Name: Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Aprende a establecer Beauveria bassiana como endófito en frijol común mediante aspersiones foliares y drench de suelo. Este método permite evaluar su potencial para el control biológico de plagas agrícolas de forma sostenible.

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La producción y el trabajo experimental presentado en este documento reflejan la ayuda dedicada y entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado por el Departamento Administrativo de Colombia de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias) y por una donación de la Fundación Bill &amp; Melinda Gates Foundation a través de la iniciativa Grand Challenges Exploraciones.

1. Plantas <ol><li> Superficie a esterilizar las semillas de frijol (cv. Calima) sumergiéndolos durante dos minutos en hipoclorito de sodio al 0,5% y dos minutos en 70% de etanol. Enjuague las semillas tres veces en agua destilada estéril. </li><li> Evaluar el éxito de su esterilización mediante siembra de 100 l de la última agua de lavado de la papa dextroxe agar (PDA) medios de comunicación, e incubar la placa durante 10 días a 25 ° C. Terminar y reinicie el experimento si cualquier crecimiento se ve en la placa. </li><li> Plantar las semillas en grupos de tres en macetas que contenían una mezcla estéril de tierra y arena en una proporción de 2:1. Transferir las ollas a una cámara de crecimiento a 25 ° C, ca. 50% de humedad relativa y fotoperíodo 12 h. Una semana después de la germinación, eliminar los menos dos plántulas vigorosas. De agua cada 2-3 días con agua destilada estéril y fertilizar 10 y 20 días después de la siembra con una solución de agua 6 g / l de fertilizante NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Hongo <ol><li> Obtener una comerciacial formulación de Beauveria bassiana cepa GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Para generar un cultivo de una sola espora, suspender ca. un asa de inoculación completo de conidios en 1 ml de una solución de agua 0,1% de Triton X-100 y agitar durante 10 seg. Entonces, la placa 100 l de la suspensión en 2,5% de agar Noble y se incuba durante 24 horas a 25 ° C. Transferir un conidio germina solo en una PDA 100 mm placa que contiene y crecer hasta que cubra toda la placa (ca. semanas 3-4). </li><li> En condiciones estériles, raspar el crecimiento de los hongos de la superficie del medio y suspenderlo en 10 ml estéril 0,1% de Triton X-100. Vortex durante un minuto. A continuación, se filtra la suspensión a través de una gasa estéril para eliminar las hifas y obtener la suspensión de valores. </li><li> Usar un hemocitómetro para estimar la concentración de la suspensión conidial stock. Para facilitar el recuento de conidios, preparar una dilución serial de 10.000 veces de la población, cada vez que la transferencia de 100 l of suspensión de conidias en 900 l de 0,1% de Triton X-100, y agitación en vórtex durante 10 s antes de la siguiente dilución. </li><li> Para generar el inóculo, ajustar la suspensión de stock a una concentración final de 10 8 conidios / ml, usando la fórmula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="ecuación 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Para evaluar la viabilidad de conidios, la placa 100 l de la dilución de 10.000 veces en 2,5% de agar Noble y se incuba durante 24 horas a 25 ° C. A continuación, inspeccione tres grupos al azar de 100 conidios para estimar el porcentaje de germinación. Considere un conidio germinado cuando un tubo germinal visible más largo que el diámetro medio de los proyectos de conidios de ella. Utilice únicamente la suspensión cuando el porcentaje de germinación promedio supera el 90%. </li></ol> 3. Inoculación <ol><li> Se inoculan las plantas cuando llegan a su etapa primera hoja verdadera (unos 14 días después de la siembra). Plantas de agua a la capacidad del suelo estéril con destilared agua 24 horas antes de inoculaciones. </li><li> Para el método de pulverización foliar, utilizar un atomizador manual para aplicar la suspensión de conidias (tratamiento) o 0,1% Triton X-100 (control) a la adaxial (superior) de la superficie de hojas, hasta alcanzar la saturación. Cubrir la parte superior de la olla con papel de aluminio para evitar la escorrentía conidial para el suelo. Después de la pulverización, las plantas cubren con una bolsa de plástico durante 24 horas para mantener un alto nivel de humedad facilitar la invasión de hongos. </li><li> Para el método de empapamiento de tierra, utilice un cilindro graduado para aplicar 10 ml de suspensión de conidias (tratamiento) o 0,1% Triton X-100 (control) a la superficie del suelo en la base de la planta. </li><li> Después de inoculación, las plantas de volver a las cámaras de crecimiento organizarlos en un diseño de bloques completos al azar. No menos de cuatro bloques experimentales adicionales deben ser instalados para permitir evaluaciones de crecimiento de las plantas, además de las evaluaciones de la colonización endofítica, en el mismo experimento. </li></ol> 4. Evalluaciones <ol><li> Evaluar el experimento de un bloque a la vez, la selección de los bloques en orden aleatorio. Esto es particularmente importante para los experimentos de gran tamaño que no pueden ser evaluadas en un solo día. </li><li> Antes de procesar una planta, medir y registrar su altura desde la base hasta el meristemo apical. A continuación, arrancar de raíz con cuidado y lavar abundantemente con agua corriente del grifo. </li><li> De cada planta, muestra dos valvas, dos pedazos de raíz y dos trozos de tallo. Selección de muestras prospecto al azar de la primera hoja verdadera de la planta. A continuación, obtener dos muestras de tallo, 3 cm de largo cada una, a partir de la media de la planta y desde cerca de la superficie del suelo. Finalmente, obtener dos muestras de raíz principal, también de 3 cm de largo cada uno, desde la mitad de la raíz y de 1 cm por detrás de la punta de la raíz. Coloque las muestras en tres bolsas de papel y la etiqueta apropiada. </li><li> Después de lavar y muestreo de todas las plantas en un bloque, comienza el procesamiento de las hojas, luego las raíces, los tallos y, finalmente, los. </li><li> Surface esterilizar tcuestiones en una campana de flujo laminar estéril como en 1,1, por encima. Enjuague cada muestra tres veces por inmersión en agua destilada estéril y dejar secar en una toalla de papel estéril. Entonces, diseccionar y desechar sus bordes exteriores, donde los endófitos podrían haber sido eliminados debido al contacto con desinfectantes. </li><li> Cortar la muestra recortada en seis secciones, con un promedio de 6x6 mm para hojas y 6 mm de longitud de los tallos y raíces. Placa de las seis secciones en un 60 mm placa de Petri con medio PDA suplementado con antibióticos de la tetraciclina, estreptomicina y penicilina a 2 mg / l de cada uno. Sellar la placa con parafilm y se incuba en la oscuridad a 25 ° C. Cada planta produce seis platos, dos por parte de la planta. </li><li> Cambiar el agua de enjuague después de procesar cada bloque de una parte de planta dada. Antes de desechar el agua de lavado utilizado, la placa una muestra de 100 l en los medios de PDA y se incuban durante 10 días a 25 ° C para evaluar el éxito de la esterilización. Si el crecimiento de hongos se produce, no tienen en cuenta las correspondientes muestras para análisis. </li><li> Inspeccione las placas cada 2-3 días durante 20 días para observar y registrar el crecimiento de hongos. Secciones sobre consumos específicos y la transferencia de las plantas exhiben presencia de hongos endófitos de placas que contienen PDA fresco. Esto evitará la contaminación de las secciones de la planta vecinos en la placa original. </li><li> Record B. bassiana crecimiento de secciones de la planta. Beauveria bassiana se pueden identificar por característica micelio blanco denso convertirse en crema a amarillo pálido en el borde. En caso de duda, montar la muestra en una gota de agua e inspeccionar debajo de un microscopio, en busca de globosos conidios y conidióforos en forma de zigzag, característico de la especie. </li><li> Utilice bloques experimentales adicionales para evaluar el impacto de los tratamientos sobre la biomasa vegetal. En primer lugar, medir su altura desde la base hasta la parte superior del meristemo apical. Luego, con cuidado desarraigar las plantas y lavar con agua corriente y dejar secar a 45 º C durante tres días para determinar su peso seco. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Hay muchos factores que pueden influir en el resultado específico de un experimento para establecer un hongo entomopatógeno como endofito. Nuestros resultados demuestran el método de inoculación es una de ellas. Los factores biológicos incluyen a experimentar con el cultivo de especies o cultivares seleccionados y la cepa del hongo entomopatógeno especies o aislar utilizado. Otros factores a considerar incluyen la manipulación de la concentración del inóculo, la edad de la planta durante inoculaciones, y las condiciones de crecimiento de la planta. Sería ideal para un método de inoculación para dar lugar a la colonización planta sistémica por un entomopatógeno 14,17,18,21 hongos. En cambio, parece que los métodos de inoculación tienden a favorecer un patrón específico de colonización local. En el café, por ejemplo, pulverizaciones foliares favorecer la colonización hoja mientras que empapa el suelo favorece colonización de la raíz 17. Encontramos el mismo patrón en el frijol común. En última instancia, la elección del método de inoculación debe serguiada por la ubicación prevista de la endofito dentro de una planta, es de suponer que coincida con el lugar de destino o el herbívoro patógeno de la planta. Aunque comúnmente utilizado, la detección y cuantificación endofito basa en culturas mediáticas puede ser costoso, difícil y propenso a errores. Por ejemplo, un total de 10.800 secciones de la planta (1.800 sembraron en placas de Petri) se evaluaron en un experimento para optimizar B. bassiana inoculaciones de plátano 16. De estos, 4.496 secciones fueron colonizados por un putativo B. bassiana, como se identifica principalmente por la morfología de colonia. Es evidente que una verificación microscópica de la especie para cada colonia habría sido un paso deseable, pero inalcanzable. Por otra parte, 1.176 secciones fueron colonizadas por otros hongos y se descartaron y se trata como datos que faltan 16. La probabilidad existe, sin embargo, que B. bassiana es un mal competidor o más lento para crecer, y eventualmente podría haber surgido de esas secciones si untiempo suficiente llowed. Por lo tanto, los métodos de detección basados ​​en endófitos culturas mediáticas están sujetos a los falsos positivos y falsos negativos. En consecuencia, el desarrollo de una detección más fiable y cuantificación métodos, por ejemplo los basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 20,21,24, está bien justificada. El objetivo final de los experimentos de inoculación debe ser el desarrollo de un tratamiento eficaz que proporciona una resistencia sistémica duradera contra la herbivoría y / o enfermedad. Una plausible, pero como aún no probado, la hipótesis es que el alcance de la colonización endofítica debe correlacionarse positivamente con el grado de endófito resistencia mediada. Un paso natural después de refinar los métodos de inoculación, por lo tanto, podría ser examinar esta correlación. Varios protocolos de vídeo puede ayudar a los investigadores a diseñar un ensayo de resistencia adecuada para una plaga o patógeno 29-31. En última instancia, este ensayo es lo que determina el éxito de la inoculaciónmétodo ción, y el potencial para el control biológico asociado endofítica.

Hongos entomopatógenos son importantes reguladores de las poblaciones de insectos con un potencial considerable como micopesticidas 1. Sólo recientemente, sin embargo, tienen hongos entomopatógenos han demostrado que se producen como endófitos, tanto de forma natural y en respuesta a los métodos de inoculación diferentes 2. La función ecológica de los hongos entomopatógenos endofíticos sigue siendo en gran parte desconocida, pero algunos estudios han implicado en el crecimiento de las plantas 3,4, la resistencia herbívoro 5-8, y la resistencia a la enfermedad 9,10. El objetivo general de los métodos presentados aquí es la introducción de un hongo entomopatógeno como endofito, en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) es el mejor estudiado hongos endofíticos entomopatógeno 5-9,11-19, y está disponible como una mycopesticide comercial. Inoculación probado a establecer <em&gt; B. bassiana como endofito incluyen pociones suelos, revestimientos de semillas 14,17 18 y 14 inmersiones, salsas 13,15 radícula, raíz y rizoma inmersiones 11,16,18, tallo inyecciones de 17 de pulverizaciones foliares 14,17,20 y sprays de flores 19. Utilizando estos métodos, los investigadores han introducido B. bassiana en 11 plátano, frijol 7, 13 cacao, café 17, 7 de maíz, algodón 7, palmera datilera 12 de yute 21 de adormidera 20, calabaza 7, pino radiata 18, sorgo 14, tomate y trigo 7 7. La evidencia reciente sugiere que endofítica B. bassiana tiene el potencial de proteger a las plantas no sólo de las plagas de artrópodos 5-7,22-27, sino también de algunos patógenos de plantas 9. El frijol común (Phaseolus vulgaris) se encuentra entre los cultivos más vulnerables a las plagasplagas y enfermedades. Puede ser afectado por más de 400 plagas y patógenos 200, cuyo ataque se cree que es el factor más limitante bean producción entre las regiones 28. En consecuencia, la alubia común puede ser un modelo de cultivo excelente para examinar todo el espectro de control biológico endofítica por B. bassiana. Como primer paso en esta dirección, este artículo describe aplicaciones foliares y de suelo pociones como métodos de inoculación para introducir B.bassiana como endofito en el frijol común.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>Nombre del reactivo/material Número de</td><td>catálogo</td><td></td>de <td>la empresa</td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Agar noble</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td>Placa</tr> de <tr><td>Petri (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Agar patata dextrosa</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Lejía regular (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Membrillo triple (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica DM LB</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: hacia control biológico endofítico

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno con la capacidad de colonizar plantas endofíticamente. Como B. endófito, bassiana puede jugar un papel en la protección de plantas de herbivoría y enfermedad. Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para establecer B. bassiana endofíticamente en el frijol común (Phaseolus vulgaris), en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica. Las plantas se cultivan a partir de semillas esterilizadas superficialmente durante dos semanas antes de recibir una B. tratamiento de bassiana 10 8 conidios / ml (o agua) aplicados como una pulverización foliar o tratamiento del suelo. Dos semanas más tarde, las plantas se cosecharon y sus hojas, tallos y raíces se muestrean para evaluar la colonización de hongos endofíticos. Para esto, las muestras son individualmente esterilizadas en superficie, se cortaron en secciones múltiples, y se incubaron en medios de agar de dextrosa de patata durante 20 días. Los medios de comunicación se inspecciona cada 2-3 días para observar el crecimiento de hongos comoasociado con partes de la instalación y registrar la ocurrencia de B. bassiana para estimar el alcance de su colonización endofítica. Los análisis de éxito inoculación comparar la ocurrencia de B. bassiana dentro de una parte de planta dada (es decir, hojas, tallos o raíces) a través de tratamientos y controles. Además del método de inoculación, el resultado específico del experimento puede depender de las especies de cultivo o variedad, las especies de hongos entomopatógenos cepa o aislado utilizada, y las condiciones de crecimiento de la planta.

B. bassiana fue capaz de colonizar endofíticamente-p vulgaris en respuesta a los tratamientos de inoculación demostrados (Figura 1). Ambas aplicaciones foliares y de suelo pociones resultado de la colonización endofítica por B. bassiana en más del 80% de las plantas tratadas (Figura 2). Sin embargo, el alcance de la colonización depende de la parte de la planta evaluada y el método de inoculación utilizado. Hojas respondido mejor a las inoculaciones por pulverización. Raíces, por otra parte, respondieron sólo a empapar inoculaciones. Finalmente, tallos respondieron de manera similar a los dos métodos de inoculación. B. bassiana no se detectó en ninguna de las secciones de control de planta. Independientemente de los tratamientos, distintos de los endofitos B. bassiana creció de 15% de las secciones de la planta evaluados, pero fueron disecados de las placas de los medios de comunicación antes de que pudieran invadir secciones vecinas e influir en los resultados. Las plantas de tratamiento y de control eran visiblemente indistinguible dos semanas después de inoculaciones. No se detectaron diferencias en su peso en seco y en su altura. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Los resultados representativos de los tratamientos de inoculación sobre la colonización endofítica de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Por Beauveria bassiana. Arriba izquierda: control de placas sin crecimiento. Arriba a la derecha: hongos endófitos de una sección de la planta contaminando toda la placa. Abajo a la izquierda: B. bassiana que crece a partir de dos secciones de la planta. Abajo a la derecha: Endofítico B. bassiana conidios y conidióforos como se ve en el microscopio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Efecto de los tratamientos de inoculación sobre la colonización endofítica de bean plantas (Phaseolus vulgaris cv. Calima) por Beauveria bassiana, dos semanas después de la inoculación con la cepa GHA. colonización por ciento representa el número de secciones de la planta colonizados dividido por el número de secciones cultivadas.

Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo entomopatógeno<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Como endofito en el frijol común (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), Como preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica.

Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Hola. Mi nombre es Ush Parsa y soy entomólogo en SEA del Centro Internacional de Agricultura Tropical. Yo soy ViiV Artiz, también del Centro Internacional de Agricultura Tropical, y soy Fernando Vega del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El objetivo general de este video es demostrar cómo facilitar y verificar el establecimiento de un hongo como patógeno.Como endófito, es común en la naturaleza encontrar un insecto o un ácaro infectado con un hongo patógeno, y existe una larga historia en el uso de estos hongos entomopatógenos como plaguicidas biológicos. Más recientemente, se ha encontrado en ocasiones que los hongos entomopatógenos infectan plantas, pero sin producir síntomas aparentes de su presencia. Este descubrimiento indica su posible uso como endófitos protectores contra plagas agrícolas.Para explorar esta posibilidad, primero es esencial desarrollar un método de inoculación que establezca de manera confiable un patógeno fúngico como un endófito en un cultivo objetivo. B. bassiana es uno de los patógenos fungicos más estudiados, y está fácilmente disponible comercialmente como un plaguicida. Este hongo ha sido detectado como un endófito en muchas especies vegetales, incluyendo plátanos, café y nuez moscada.Recientes evidencias sugirieron que B. bassiana tiene el potencial de proteger a las plantas no solo contra plagas de artrópodos, sino también contra algunos patógenos vegetales. Los mecanismos que explican esta protección de amplio espectro son poco comprendidos. Aún en el área de la válvula tic, podría tener potencial para cultivos que carecen de resistencia genética frente a una plaga o un patógeno, pero para cultivos que típicamente sufren ataques simultáneos de múltiples enemigos, el caso común de fas vulgaris es un ejemplo destacado.Puede verse afectado por más de 400 plagas y 200 patógenos, cuyo ataque se considera el factor más limitante para la producción de frijol en diversas regiones. Por esta razón, creemos que el frijol común podría ser un cultivo adecuado para examinar el potencial protector de Endo bbar. Como primer paso en esta dirección, Arvid demuestra la eficacia de los pulverizadores foliares y los riegos al suelo como métodos de inoculación para establecer Bana como un endófito.Las semillas de frijol común de la variedad TOMA se esterilizan superficialmente mediante una inmersión de dos minutos en hipoclorito de sodio al 0,5 %, seguida de una inmersión de dos minutos en etanol al 70 % y tres lavados con agua destilada estéril para garantizar el éxito de la esterilización. Una muestra de cien microlitros del agua de lavado se siembra en una placa de Petri de 100 milímetros con medio PDA y se incuba a oscuras durante 10 días a 25 grados Celsius. El experimento debe interrumpirse y reiniciarse si se observa crecimiento en estos controles.Las semillas se siembran en grupos de tres en macetas de 11,5 centímetros de ancho, que contienen una mezcla de suelo y arena esterilizada por vapor en una proporción de dos a uno. Las plantas se cultivan bajo condiciones controladas a 25 grados Celsius, 50 % de humedad relativa y un fotoperíodo de 12 horas con una intensidad luminosa de 9.200 lux una semana después de la germinación. Las plantas se aclaran dejando una por maceta para asegurar vigor y eliminar la competencia.Se riegan según sea necesario cada dos o tres días y se fertilizan a los 10 y 20 días posteriores a la siembra con una solución acuosa de fertilizante NPK de seis gramos por litro. Para garantizar la uniformidad genética de nuestros hongos, los aislamientos deben obtenerse a partir de cultivos de esporas individuales. Si la fuente del hongo es un insecto con micosis, se lleva el espécimen a la cabina de flujo laminar y se utiliza un asa de inoculación para transferir una pequeña muestra del hongo esporulado DYS a un medio PDA.Pueden ser necesarias transferencias posteriores a nuevas placas de medio para eliminar contaminantes una vez que el hongo objetivo crece y esporula en un cultivo limpio. La pequeña muestra de kedia se suspende en un mililitro de una solución acuosa al 0,1 % de Triton X-100 y se mezcla mediante vortex; Triton X-100 es un agente tensoactivo que reduce la tensión superficial del agua y permite que la kedia se disperse. Se extiende un alícuota de 100 microlitros de esta suspensión sobre una placa de Petri de 100 milímetros que contiene una capa delgada de agar noble al 2,5 %, lo que permitirá la visualización de la kedia mediante estereoscopio.La placa se incuba a temperatura ambiente durante 24 horas en la oscuridad, tras lo cual se transfiere un solo medio de germinación de penicilio a la placa de medio con PDA y se deja crecer durante tres a cuatro semanas hasta que cubra completamente la placa de medio y los esporas. Este método proporciona un cultivo puro del hongo para experimentos posteriores. Para esta demostración, utilizamos un cultivo puro de Bavaria bassiana, una cepa GH HA, obtenida del producto comercial Microt.El inóculo se prepara bajo condiciones estériles. En una cabina de flujo laminar, utilizamos una espátula estéril para raspar aproximadamente un gramo del crecimiento fúngico de la superficie del medio y lo suspendemos en 10 mililitros de Triton X al 0,1 % estéril. La suspensión se agita en vórtex durante un minuto y se filtra a través de una gasa estéril para separar la canadia de la Hy-Vee. Este paso produce una suspensión densa que debe ajustarse a una concentración final de 10⁸ kedia por mililitro para las inoculaciones.Primero, se estima la concentración del stock mediante una dilución seriada que facilita el conteo de kedia. En un hemocitómetro, 100 microlitros del stock se diluyen en 900 microlitros de Triton X al 0,1 % y se mezclan en vórtex, obteniendo una dilución uno en 10. El procedimiento se repite en serie tres veces adicionales para obtener una dilución uno en 10 000.Los kedia estarán presentes en números extremadamente altos en la primera dilución y en números bajos que se pueden contar fácilmente en la última dilución. Cada una de las dos cámaras del citómetro Hema se carga con 10 microlitros de la dilución uno en 10.000 y se coloca bajo un microscopio para contar los kedia. El área graduada del citómetro Hema consta de nueve cuadrados grandes, cada uno con una capacidad de 100 nanolitros o 0,0001 mililitros, respectivamente.Para estimar la concentración de ED en la muestra, contamos y promediamos las ED en los cuatro cuadros grandes de las esquinas de cada cámara y dividimos ese promedio por 0,0001. Multiplicando esta concentración por nuestro factor de dilución de 10 000 se obtiene la concentración del stock; ahora se puede calcular el volumen final al que debe ajustarse el stock. Para obtener la inócula de 10³⁸ ED por mililitro, aplicamos la fórmula.El volumen final equivale al volumen del stock multiplicado por la concentración del stock dividido entre la concentración final. En nuestra demostración, es necesario ajustar el stock a un volumen final de 195,5 mililitros para obtener la concentración deseada. Antes de utilizar el inóculo, es importante realizar una prueba de germinación para evaluar la viabilidad del conducto.Para esta prueba, colocamos 100 microlitros de la dilución uno en 10.000 en una placa de Petri de 100 milímetros con 2,5 % de huevo noble o medio de cultivo. La muestra se extiende sobre la superficie del medio con una varilla de vidrio estéril y se incuba en la oscuridad a 25 grados Celsius durante 24 horas. La viabilidad se evalúa bajo el microscopio estimando el porcentaje de quistes con tubo germinativo en crecimiento.Para tres muestras aleatorias de 100 canadienses, la suspensión canadiense solo puede utilizarse para inóculos si el porcentaje promedio de germinación es superior al 90 %. En esta demostración, obtenemos una germinación promedio del 97 %. Demostraremos dos métodos de inóculo: pulverización foliar y riego al suelo, ambos aplicados cuando las plantas alcanzan su primera etapa de hoja verdadera. Aproximadamente 14 días después de la siembra, se realiza el método de pulverización foliar con un atomizador manual, dirigiendo la suspensión hacia la superficie adaxial o superior de las hojas hasta que queden saturadas. La parte superior de cada maceta se cubre con papel de aluminio para evitar que el inóculo escurra hacia el suelo. Después de la pulverización, cada planta se cubre con una bolsa de plástico durante 24 horas para mantener altos niveles de humedad, lo que facilita la invasión fúngica.El método de inoculación por riego al suelo se realiza a capacidad de agua del suelo. Aproximadamente 24 horas después de regar las plantas hasta saturación del suelo, se aplican 10 mililitros de una suspensión microbiana a la superficie del suelo. En la base de la planta, el control recibe Triton X al 0,1 % esterilizado, aplicado de la misma manera que en sus tratamientos correspondientes.Las plantas se devuelven a las cámaras de crecimiento y se organizan según un diseño de bloques completos aleatorizados con tres réplicas por tratamiento. Evaluamos el establecimiento dos semanas después de las inoculaciones, un bloque a la vez. Las plantas se cosechan cuidadosamente y se lavan individualmente con agua corriente del grifo de cada planta.Tomamos dos folíolos, dos fragmentos de raíz y dos fragmentos de tallo; los folíolos se seleccionan aleatoriamente del primer par de hojas verdaderas de la planta y se recortan en forma cuadrada. Se obtienen muestras de aproximadamente tres centímetros de longitud del tramo medio del tallo y de cerca de la superficie del suelo. Se obtienen muestras de la raíz principal de longitud similar del tramo medio de la raíz y a un centímetro por detrás del ápice radicular.Cada muestra se esteriliza individualmente en la superficie en un flujo laminar con hipoclorito de sodio al 0,5 % durante dos minutos, seguido de etanol al 70 % durante dos minutos, y se enjuaga tres veces con agua destilada estéril antes de dejarla secar. Sobre papel toalla estéril, la muestra esterilizada se disecciona cuidadosamente para descartar su borde externo, donde los endófitos podrían haber sido eliminados debido al contacto con los desinfectantes. La muestra recortada se corta entonces en secciones más pequeñas de aproximadamente seis por seis milímetros para las hojas y de seis milímetros de largo para tallos y raíces.Los sectores se siembran en placas de Petri de 60 milímetros que contienen PDA suplementado con los antibióticos tetraciclina, estreptomicina y penicilina a dos miligramos por litro cada uno. Finalmente, las placas se sellan con parafina e incuban en la oscuridad a 25 grados Celsius. El agua de enjuague se cambia después de procesar cada bloque, pero antes de sembrar una muestra de 100 microlitros en una placa de Petri de 100 milímetros con medio PDA e incubar durante 10 días a 25 grados Celsius para determinar si la serialización fue exitosa.Si se observa algún crecimiento en este control, se descarta el bloque y no se considera para el análisis. Las placas se inspeccionan cada dos o tres días durante 20 días para observar y registrar el crecimiento fúngico. Las secciones vegetales colonizadas se excisan y transfieren individualmente a nuevas placas de medio para evitar la contaminación de secciones vecinas.El crecimiento de B. bassiana se registra en función de las hifas blancas densas características que se vuelven crema o amarillo pálido en los bordes. En caso de duda, la muestra se monta en una gota de agua sobre un microscopio de luz y se examina en busca de la escaneadura global y la forma en zigzag de la fuerza kedia, características de la especie, el mismo día en que se evalúa la colonización. También estimamos el impacto de nuestros tratamientos sobre el crecimiento de las plantas.Primero medimos la altura de la planta desde la base de la planta hasta la parte superior del punto de crecimiento. Luego desenterramos y lavamos cuidadosamente las plantas con agua del grifo y las dejamos secar a 45 grados Celsius durante tres días para medir su peso seco. Para esta demostración, realizamos el experimento completo dos veces para obtener resultados representativos.Ambos métodos de inoculación resultaron en la fisiculación por Bana en más del 80 % de las plantas tratadas. Sin embargo, el grado de colonización dependió de la parte de la planta evaluada y del método de inoculación utilizado. Las puntas respondieron mejor.Las inoculaciones por aspersión en las raíces, por otro lado, solo respondieron a las inoculaciones por riego. Finalmente, los tallos respondieron de manera similar a ambos métodos de inoculación. Bana no se detectó en ninguna de las secciones controladas de la planta independientemente del tratamiento; los endófitos distintos a Bana representaron el 15 % de las secciones evaluadas de la planta, pero fueron separados de las placas de medio antes de que pudieran invadir secciones adyacentes e influir en nuestros resultados.Las plantas tratadas y las controles eran visualmente indistinguibles dos semanas después de las inoculaciones, y no se detectaron diferencias significativas en su peso seco ni en su altura. Muchos factores pueden influir en un resultado específico de un experimento para establecer un patógeno endófito como un efecto final. Como demuestra este video, el método de inoculación es uno de ellos. Otros factores biológicos con los que se puede experimentar incluyen la especie o el cultivar del cultivo seleccionado y la elección de la especie o aislado del patógeno OMA. Otros factores que conviene manipular incluyen la concentración del inóculo, la edad de la planta durante las inoculaciones y las condiciones de crecimiento de la planta.El objetivo final de estos experimentos debería ser desarrollar un tratamiento eficaz que proporcione resistencia sistémica duradera frente a INE o enfermedades. Cuando esté listo para evaluar la resistencia mediada por endófitos, le recomendamos ver un video que caracteriza los mecanismos de resistencia herbácea, también publicado en el Journal of Visualized Experiments. Tenga en cuenta que los endófitos son muy comunes en las plantas y es probable que influyan en su capacidad para establecer y detectar persistentemente un hongo patógeno objetivo como un endófito.Esperamos que esta demostración les resulte útil. Buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Aquí se presentan las diferentes etapas del desarrollo basado en el conocimiento de un micoinsecticida eficaz, incluyendo el aislamiento, la identificación, el cribado y la selección del hongo entomopatógeno "mejor ajustado", Metarhizium anisopliae , para el control de plagas de insectos en la agricultura .

Desarrollo de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como Mycoinsecticide: Del aislamiento al funcionamiento del campo

Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

Los hongos entomopatógenos han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. En este estudio, la producción en masa de un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos se llevó a cabo con éxito utilizando productos de granos agrícolas.

Producción en masa de hongos entomopatógenos, Metarhizium robertsii y Metarhizium pinghaense, para aplicación comercial contra plagas de insectos

Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).

Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Debido a la opacidad del suelo, las interacciones entre sus microbios constituyentes no se pueden visualizar fácilmente con resolución celular. Aquí, se presentan dos herramientas microfluídicas, que ofrecen nuevas oportunidades para investigar las interacciones fúngico-microbianas. Los dispositivos son versátiles y fáciles de usar, lo que permite un alto control espaciotemporal e imágenes de alta resolución a nivel celular.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Este protocolo presenta un sistema optimizado de bioensayo de hojas sueltas para evaluar la efectividad de hongos entomopatógenos (EPF) contra el pulgón de la mostaza (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecto partenogenético. El método describe el proceso de recopilación de datos durante los experimentos con placas de Petri, lo que permite a los investigadores medir de manera consistente la virulencia de EPF contra pulgones de la mostaza y otros insectos partenogenéticos.

Evaluación del efecto afidicida de hongos entomopatógenos contra insectos partenogenéticos, pulgón de la mostaza, Lipaphis erysimi (Kalt.)

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Describimos el uso de cromatografía en capa fina, ensayo de bioautografía directa y cromatografía líquida-espectrometría de masas para identificar productos naturales microbianos que muestran antagonismo contra patógenos fúngicos utilizando el patógeno Sclerotinia sclerotiorum y aislados bioplaguicidas de Bacillus como sistema modelo.

Identificación guiada por bioensayos de productos naturales para el biocontrol mediante cromatografía en capa fina-Bioautografía directa

Se estableció un protocolo de bioensayo de hojas separadas para la cría masiva de trips de chile utilizando un método modificado de hojas separadas en recipientes de vidrio que contienen agar, lo que garantiza una alta supervivencia y un desarrollo sincronizado. Este sistema permite un cribado eficiente de la virulencia de hongos entomopatógenos contra larvas de2º estadio y proporciona un suministro fiable de trips para evaluaciones de laboratorio, invernadero y campo.

Establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (Scirtothrips dorsalis Hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos

Aprende a establecer Beauveria bassiana como endófito en frijol común mediante aspersiones foliares y drench de suelo. Este método permite evaluar su potencial para el control biológico de plagas agrícolas de forma sostenible.

Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico

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