ADN genómico a partir de sangre entera (no a escala) Cubierta Posición 1 = Hamilton 1 ml consejos filtrados;. 2 = Hamilton 1 ml sugerencias no filtrados; 3 = Akonni / Hamilton ml LPT TruTips mm 1 2 4; = entrada de soporte de muestras de sangre (tubos de recogida de sangre o tubos de microcentrífuga); 5-9 = 290 ml depresiones reactivas para Lysis Buffer F, el etanol, el tampón de lavado J, K tampón de lavado y elución Buffer A2, respectivamente, 10 = 96 deep placa de unión; 11 = 96 pozo profundo Lave J, 12 = 96 pozo profundo Lavar K, 13 = 96 plato hondo elución bien; 14 = Hamilton HHS2 calentador / agitador con Nunc 96 plato hondo de incubación bien, 15 = 50 ml a través de reactivos conteniendo proteinasa K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> La Figura 4. Hamilton STARPLUS disposición de la cubierta para la purificación de ADN a partir de muestras de plasma de grandes volúmenes (no a escala). El sistema está equipado con 8 canales x 5 ml y 8 canales x 1 ml (no se muestra en la disposición de la cubierta). Cubierta Posición 1 = Hamilton 4 consejos ml filtradas; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = muestras de plasma de origen; 4 = tubos cónicos de 50 ml, 5 = 120 depresiones reactivas ml con CN-W1, W2 y CN-CN-W4 Reagetes, 6 = bajo volumen depresiones reactivas que contienen proteinasa K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB y CN-W3 reactivos; 7 = 290 ml a través de reactivos que contiene reactivo CN-L1; 8 = 290 ml a través de reactivos que contiene CN -B1 reactivo; 9 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 1, 10 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 2, 11 = portadores de muestra para purificado, producto final; 12 = Hamilton de 1 ml puntas sin filtro; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). En tiempo real los resultados de PCR de extracción TruTip automatizado de virus de la gripe agregados en aspirado nasofaríngeo (NPA). Entrada de volumen NPA = 100 l, volumen de elución = 50 l. Los resultados son la media de 3 replicar extractions de 5 diferentes fondos NPA (n = 15) por nivel de dilución y de destino influenza. qPCR se realizó en el sistema LightCycler 480 con las condiciones de ensayo descritas anteriormente 15. (B) se detectó la contaminación cruzada al 12 muestras positivas NPA se entremezclan con la plantilla no controles y sujetos al procedimiento de extracción automatizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> La Figura 6. Resultados de la extracción de ADN genómico a partir de sangre humana entera. A) Las trazas UV-visible desde 1000 NanoDrop (ThermoFisher) de 10 seleccionados al azar repeticiones. B) 1% en gel de agarosa de TruTip purificada gDNA. M = Fisher 24 kb Max DLadder NA. Los carriles 1 - 4 = ~ 100 ng purificada gDNA de cuatro seleccionados al azar repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. En tiempo real los resultados de PCR de ocho replicar TruTip extracciones de libre circulación de ADN de muestras de plasma. Denotados con un asterisco (* o **) se extrajeron en días separados. CHY cuantifica ADN fetal masculino y CH1 cuantifica ADN total presente (fetal y materna). qPCR se realizó en un sistema LightCycler 480 (Roche) con los ensayos previamente publicados dirigidos CHY y CH1 18.

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. Por consiguiente, el formato de preparación de la muestra es compatible con la mayoría de instrumentos para la manipulación de líquidos, y se puede utilizar para muchos medio a las aplicaciones clínicas de alto rendimiento y tipos de muestras.

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el ADN genómico humano de sangre total, utilizando la tecnología de extracción con puntas True mediante la estación de manipulación líquida Hamilton Star. Para lograrlo, se aspiran y dispensan varias veces a través de las puntas True una solución compuesta por el tampón de lisis de la muestra de sangre, proteinasa K y etanol, lo que permite la unión del ADN a la matriz de las puntas True. A continuación, se hacen pasar dos tampones de lavado separados a través de las puntas True con el fin de eliminar las proteínas residuales, el tampón de lisis y otros contaminantes de los ácidos nucleicos retenidos.En el tercer paso, la matriz de unión de la punta verdadera se seca aspirando y dispensando aire varias veces para evaporar cualquier tampón de lavado residual; en el paso final, el tampón de ilusión se hace fluir hacia adelante y hacia atrás a través de la matriz de unión para liberar el ADN de la matriz. Mediante la tecnología de punta verdadera, se extrae así ADN genómico de alto peso molecular libre de contaminantes, lo cual puede confirmarse mediante absorbancia UV-vis, electroforesis en gel y PCR cuantitativa o secuenciación. Las ventajas de la punta verdadera frente a otros métodos de preparación de muestras basados en columnas de centrifugación o partículas magnéticas son que la punta verdadera es fácil de automatizar.No requiere sistemas costosos con centrífugas y varillas magnéticas, y el flujo de trabajo sencillo ahorra espacio valioso en la plataforma. Aunque hoy nos centraremos en sangre completa, Tru Tip puede aplicarse a otras aplicaciones de muestras de ADN genómico, así como al ARN viral de muestras clínicas de hisopos o al aislamiento de ADN libre de células del plasma, por mencionar algunas. Quien demostrará el procedimiento será Dane Brady, ingeniero de automatización de nuestro laboratorio, quien ha tenido un papel fundamental en el desarrollo del procedimiento de extracción con Tru Tip en la estación de manipulación de líquidos Hamilton.En este protocolo, un robot de manipulación de líquidos Hamilton Star extrae simultáneamente ADN de 96 pocillos de sangre total. El Hamilton Star cuenta con una unidad opcional de agitador calefactor en la plataforma, lo cual es importante para la digestión enzimática de ciertas matrices clínicas como la sangre total. Debido a que el sistema puede equiparse con una cabeza de pipeta de 96 canales, existe una placa de 96 pocillos dedicada para cada uno de los pasos y reactivos con puntas verdaderas.Primero encienda el equipo asociado al robot Hamilton Star y la computadora. Abra el software Hamilton Run Control. Abra el archivo de corrida proporcionado por ACON para 96 muestras.Ahora configure la disposición del deck de la pipeta siguiendo el diagrama. Coloque puntas filtradas de un mililitro en todas las posiciones marcadas como uno; en la posición dos, coloque puntas sin filtro de un mililitro; en la posición tres, coloque puntas Conni Hamilton de un mililitro LPT de dos milímetros. Continúe consultando la tabla para llenar las posiciones restantes, de la cinco a la 12, con los materiales LabWare requeridos, pero aún no cargue las muestras.Ahora distribuya los reactivos: 75 mililitros de tampón de lisis y unión. F debe cargarse en la posición cinco del canal. Alternativamente, también se podrían usar placas precargadas con tampones para agilizar el montaje y simplificar la disposición del deck.Continúe cargando el robot según corresponda. Por último, retire las tapas de los tubos de sangre y colóquelos en los estantes portamuestras o en la posición cuatro del platino. Coloque la muestra uno en la parte trasera del portamuestras más a la izquierda y avance secuencialmente por cada portamuestras, finalizando con la muestra 96 en la posición delantera derecha.Una vez que todas las muestras estén cargadas, déjelas equilibrar a temperatura ambiente. Dado que el protocolo es completamente automatizado, existe poca posibilidad de error por parte del operador. Las muestras deben colocarse en el orden correcto en el soporte, pero puede implementarse la codificación por códigos de barras para garantizar un seguimiento adecuado de las muestras.Para iniciar un script automatizado, seleccione el botón de reproducción en la esquina superior izquierda de la ventana del archivo de ejecución e ingrese el número de muestras que se están procesando. El primer paso que ejecuta el script es transferir 80 microlitros de proteinasa K a la placa de incubación en la posición 14 del módulo calefactor con agitación. A continuación, el script dispensa 200 microlitros de muestra en cada pocillo de la placa de incubación utilizando el brazo de ocho canales.A continuación, se dispensan 600 microlitros del tampón de lisis F en cada pocillo de la placa de incubación utilizando el brazo de 96 canales. Luego, el programa mezcla la solución durante 10 ciclos e incuba las muestras durante 20 minutos a 70 grados Celsius y 500 RPM en la placa de pocillos profundos; la temperatura es únicamente de 60 Celsius, lo cual se encuentra dentro del rango de actividad de la proteinasa K. Mientras las muestras están en incubación, el sistema de manipulación de líquidos continúa operando dispensando los reactivos de extracción y elución desde los depósitos de reactivos principales hacia sus placas de 96 pocillos correspondientes; se añaden 100 microlitros del tampón Elucian A en cada pocillo de la placa de pocillos profundos.En la posición 13, se depositan 800 microlitros de etanol en cada pocillo de la placa de pocillos profundos. En la posición 10, se añaden 1,6 mililitros de tampón de lavado K a cada pocillo de la placa de pocillos profundos en la posición 12 y 1,6 mililitros de tampón de lavado J se añaden a cada pocillo de la placa de pocillos profundos en la posición 11. Tras la incubación de 20 minutos, la mezcla de muestra se transfiere desde la placa de incubación a la placa de pocillos profundos que contiene etanol en la posición 10, donde se mezcla mediante 12 ciclos de pipeteo.Durante todo el proceso, las puntas de reactivos se descartan en el contenedor de desechos según sea necesario. El programa continúa desde el proceso de lisis hasta la extracción de ADN cargando primero 96 puntas verdaderas desde la posición tres del deck. El siguiente paso consiste en aspirar y dispensar las muestras en la posición 10 durante 10 ciclos, uniéndose así los ácidos nucleicos al monolito de la punta verdadera.A continuación, las puntas True pasan a la posición 11, donde el tampón de lavado J se hace circular a través del monolito cinco veces para eliminar restos de lisado, tampón y matriz de la muestra. Luego, las puntas True pasan a la posición 12, donde el tampón de lavado K se hace circular a través de ellas cinco veces para eliminar proteínas y otros contaminantes del ácido nucleico retenido. A continuación, las puntas True se secan al aire mediante 80 ciclos a alta velocidad por encima de la placa de lavado.Ahora, las puntas True se mueven a la posición 13, donde el tampón eluciano A pasa dos ciclos a través de ellas cinco veces, liberando el ADN en la placa de pocillos profundos. Las puntas True ahora se expulsan al contenedor de desechos. Ahora el programa ha finalizado.Retire la placa de elución del instrumento y transfiera las muestras extraídas a los tubos adecuados para almacenamiento o aplicaciones posteriores. El programa también puede personalizarse para transferir automáticamente las muestras finales al tubo o placa deseado en solo una hora. El sistema automatizado extrajo ADN genómico de 96 muestras de sangre utilizando el robot.Los perfiles de absorbancia de 45 muestras de sangre positivas se procesaron simultáneamente con 45 blancos de reactivo. La relación promedio de dos 60 a dos 80 fue de 1,96, y la relación promedio de dos 60 a dos 30 fue de 1,93, lo que sugiere muestras puras en un gel de agarosa al 1%. Muestras aleatorias mostraron un peso molecular alto con mínima degradación.El rendimiento promedio fue de aproximadamente cinco microgramos de ADN por 200 microlitros de sangre completa. Al optimizar el protocolo automatizado con puntas verdaderas, se toma especial precaución para asegurar que no haya contaminación cruzada entre pozos. La PCR en tiempo real muestra una separación clara entre positivos y negativos, como se observa aquí.Para extracciones de ARN, la extracción completa de 96 muestras puede completarse en menos de una hora con un tiempo mínimo de manipulación manual requerido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ADN genómico humano de sangre completa utilizando la tecnología TRU automatizada en la estación de trabajo de manipulación de líquidos Hamilton Star.

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