Name: Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a medir la dinámica del calcio en neuronas individuales de C. elegans mediante indicadores fluorescentes y microscopía de video. Este método permite estudiar la actividad neuronal in vivo de forma simple y rentable.

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Varias personas contribuyeron al trabajo descrito en este documento. CVG construyó el montaje experimental, y LS, SHC, y CVG realizado los experimentos. CVG y SHC escribió el manuscrito. Todos los autores participaron posteriormente en el proceso de revisión y aprobó la versión final del manuscrito. Damos las gracias a Paul Sternberg para la cepa GCaMP. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). El programa de análisis de imagen MATLAB se adaptó del que se utiliza en 18. Los autores recibieron el apoyo de la Universidad de Boston y el Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configuración óptica <ol><li> El uso de un microscopio compuesto estándar con capacidades de imagen de epifluorescencia. Utilizamos una Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertido con un iluminador Intensilight HG. </li><li> Para una mejor imagen y calidad de la señal utiliza un gran aumento, objetivo gran apertura numérica. Nos suelen utilizar una Nikon X60 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite. En algunos casos es posible usar menor aumento (X40, X20) dependiendo del nivel de expresión del fluoróforo y fuerza de la señal. </li><li> Utilice una alta sensibilidad enfriado cámara CCD, tal como una cámara de Andor Clara para maximizar la sensibilidad de la imagen y minimizar el ruido de fondo. </li><li> Para fluoróforos individuales de color utilizan el filtro microscopio de fluorescencia estándar diseñado para establecer la longitud de onda particular del fluoróforo. Para GCaMP utilizar un filtro estándar de GFP conjunto optimizado para la excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. No hay modificaciones ópticas se necesitan más. </li><li&gt; Para fluoróforos ratiometric, tales como cameleon, utilizar un sistema de imagen dual de tal manera que las imágenes pueden ser idénticos simultáneamente, se captura en dos longitudes de onda separadas. Esto se logra mediante la proyección de las imágenes de doble lado a lado en la cámara. Una configuración sencilla de lograr esto, utilizando componentes ópticos básicos en una placa de pruebas de calidad óptica, se ilustra en la figura 1. Se compone de: <ol class="ualpha"><li> Un filtro microscopio ajustado con 440 ± 20 nm de excitación y filtro de 455 nm de paso largo espejo dicroico. </li><li> Una máscara de imagen colocada en el plano de la imagen inicial inmediatamente fuera de la imagen de microscopio puerto (donde el sensor de la cámara CCD generalmente se sentaban). Esto limita el campo de visión de tal manera que se llene sólo un medio de sensor de la cámara. La colocación de esta máscara a los resultados de primer plano de la imagen en las fronteras y la superposición de imágenes nítidas sin que las dos imágenes se proyectan de lado a lado. </li><li> La lente de primer relé establecer una longitud focal lejos de tél plano de la imagen inicial tal que colima la luz. </li><li> Un espejo dicroico que divide la luz en las dos longitudes de onda de formación de imágenes separadas o canales que reflejan un color (&gt; 515 nm, amarillo), mientras que la transmisión de la otra (&lt;515 nm, cyan). </li><li> Filtros de emisiones (filtros de paso de banda) que restringen aún más la luz transmitida a las longitudes de onda específicas de imagen (cian a 485 ± 40 nm y amarillo a 535 ± 30 nm), </li><li> Las lentes de relé segundos (uno para cada canal) colocados en las trayectorias de rayos de tal manera que se vuelve a enfocar la luz a un segundo plano de imagen en la cámara CCD. </li><li> Un par de espejos y un segundo espejo dicroico dirige las trayectorias de rayos de tal manera que las dos imágenes recombinan y se proyectan de lado a lado en el sensor de la cámara CCD. Figura 4A muestra un ejemplo de la imagen resultante. </li></ol></li><li> La alineación óptica inicial: Iniciar la configuración y alineación de la óptica con un alto contraste image utiliza un objetivo de bajo aumento y se transmite de amplio campo de iluminación de luz (un rotulador negro dibujado en un portaobjetos de microscopio funciona bien). Llevar la imagen para enfocar a través de los oculares del microscopio y después se cambiaron al puerto microscopio para ser utilizado. Con la iluminación de luz de alta visualizar la imagen en una tarjeta en el plano focal inicial (unos pocos centímetros fuera del puerto microscopio). Coloque la primera lente de retransmisión (C) en la trayectoria del haz de tal manera que es una distancia focal desde el plano focal inicial y colima la luz mientras no desviar la trayectoria del haz (es decir, se centra directamente en la trayectoria del haz). Coloque la máscara en el primer plano focal, ajustado para restringir medio del campo de visión y producir una frontera nítida en la imagen. Coloque los espejos y filtros (D, E, G) de manera que la trayectoria del rayo se mantiene paralelo a la superficie de la mesa y se ejecuta en dos trayectorias paralelas de lado a lado, como se muestra en la Figura 1B. Centro de las lentes de relé segunda (F) en sus respectivas trayectorias de rayos ymoverlos hacia atrás y adelante a lo largo de los caminos para llevar las imágenes a un foco en una ficha colocada fuera el sensor de la cámara CCD será. Si se hace correctamente las dos imágenes deben ser parfocal con los oculares del microscopio y otros puertos de cámara. Por último colocar la cámara en posición y ajustar la alineación. </li><li> Alineación Fine Tuning óptico: Utiliza la imagen dual visto por la cámara CCD para afinar la alineación óptica. Utilizar una imagen de alto contraste y comenzar con un menor aumento, el cambio a un aumento mayor para la alineación final. Coloque la imagen transmitida (cian canal en la Figura 1B) para cubrir una media de campo de la cámara de vista moviendo la cámara en la posición X e Y. la imagen reflejada (canal amarillo en la Figura 1B) para cubrir la otra mitad del campo de ver mediante el ajuste de las últimas dos espejos (G) en su trayectoria del haz. Optimizar el enfoque moviendo la lente segundo relé para cada canal de un lado a otro a lo largo de la trayectoria del haz. Si se dejainalterada la configuración óptica debe ser estable y sólo requieren un ajuste excepcional sintonía fina. </li></ol> 2. Preparación de la muestra y la adquisición de datos. <ol><li> Adquirir animales que expresan un fluoróforo sensible al calcio en la neurona de interés desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) o de otras fuentes. Alternativamente animales transgénicos se pueden construir utilizando estándar de C. elegans técnicas. Expresión de células individuales no es necesario (y, a veces no es deseable si múltiples neuronas han de ser investigados, véase 12), siempre y cuando las imágenes y las mediciones de células múltiples se pueden separar fácilmente. Si el transgén fluoróforo no se integra en el genoma, la variación significativa en la expresión puede ocurrir de animal a animal. En este caso, la preselección de los animales con los niveles de expresión más altos, utilizando un microscopio de disección fluorescente aumenta la relación señal a ruido y mejora las mediciones. Los niveles de expresión fluoróforo need que es suficiente para ser fácilmente imágenes con la cámara bajo los parámetros de adquisición requeridas por el experimento. </li><li> Hacer las almohadillas de agarosa requeridos para la técnica de inmovilización deseado (ver más abajo 2,3) pulsando una pequeña gota de agarosa fundida entre dos placas de vidrio separadas por dos piezas de cinta de laboratorio. Si es necesario, almohadillas de agarosa puede ser transferida a una hoja de cubierta de vidrio antes de montar los animales. Véase la Figura 2. </li><li> Inmovilizar C. elegans para formación de imágenes utilizando una de las técnicas siguientes: <ol class="ualpha"><li> Paralización Farmacológica: Agregar un 0,05% a 2% Levamisol pastillas de agarosa (mezclándolo con la agarosa fundida antes de tomar las pastillas en 2,2). Elige animales 5-10 en la almohadilla y se cubre con un cubreobjetos. Aplique pequeñas cantidades de mezcla de cera caliente (50% de cera de parafina y 50% de vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. Permitir 5-10 minutos para el levamisol a surtir efecto y los animales a become completamente inmóvil. </li><li> Stiff Inmovilización Agarosa: C. elegans puede ser físicamente inmovilizada usando rígidos 10% almohadillas de agarosa y 0,05 m de diámetro nanopartículas de poliestireno. Hacer 10% de agarosa almohadillas (10% de agarosa en tampón de NGM en peso) como en 2,2. Añadir ~ 3 l de solución de bolas (1:10 microesferas de poliestireno en NGM en volumen) a la parte superior de la almohadilla. Rápidamente, recoger 5-10 C. elegans en la piscina de solución de bolas en el teclado y suavemente cubrir con un cubreobjetos. Use cera fundida se aplica a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. (Para más detalles sobre esta técnica véase 7, así como un artículo anterior JoVE 8) </li><li> Encolado: C. elegans puede ser pegado en su lugar usando pequeñas cantidades de adhesivo de grado veterinaria aplicada a un lado del animal. </li><li> Los dispositivos microfluídicos: Numerosos dispositivos microfluídicos se han diseñado para sostener físicamente C. elegans en lugar de imágenes. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Colocar el portaobjetos preparado en el microscopio y se centran en la neurona deseado. Es a menudo más fácil para encontrar el C. elegans utilizando iluminación de campo claro con pocos aumentos. Luego de cambiar a gran aumento y de imágenes de fluorescencia para encontrar y centrarse en la neurona específica. </li><li> Estímulo: Si una respuesta neuronal a un estímulo específico que se desee (campo de luz, eléctrica, señales gustativas y olfativas, temperatura, etc), el aparato de estímulo debe ser diseñada en la configuración de microscopio, de tal manera que se puede administrar a los animales en la preparación de la muestra mientras que las imágenes. </li><li> Adquirir imágenes con la cámara CCD microscopio. Los tiempos de exposición y el nivel de luz de excitación depende de la señal de línea de base y nivel de expresión del fluoróforo, con las señales más débiles que requieren largos tiempos de exposición con resolución de tiempo concordantemente menos. Nos suelen utilizar tiempos de exposición ~ 300 ms. </li><li> Adquisición de imágenes de forma individual o como una TIme de intervalo. Debido a que C. elegans neuronas muestran generalmente lenta dinámica de activación (es decir, que carecen de los potenciales de acción basados ​​en sodio), velocidades de cuadro relativamente lentas de ~ 1 seg suelen ser suficientes para medir la dinámica de las neuronas. Velocidades de adquisición de hasta ~ 90 cuadros por segundo se han utilizado aunque éstos pueden estar limitados por el tiempo de integración necesaria para la fluorescencia débil. Los vídeos individuales de una sola neurona puede extender durante varios minutos (min ~ 5-10) o más si la inmovilización preparación es estable y la velocidad de cuadros relativamente lento. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Hay un número de diferentes paquetes de software de imágenes fluorescentes disponibles con capacidades de análisis dinámicos y radiométrica incluyendo ImageJ y NIS-elementos. Usamos un programa MATLAB personalizado simple que mide la media de la señal fluorescente sobre una región seleccionada de interés. </li><li> Para las imágenes individuales (o time-lapse películas que permanecenperfectamente inmóvil) seleccionar una región de interés (ROI) dentro de la neurona formado la imagen y una región separada cercano para la medición del fondo. Para imágenes ratiometric seleccionar ROI similar y las regiones de fondo para cada una de las dobles imágenes. </li><li> Un ligero movimiento de la neurona imagen formada dentro de una película de lapso de tiempo requiere un análisis adicional para seleccionar automáticamente la ROI en cada trama, lo que se puede lograr utilizando numerosos sistemas de seguimiento de objetos. Nuestro programa muestra una imagen comprimida de todas las imágenes de la película de la que está manualmente un límite aproximado (que abarca el objeto de los intereses de todos los marcos) seleccionado y selecciona una región de fondo independiente. Para la primera trama, una ROI se selecciona manualmente desde dentro de la región límite. Para cada trama posterior, el programa selecciona los píxeles más brillantes dentro de la región límite de generar un retorno de la inversión del tamaño correcto (es decir, el mismo número de píxeles como la ROI primer fotograma manual). Para las imágenes donde el objetivot de intereses es suficientemente brillante que el fondo circundante dentro de la región límite de este protocolo selecciona una ROI razonable para cada trama. </li><li> La señal fluorescente, F, para cada trama se calcula como la media de intensidad de los píxeles en la ROI menos la intensidad media en la región del fondo. Valores ratiométrica se calcula como la relación de las dos señales (YFP-YFP fondo) / (CFP-PPC fondo) -0,65. El factor de 0,65 compensa sangrado a través del canal de PPC en el canal de YFP, que será dependiente de los fluoróforos, así como el conjunto de filtro particular utilizado (este valor es normalmente ~ 0,6 para las configuraciones de cameleon). </li><li> El nivel de calcio relativa para cada trama se calcula como el porcentaje de cambio en intensidad normalizada a un valor de referencia inicial medido desde el primer fotograma (o una serie de fotogramas): Df / F = (F (t)-F o) / F o, donde F (t) es la fluorescencia en el tiempo t y o Fes el valor de referencia inicial. </li><li> Un ROI seleccionar el cuerpo de la célula genera las señales más fuertes más robustos, pero también es posible seleccionar y medir las señales de un retorno de la inversión a lo largo de los procesos nerviosos. </li></ol> 4. Resolución de Problemas <ol><li> Blanqueo: La exposición a la luz de excitación puede causar la decoloración del fluoróforo y se caracteriza por una disminución constante de la señal que es dependiente de los niveles de exposición. Mediciones ratiométrica ayudar a compensar esto. Sin embargo blanqueo selectivo de una longitud de onda pueden ocurrir (por lo general más rápido blanqueadores PPC YFP entonces). Si se produce decoloración reducir el nivel de exposición a la luz mediante la reducción de los tiempos de exposición y / o la intensidad de excitación (con filtros de densidad neutra en la vía de iluminación). Si es necesario, se puede compensar para el blanqueo mediante la ejecución de ensayos simulados (con la exposición de excitación mismo pero sin estímulo neuronal) y la cuantificación de la constante de tiempo de caída de la señal. </li><li><strong&gt; Inmovilización: Para el análisis de imágenes simple descrito aquí es fundamental el animal permanece relativamente quieto durante toda la filmación C.. elegans responder a la exposición a la luz y estímulos experimentales, haciéndolos más probable que se mueva en el momento de la grabación. Un ligero movimiento puede introducir ruido significativo en la medición, especialmente cuando se mide a partir de los procesos axonales. Análisis radiométrico ayuda a mitigar estos efectos hasta cierto punto y las mediciones desde el cuerpo celular son más robustos. Ejecución cuidadosa y perfeccionamiento de los procedimientos de inmovilización dará lugar completamente inmóvil animales. </li><li> Selección del fondo: selección cuidadosa de una región de fondo es necesaria para el análisis de imagen de éxito. Regiones fondo debe ser razonablemente uniforme y más oscuro que la neurona de imágenes. Debe estar lo suficientemente retirado para evitar la luz dispersada (y por lo tanto una señal de recogida) desde la neurona de imágenes. Nos encontramos con una región uniforme 20-50 m desde el retorno de la inversión funciona bien en la mayoría de los casos. </li><li> Óptica Proporcional: La correcta alineación de la óptica de imagen es esencial para generar una imagen dual clara. Archivos adjuntos Comerciales microscopio para obtener imágenes radiométrica están disponibles. Una técnica alternativa es emplear rápida de imagen secuencial usando una rueda de filtro rápido para cambiar rápidamente entre longitudes de onda de emisión durante la grabación de imágenes independientes para cada uno. </li><li> Análisis radiométrico: El análisis descrito aquí es una técnica relativamente simple que genera señales de sólidos en virtud de un promedio de más de un ROI. Se requiere un objeto reconocible brillante para seleccionar el ROI. Más análisis radiométrico sofisticado es posible por alineando con precisión y la cartografía de las dobles imágenes tales que la relación fluorescente se puede calcular píxel por píxel. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Genéticamente codificados indicadores de calcio se han utilizado ampliamente en C. elegans neurobiología. Numerosos grupos han empleado estas técnicas para estudiar la respuesta de las neuronas sensoriales primarias a estímulos externos como se demuestra aquí con la respuesta ASJ a un campo eléctrico. Ejemplos destacados incluyen sensación del tacto mecánico, productos químicos específicos, la temperatura y un campo eléctrico 12, 16-19. Actividad de interneuronas y células musculares también han sido...

Aquí presentamos métodos prácticos para la formación de imágenes in vivo del calcio en C. Elegans neuronas. El desarrollo de las codificadas genéticamente sensibles calcio-fluoróforos con alta relación de señal a ruido hace C. elegans un sistema efectivo comparativamente sencillo y rentable para la medición de la neurofisiología y la actividad. Nuestra formación de imágenes se realiza con un microscopio compuesto estándar utilizando amplio campo de imágenes de fluorescencia de los fluoróforos disponibles comúnmente. Se presentan varias técnicas que emplean diferentes fluoróforos y preparaciones diferentes de la muestra, discutir las fortalezas y debilidades de cada uno. Los datos se presentan a continuación, a partir de dos experimentos de ejemplo. Un excelente recurso adicional sobre las técnicas descritas aquí se pueden encontrar en WormBook, &quot;Imagen de la actividad de las neuronas y los músculos&quot; por R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Dos clases principales de genéticamentecamente codificados reporteros fluorescentes de calcio se utilizan comúnmente en C. elegans: GCaMP solo canal y cameleon FRET basada. Vamos a describir los métodos y ejemplos para mostrar los datos generados por cada uno. GCaMP se basa en una modificación de la proteína verde fluorescente (GFP) que es sensible a la concentración de calcio circundante. Esto se logra mediante la fusión de GFP y la calmodulina calcio de alta afinidad de proteína, de tal manera que la unión del calcio por la calmodulina lleva la molécula de GFP en una confirmación eficiente fluorescente 2. Los recientes avances en estos fluoróforos generar tamaño de la señal excepcional con hasta 500% de aumento en la intensidad de fluorescencia en un rango fisiológico de los niveles de calcio y la cinética razonablemente rápidos de ~ 95 ms tiempo de subida y el tiempo de decaimiento ~ 650 mseg 4. Durante períodos de tiempo relativamente cortos (minutos), estas señales pueden permitir grandes para obtener imágenes de resolución más baja (menor magnificación) y, dado un buen comportamiento initmedida de referencia ial, niega la necesidad de línea de base continua o mediciones comparativas. Cameleon tiene la ventaja de ser un fluoróforo FRET basada en el que genera una medición radiométrica comparando dos canales independientes o longitudes de onda 1. Se compone de dos fluoróforos diferentes (proteínas fluorescentes cian y amarillo, emisores de PPC y YFP) unidos por una proteína calmodulina. El complejo está iluminado con luz azul (440 nm) que excita la PPC. La unión de calcio trae los fluoróforos más juntos, aumentando la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) de la PPC (donante) a la YFP (aceptor) y provocando la emisión PPC (480 nm) para disminuir la emisión y YFP (535 nm) para aumentar . Los niveles relativos de calcio se mide como la relación de la intensidad YFP / CFP. Cinética Cameleon son más lentas que la de GCaMP, medido in vivo para tener un tiempo de subida de ~ 1 sec y un tiempo de desintegración de 3 ~ 5 seg. Sin embargo,la relación de las señales que se mueven opuestamente aumenta el tamaño de la señal y compensa un número de posibles artefactos debido a los cambios en la concentración de fluoróforo, el movimiento o la deriva enfoque y blanqueo. Codificados genéticamente reporteros fluorescentes negar gran parte de la preparación de la muestra requiere exógenamente con sondas administrados y C. elegans pequeño cuerpo transparente permite visualizar imágenes en el animal intacto utilizando fluorescencia sencilla de campo amplio. El principal reto técnico en preparación de la muestra es por lo tanto, para inmovilizar de forma segura a los animales. Hay un número de diferentes técnicas comúnmente utilizadas cada uno con ventajas y desventajas. El uso de un agente farmacológico para paralizar a los animales es fácil de implementar y permite el montaje de múltiples animales en una preparación (Levamisol, un agonista colinérgico que hace que el tejido muscular para aprovechar se utiliza típicamente 6). C. elegans también puede ser físicamente inmovilizada mediante el montaje de losen 10% de agarosa rígido 7, 8. Esto minimiza el impacto en la fisiología del animal, permite a largo plazo de imágenes (horas) y la recuperación de varios animales, pero es más difícil técnicamente. Ambas técnicas restringir el acceso físico a los animales (que están bajo un cubreobjetos) y, por tanto, sólo pueden utilizarse con ciertos estímulos experimentales (tal como luz, temperatura, campo eléctrico o daño láser). Para los estímulos que se requiere acceso físico, como el tacto o la administración de los productos químicos, muchos estudios han pegado con éxito C. elegans en su lugar (el uso de pegamento de grado veterinario) 9. Esto es técnicamente más difícil, es una preparación solo animal y no permite la recuperación de los animales. Por último, numerosos dispositivos de microfluidos han sido empleados que físicamente restringir C. elegans, preservando la fisiología animal, permitiendo la exposición a la mayoría de los tipos de estímulos (dependiendo del diseño del dispositivo) y puede permitir el intercambio rápido y la recuperación de los animales <sup&gt; 10, 11. Sin embargo microfluidos adicionales requieren habilidades técnicas y capacidades en diseño, fabricación e implementación. En actividad inmovilizado animales y estímulo respuesta generalmente se puede medir en sensorial y interneuronas. Actividad de las neuronas motoras requiere de técnicas más sofisticadas para la formación de imágenes en movimiento en los animales. Aquí vamos a presentar métodos detallados que emplean las dos técnicas más sencillas de paralización e inmovilización farmacológica con rigidez de agarosa. Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para medir la actividad neuronal y la fisiología celular en C. elegans. Damos un ejemplo de cada uno de: el uso de GCaMP para medir la respuesta de la neurona sensorial ASJ a un campo eléctrico externo, y utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológica a la lesión con láser de una neurona. Estos ejemplos muestran las ventajas y los inconvenientes de los dos tipos de fluoróforos e ilustran lo que es posible con el sistema.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Eclipse Ti-U invertido </td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Iluminador</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fuente de luz fluorescente</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Óleo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa óptica o placa de pruebas de grado óptico 3'X3</td>' <td>Thor Labs</td><td></td><td>Si no se utiliza una mesa óptica placa de pruebas de grado óptico en una mesa < laboratorio sólida > debería ser suficiente.</td></tr><tr><td>Cámara interlínea Clara</td><td>Tecnología Andor </td><td></td><td>Cámara CCD de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>Juego de filtros GFP para la adquisición de imágenes GCaMP</td></tr><tr><td>Filter 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td> Filtro de excitación <td>D440/20x EX</td><td>para cameleón</td></tr><tr><td>Espejo dicroico > 455 nm paso largo</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>Microscopio dicroico para imágenes de cameleon </td></tr><tr><td>Espejo dicroico > 515 nm paso largo</td> Espejo dicroico <td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>para cameleon Filtro de imagen</td></tr><tr><td>535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m Filtro</td><td>de emisión EM YFP</td></tr><tr><td>Filtro 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m Filtro</td> de emisión EM <td>CFP</td></tr><tr><td>Lente, 200 mm, Acromático</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Lente de relé para óptica FRET (3)</td></tr><tr><td>Espejo de banda ancha plateado</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>Óptica FRET (2)</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> NGM<td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microesferas</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2,5% por volumen, 50 nm de diámetro</td><td>nanopartículas de poliestireno para C. elegans inmovilización</td></tr><tr><td>Cepa transgénica, Cepa gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Strain PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Cepa transgénica, mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>Strain CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

El gusano nematodo C. elegans es un organismo modelo ideal para relativamente simple, formación de imágenes de bajo coste neuronal in vivo. Su pequeño cuerpo transparente y simple, bien caracterizado sistema nervioso permite la identificación y obtención de imágenes de fluorescencia de cualquier neurona en el animal intacto. Técnicas sencillas de inmovilización con un impacto mínimo sobre la fisiología del animal permitir extendido time-lapse de imágenes. El desarrollo de los fluoróforos de calcio genéticamente codificados sensibles como cameleon 1 y 2 GCaMP permitir la formación de imágenes in vivo de calcio neuronal relacionada tanto fisiología celular y la actividad neuronal. Numerosas cepas transgénicas que expresan estos fluoróforos en neuronas específicas están fácilmente disponibles o se pueden construir utilizando técnicas bien establecidas. A continuación, se describen los procedimientos detallados para medir la dinámica del calcio dentro de una sola neurona in vivo utilizando tanto GCaMP y cameleon. Se discuten las ventajas y disadvantedades de ambos, así como varios métodos de preparación de la muestra (inmovilización animal) y análisis de imagen. Finalmente, se presentan los resultados de dos experimentos: 1) Usando GCaMP para medir la respuesta sensorial de una neurona específica a un campo eléctrico externo y 2) Utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológico de una neurona a daño traumático láser. Técnicas de formación de imágenes de calcio tales como éstos se utilizan ampliamente en C. elegans y se han extendido a las mediciones en los animales que se desplazan libremente, neuronas de forma simultánea y la comparación entre fondos genéticos. C. elegans presenta un sistema robusto y flexible para imágenes in vivo neuronal con ventajas sobre otros sistemas modelo de sencillez técnica y coste.

Aquí se presentan los resultados de dos experimentos separados. El primero emplea GCaMP para medir la respuesta de una neurona sensorial específico a un estímulo externo definido, dando un buen ejemplo de cómo los reporteros fluorescentes de calcio se puede utilizar para controlar ópticamente la actividad neuronal en intacto C. elegans. El segundo emplea cameleon para medir el calcio intracelular transitoria activa dentro de una neurona en respuesta al daño del láser específico, lo que ilustra cómo la fisiologí...

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos,<em&gt; C. elegans</em&gt; Hace que un organismo modelo ideal para<em&gt; In vivo</em&gt; Imagen neuronal utilizando relativamente simples y de bajo costo técnicas. Aquí se describe imagen única neurona dentro de animales adultos intactos utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio fluorescente.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

El objetivo general del siguiente experimento es emplear fluoro cuatro codificados genéticamente para medir la dinámica del calcio de neuronas individuales dentro del gusano nematodo. Vea la elegancia, esto se logra montando y desmovilizando primero la elegancia C intacta que expresa un fluoróforo sensible al calcio en las neuronas de interés en un portaobjetos de microscopio estándar. A continuación, se obtienen imágenes de las neuronas individuales in vivo utilizando microscopía de vídeo y técnicas estándar de imagen epifluorescente.Luego, el video se analiza para medir la intensidad de fluorescencia en ubicaciones específicas de la neurona para dos campos G de Fluor 4s de uso común, lo que proporciona una señal robusta de un solo canal de gran amplitud y un camaleón basado en trastes, que genera una relación de canal dual. Los resultados de la medición métrica se obtienen de la actividad neuronal mostrada en respuesta a un estímulo sensorial específico, así como de la fisiología del calcio celular en respuesta al daño celular, ambos basados en la medición óptica de los niveles relativos de calcio dentro de la neurona fotografiada. Las principales ventajas de esta técnica sobre m

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Neurociencia

Este video presenta los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pocillos de agarosa moldeados.

Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en C. elegans vivos

Este video muestra una técnica para obtener imágenes de calcio en neuronas individuales de Caenorhabditis elegans utilizando proteínas reporteras fluorescentes codificadas genéticamente. Describe los pasos involucrados en la obtención de imágenes del movimiento de los gusanos y la medición de las proporciones de fluorescencia reportera de las neuronas para correlacionar los niveles de calcio intracelular con la actividad neuronal y los cambios de comportamiento durante la puesta de huevos.

Imágenes de calcio en neuronas individuales que regulan el comportamiento de puesta de huevos en Caenorhabditis elegans

Fuente: Doser, R., et al. Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra imágenes in vivo del flujo de calcio subcelular en las neuronas del cordón nervioso ventral de cepas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Se emplean dos indicadores de calcio distintos: un indicador citoplasmático en una cepa y un indicador mitocondrial en otra. Las neuronas se observan bajo un microscopio de fluorescencia para monitorear los cambios en tiempo real...

Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans

La imagen del comportamiento y la actividad neuronal a largas escalas de tiempo sin inmovilización del animal es un requisito previo para comprender el comportamiento. Las imágenes de cámaras microfluídicas de agarosa (AMI) se pueden utilizar para obtener imágenes de la actividad y el comportamiento neuronal de todas las etapas de la vida de Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Este método proporciona una manera de acoplar optogenéticas y sensores de calcio codificados genéticamente para crear imágenes de los niveles basales de calcio citosólico y cambios en los transitorios de calcio evocados en los músculos de la pared corporal del organismo modelo C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.

Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada

Las espinas dendríticas son características celulares importantes del sistema nervioso. Aquí se describen los métodos de imágenes en vivo para evaluar la estructura y función de las espinas dendríticas en C. elegans. Estos enfoques apoyan el desarrollo de pantallas mutantes para genes que definen la forma o función de la columna dendrítica.

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Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aquí, presentamos protocolos y herramientas para visualizar el calcio durante la fertilización y la embriogénesis temprana utilizando un reportero de calcio codificado genéticamente expresado en la línea germinal del nematodo modelo C. elegans.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Aprende a medir la dinámica del calcio en neuronas individuales de C. elegans mediante indicadores fluorescentes y microscopía de video. Este método permite estudiar la actividad neuronal in vivo de forma simple y rentable.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

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