De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el ADN genómico humano de sangre total, utilizando la tecnología de extracción con puntas True mediante la estación de manipulación líquida Hamilton Star. Para lograrlo, se aspiran y dispensan varias veces a través de las puntas True una solución compuesta por el tampón de lisis de la muestra de sangre, proteinasa K y etanol, lo que permite la unión del ADN a la matriz de las puntas True. A continuación, se hacen pasar dos tampones de lavado separados a través de las puntas True con el fin de eliminar las proteínas residuales, el tampón de lisis y otros contaminantes de los ácidos nucleicos retenidos.

En el tercer paso, la matriz de unión de la punta verdadera se seca aspirando y dispensando aire varias veces para evaporar cualquier tampón de lavado residual; en el paso final, el tampón de ilusión se hace fluir hacia adelante y hacia atrás a través de la matriz de unión para liberar el ADN de la matriz. Mediante la tecnología de punta verdadera, se extrae así ADN genómico de alto peso molecular libre de contaminantes, lo cual puede confirmarse mediante absorbancia UV-vis, electroforesis en gel y PCR cuantitativa o secuenciación. Las ventajas de la punta verdadera frente a otros métodos de preparación de muestras basados en columnas de centrifugación o partículas magnéticas son que la punta verdadera es fácil de automatizar.

No requiere sistemas costosos con centrífugas y varillas magnéticas, y el flujo de trabajo sencillo ahorra espacio valioso en la plataforma. Aunque hoy nos centraremos en sangre completa, Tru Tip puede aplicarse a otras aplicaciones de muestras de ADN genómico, así como al ARN viral de muestras clínicas de hisopos o al aislamiento de ADN libre de células del plasma, por mencionar algunas. Quien demostrará el procedimiento será Dane Brady, ingeniero de automatización de nuestro laboratorio, quien ha tenido un papel fundamental en el desarrollo del procedimiento de extracción con Tru Tip en la estación de manipulación de líquidos Hamilton.

En este protocolo, un robot de manipulación de líquidos Hamilton Star extrae simultáneamente ADN de 96 pocillos de sangre total. El Hamilton Star cuenta con una unidad opcional de agitador calefactor en la plataforma, lo cual es importante para la digestión enzimática de ciertas matrices clínicas como la sangre total. Debido a que el sistema puede equiparse con una cabeza de pipeta de 96 canales, existe una placa de 96 pocillos dedicada para cada uno de los pasos y reactivos con puntas verdaderas.

Primero encienda el equipo asociado al robot Hamilton Star y la computadora. Abra el software Hamilton Run Control. Abra el archivo de corrida proporcionado por ACON para 96 muestras.

Ahora configure la disposición del deck de la pipeta siguiendo el diagrama. Coloque puntas filtradas de un mililitro en todas las posiciones marcadas como uno; en la posición dos, coloque puntas sin filtro de un mililitro; en la posición tres, coloque puntas Conni Hamilton de un mililitro LPT de dos milímetros. Continúe consultando la tabla para llenar las posiciones restantes, de la cinco a la 12, con los materiales LabWare requeridos, pero aún no cargue las muestras.

Ahora distribuya los reactivos: 75 mililitros de tampón de lisis y unión. F debe cargarse en la posición cinco del canal. Alternativamente, también se podrían usar placas precargadas con tampones para agilizar el montaje y simplificar la disposición del deck.

Continúe cargando el robot según corresponda. Por último, retire las tapas de los tubos de sangre y colóquelos en los estantes portamuestras o en la posición cuatro del platino. Coloque la muestra uno en la parte trasera del portamuestras más a la izquierda y avance secuencialmente por cada portamuestras, finalizando con la muestra 96 en la posición delantera derecha.

Una vez que todas las muestras estén cargadas, déjelas equilibrar a temperatura ambiente. Dado que el protocolo es completamente automatizado, existe poca posibilidad de error por parte del operador. Las muestras deben colocarse en el orden correcto en el soporte, pero puede implementarse la codificación por códigos de barras para garantizar un seguimiento adecuado de las muestras.

Para iniciar un script automatizado, seleccione el botón de reproducción en la esquina superior izquierda de la ventana del archivo de ejecución e ingrese el número de muestras que se están procesando. El primer paso que ejecuta el script es transferir 80 microlitros de proteinasa K a la placa de incubación en la posición 14 del módulo calefactor con agitación. A continuación, el script dispensa 200 microlitros de muestra en cada pocillo de la placa de incubación utilizando el brazo de ocho canales.

A continuación, se dispensan 600 microlitros del tampón de lisis F en cada pocillo de la placa de incubación utilizando el brazo de 96 canales. Luego, el programa mezcla la solución durante 10 ciclos e incuba las muestras durante 20 minutos a 70 grados Celsius y 500 RPM en la placa de pocillos profundos; la temperatura es únicamente de 60 Celsius, lo cual se encuentra dentro del rango de actividad de la proteinasa K. Mientras las muestras están en incubación, el sistema de manipulación de líquidos continúa operando dispensando los reactivos de extracción y elución desde los depósitos de reactivos principales hacia sus placas de 96 pocillos correspondientes; se añaden 100 microlitros del tampón Elucian A en cada pocillo de la placa de pocillos profundos.

En la posición 13, se depositan 800 microlitros de etanol en cada pocillo de la placa de pocillos profundos. En la posición 10, se añaden 1,6 mililitros de tampón de lavado K a cada pocillo de la placa de pocillos profundos en la posición 12 y 1,6 mililitros de tampón de lavado J se añaden a cada pocillo de la placa de pocillos profundos en la posición 11. Tras la incubación de 20 minutos, la mezcla de muestra se transfiere desde la placa de incubación a la placa de pocillos profundos que contiene etanol en la posición 10, donde se mezcla mediante 12 ciclos de pipeteo.

Durante todo el proceso, las puntas de reactivos se descartan en el contenedor de desechos según sea necesario. El programa continúa desde el proceso de lisis hasta la extracción de ADN cargando primero 96 puntas verdaderas desde la posición tres del deck. El siguiente paso consiste en aspirar y dispensar las muestras en la posición 10 durante 10 ciclos, uniéndose así los ácidos nucleicos al monolito de la punta verdadera.

A continuación, las puntas True pasan a la posición 11, donde el tampón de lavado J se hace circular a través del monolito cinco veces para eliminar restos de lisado, tampón y matriz de la muestra. Luego, las puntas True pasan a la posición 12, donde el tampón de lavado K se hace circular a través de ellas cinco veces para eliminar proteínas y otros contaminantes del ácido nucleico retenido. A continuación, las puntas True se secan al aire mediante 80 ciclos a alta velocidad por encima de la placa de lavado.

Ahora, las puntas True se mueven a la posición 13, donde el tampón eluciano A pasa dos ciclos a través de ellas cinco veces, liberando el ADN en la placa de pocillos profundos. Las puntas True ahora se expulsan al contenedor de desechos. Ahora el programa ha finalizado.

Retire la placa de elución del instrumento y transfiera las muestras extraídas a los tubos adecuados para almacenamiento o aplicaciones posteriores. El programa también puede personalizarse para transferir automáticamente las muestras finales al tubo o placa deseado en solo una hora. El sistema automatizado extrajo ADN genómico de 96 muestras de sangre utilizando el robot.

Los perfiles de absorbancia de 45 muestras de sangre positivas se procesaron simultáneamente con 45 blancos de reactivo. La relación promedio de dos 60 a dos 80 fue de 1,96, y la relación promedio de dos 60 a dos 30 fue de 1,93, lo que sugiere muestras puras en un gel de agarosa al 1%. Muestras aleatorias mostraron un peso molecular alto con mínima degradación.

El rendimiento promedio fue de aproximadamente cinco microgramos de ADN por 200 microlitros de sangre completa. Al optimizar el protocolo automatizado con puntas verdaderas, se toma especial precaución para asegurar que no haya contaminación cruzada entre pozos. La PCR en tiempo real muestra una separación clara entre positivos y negativos, como se observa aquí.

Para extracciones de ARN, la extracción completa de 96 muestras puede completarse en menos de una hora con un tiempo mínimo de manipulación manual requerido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ADN genómico humano de sangre completa utilizando la tecnología TRU automatizada en la estación de trabajo de manipulación de líquidos Hamilton Star.